低鉀加重大鼠心肌細胞再灌注損傷的機制

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【關鍵詞】低鉀；鈉

MechanismoflowK+bufferaggravatingreperfusioninjuryinratventricularmyocytes

【Abstract】AIM:TostudytheroleofcalciumoscillationsinreoxygenationinjuryinducedbyperfusionwithalowK+bufferinisolatedratventricularmyocytes.METHODS:Thecellswerefirstlysubjectedtometabolicinhibitionandanoxiafor25min,thenreperfusedwithnormal［K+］(5.4mmol/L)orlow［K+］(3.0mmol/L)TyrodesolutionintheabsenceorpresenceofKBR7943,aselectiveinhibitorofthereversemodeNa+/Ca2+exchanger(NCX).Thechangesof［Ca2+］iweremeasuredwithspectrofluorometry,usingFura2asCa2+indicator.Thechangesincelllengthweremonitoredandexpressedasarecoveryrateofcelllengththroughtheformula(endreperfusionlength-endischemialength)/(initiallength-endischemialength)×100%,reflectingthereperfusioninjury.RESULTS:Comparedwithnormal［K+］reperfusiongroup,reperfusionwiththelow［K+］Tyrodesolutionsuppressedtherecoveryofcelllength［P<0.01,low［K+］:(24.30±6.01)%vsnormal［K+］:(54.50±6.56)%,n=6］andincreasedthetotalnumberofCa2+oscillations［P<0.01,low［K+］:(138.80±9.54)vsnormal［K+］:82.30±8.16,n=6］.However,theseeffectsinducedbylowK+reperfusionweresignificantlyattenuatedinthepresenceof10μmol/LKBR7943［P<0.01vslow［K+］withoutKBR7943,n=6;Ca2+oscillations:27.40±6.76,recoveryofcelllength:(58.90±7.30)%,respectively］.CONCLUSION:Reperfusionwithlow［K+］bufferincreasesreversemodeNCXactivities,whichresultsinanincreasedcalciumoscillations,thusaggravatingcardiacinjury.

【Keywords】potassiumdeficiency;NCX;ventricularmyocyte;calcium/metabolism

【摘要】目的：觀察低鉀灌流液對大鼠心肌細胞再灌注時鈣震蕩的影響并探討其作用機制.方法：Ca2+熒光指示劑Fura2標記心肌細胞，在代謝抑制并低氧25min后，改用低鉀臺氏液（［K+］=3.0mmol/L）灌流，記錄細胞鈣震蕩的變化.以（再灌注末期細胞長度－缺血末期細胞長度）／（缺血前細胞長度－缺血末期細胞長度）×100%反映再灌注后細胞長度的恢復狀況.結果：與含正常鉀濃度的灌流液對照組（［K+］=5.4mmol/L）相比，在再灌注10min內，低鉀灌流液組出現鈣震蕩的次數顯著增加(P<0.01，低K+組：138.80±9.54vs對照組：82.30±8.16，n=6)，心肌細胞長度的恢復顯著被抑制［P<0.01，低K+組：(24.30±6.01)%vs對照組：(54.50±6.56)%，n=6］；再灌注期間給予鈉鈣交換體反向交換模式抑制劑KBR7943，可顯著抑制低鉀溶液對鈣震蕩和細胞長度的影響［P<0.01vs低K+組，n=6；鈣震蕩：27.40±6.76和細胞長度恢復：(58.90±7.30)%］.結論：低鉀再灌注液通過增強反向鈉鈣交換體活性加重鈣震蕩，進而引發心肌損傷.

