三七總皂苷氧化鋁高效液相法論文
時間：2022-07-22 05:36:00
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摘要】目的研究氧化鋁柱層析精制三七總皂苷工藝。方法采用HPLC法測定三七總皂苷的含量，考察洗脫劑的濃度、洗脫劑的用量和吸附劑用量對工藝的影響。結(jié)果確定最佳精制工藝為：洗脫劑的濃度為55%乙醇，洗脫劑的用量為10倍吸附劑的用量，吸附劑用量為5倍三七總皂苷的用量。結(jié)論通過氧化鋁柱層析精制后，三七總皂苷的收率大于70%，含量大于80%，說明此精制工藝是可行的。
三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖，三七總皂苷是中藥三七的有效部位，主要含有三七皂苷R1，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1等達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物。現(xiàn)代藥理研究證明：三七總皂苷具有多方面的生物活性，主要表現(xiàn)在擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠脈血流量、改善心肌代謝、抗自由基、抗凝、鈣拮抗等方面。
目前三七總皂苷的富集與純化一般采用大孔吸附樹脂來完成[4]，純化后三七總皂苷的含量達(dá)到60%以上。為了提高藥物的安全性和有效性，提高其成藥原料藥的純度。本實(shí)驗(yàn)擬采用氧化鋁柱層析對三七總皂苷的純化物進(jìn)行精制，并對工藝進(jìn)行了考察，為進(jìn)一步的制劑學(xué)研究打下基礎(chǔ)。
1儀器與試藥
1.1儀器與設(shè)備
RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸器（上海亞榮生化儀器廠）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；JA-1003型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）；美國Tsp高效液相色譜儀；TspP-2000泵、TspUV-1000UV-VIS檢測器；TspPC1000色譜工作站；色譜柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm,大連依利特科學(xué)儀器有限公司）。
1.2材料與試劑
三七總皂苷提取物（云南玉溪天然藥物有限公司）；三七總皂苷對照品：三七皂苷R1（0745-200008）、人參皂苷Rg1（0703-200015）、人參皂苷Rb1（0704-200115）對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