【關鍵詞】低鉀；鈉鈣交換體；鈣震蕩；心肌細胞

細胞內鈣（［Ca2+］i）超載是缺血心肌在再灌注過程中細胞凋亡、壞死、以及心功能降低的重要原因［1］.鈉鈣交換體（sodiumcalciumexchanger，NCX）是參與維持心肌鈣穩態的重要轉運體.研究發現，在缺血／再灌注早期激活NCX反向交換模式（Ca2+進入細胞），將促發心肌［Ca2+］i超載，導致心肌損傷［2-3］.目前，Zhang等［4］采用膜片鉗技術觀察到，［K+］o升高可抑制NCX反向交換電流，而［K+］o降低則起促進作用.如果再灌注早期［K+］o降低（［K+］o丟失），可能會通過促發NCX反向交換引起心肌［Ca2+］i超載，從而加重心肌損傷.本實驗采用雙激發熒光光電倍增系統檢測細胞［Ca2+］i的方法，觀察低鉀灌流液對缺血后再灌注早期心肌［Ca2+］i震蕩的影響，旨在探討其可能的機制.

1材料和方法

1.1材料正常SD雄性大鼠（200~250g）15只由第四軍醫大學實驗動物中心提供.KBR7943英國Tocris公司；HEPES，I型膠原酶，BSA，谷氨酸鉀，K2EGTA，Taurine，Fura2/AM和脫氧葡萄糖（Deoxyglucose）均為美國Sigma公司產品，其余試劑均為國產分析純；雙激發熒光光電倍增系統為美國IonOptix公司產品.正常K+濃度臺氏液（mmol/L，Standard）：NaCl140，KCl4.2，MgCl21.0，KH2PO41.2，CaCl21.8，HEPES10，葡萄糖10，用NaOH調pH至7.4；低濃度K+臺氏液（mmol/L，LowK+）：KCl1.8，KH2PO41.2，其余成分與正常K+濃度臺氏液相同.KB液（mmol/L）：Kglutamate120，KCl10，KH2PO410，MgSO41.8，K2EGTA0.5，牛磺酸10，HEPES10，glucose20，用KOH調pH至7.2.模擬缺血溶液：正常臺氏液中去除glucose，并添加10mmol/L脫氧葡萄糖，并持續充以純N2，pH=6.4.

1.2方法

1.2.1心肌細胞分離按文獻［5］的方法制備心室肌單細胞.步驟：SD雄性大鼠斷頭處死，迅速摘取心臟并固定于Langendorff灌流系統，在37℃和通氧條件下依次用下述溶液灌流.①含1.8mmol/LCa2+臺氏溶液5min；②無Ca2+臺氏溶液15~20min；③含0.5g/LI型膠原酶以及1g/LBSA的無Ca2+臺氏溶液30~40min.灌流結束后，取左心室心肌組織，將其置于KB溶液中剪碎、吹打并過濾，獲得單個心肌細胞，KB液中保存1h后，將心肌細胞置于含10g/LBSA1.8mmol/LCa2+臺氏溶液中備用.

1.2.2Fura2/AM負載［6］將心肌細胞混懸液置于離心管內，加入Fura2/AM（終濃度為1μmol/L），于室溫負載30min，不斷振搖，然后用含10g/LBSA1.8mmol/LCa2+臺氏液洗滌數次，洗去胞外殘留的Fura2/AM，靜置30min備用.

1.2.3細胞長度和心肌細胞［Ca2+］i測定［5］取負載好Fura2/AM的細胞懸液加于0.5mL灌流槽中，待細胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無自發性收縮的心肌細胞，在室溫下進行實驗.溶液灌流速度保持在1mL/min.通過攝像系統觀察細胞長度的變化并儲存于計算機，以便后續分析.我們以（再灌注末期細胞長度－缺血末期細胞長度）／（缺血前細胞長度－缺血末期細胞長度）×100%反映再灌注后心肌細胞長度恢復率.Ca2+熒光信號的檢測采用雙激發熒光光電倍增系統.75W紫外氙光燈發射的光通過340nm或380nm的濾光片到達心肌細胞，細胞內與游離Ca2+結合的熒光物質被激發，其發射光在510nm處被檢測并通過光電倍增管記錄.細胞相繼迅速被340nm和380nm激發光照射并交替掃描，細胞內游離Ca2+濃度的改變由上述兩種波長熒光強度的比率所反映.

1.2.4缺血后再灌注處理用模擬缺血液持續灌流25min，然后進行不同處理15min.對照組：正常濃度K+（5.4mmol/L）的臺氏液灌流；低K+灌流液組(低K+組)：低K+（3.0mmol/L）的臺氏液灌流；KBR+低K+組：含10μmol/LKBR7943的低K+（3.0mmol/L）臺氏液灌流.每組分別觀察6個細胞.在整個實驗過程中，進行連續心肌細胞［Ca2+］i測定，觀察細胞［Ca2+］i的變化.

統計學處理：實驗數據以x±s的形式表示.用SPSS11.0統計軟件進行分析，統計分析采用方差分析，多重比較采用LSDt檢驗，檢驗標準以P<0.05為差異有統計學意義.

2結果

2.1低K+臺氏液再灌注后心肌細胞鈣震蕩的變化以及反向NCX抑制劑的影響細胞在經受25min代謝抑制和無氧后，分別用含正常K+濃度的對照組及低K+臺氏液灌流15min，在此期間記錄到的心肌細胞［Ca2+］i的變化圖.對照組的鈣震蕩的總數為82.3±8.16，而低K+臺氏液灌流時出現鈣震蕩的總數顯著增加，為138.8±9.54（P<0.01）.再灌注期加入10μmol/LKBR7943后，低K+臺氏液引起的鈣震蕩數目顯著減少，為27.4±6.76（P<0.01，圖1）.

2.2低K+臺氏液再灌注后心肌細胞長度恢復的變化以及反向NCX抑制劑的影響代謝抑制和無氧處理末期，桿狀心肌細胞長度較缺血前縮短(40±3)%.在低K+臺氏液再灌注后，細胞長度的恢復顯著低于對照組，兩組的長度恢復分別為(54.50±6.56)%和(24.30±6.01)%（P<0.01，n=6，圖2）.再灌注時加入10μmol/L反向NCX抑制劑KBR7943后，低K+臺氏液對細胞長度的影響顯著減弱，細胞長度恢復（58.9±7.3）%（P<0.01vs低K+組；n=6，圖2）.

3討論

本實驗首次觀察到：①缺血后應用低K+液灌流，細胞發生鈣震蕩的頻率顯著增加，與細胞長度恢復呈反相關系；②加入反向NCX抑制劑后，低K+灌流液對細胞鈣震蕩和細胞長度的影響明顯受到抑制.上述結果表明，缺血后低K+灌流液通過激活反向NCX活性，加劇［Ca2+］i超載，從而加重心肌損傷.

實驗顯示，改變灌流液中鉀離子濃度將影響細胞鈣震蕩的頻率.由于NCX是參與鈣震蕩形成的重要分子，上述結果提示細胞外鉀離子濃度（［K+］o）可能通過調節NCX的交換活性影響鈣震蕩的形成.實驗中我們應用反向NCX抑制劑KBR7943，發現低［K+］o對鈣震蕩的增強作用明顯減弱，表明改變［K+］o能影響NCX的活性.這與Zhang等［4］人的研究結果相吻合.目前認為，再灌注早期鈣震蕩的形成是由于此時舒張期［Ca2+］i明顯升高，大量Ca2+在胞質和肌漿網之間循環造成的.已經證實，通過抑制NCX反向交換模式減少Ca2+進入細胞將減少產生鈣震蕩的發生，從而保護心肌細胞［2］.本實驗發現，低［K+］o顯著增加大鼠左心室肌細胞鈣震蕩的頻率，抑制心肌細胞長度的恢復，加重心肌的損傷，而NCX反向交換模式抑制劑KBR7943可以明顯減弱［K+］o的損傷作用，說明［K+］o的損傷作用與增強NCX反向交換活性有關.

然而［K+］o的這種作用是通過何種機制目前仍不清楚.已知NCX交換方向取決于膜兩側Na+和Ca2+電化學梯度以及細胞膜電位［7-9］.改變［K+］o將有可能通過影響上述因素而間接影響NCX的交換模式.因此低K+再灌液是直接還是間接調控NCX還有待進一步研究.

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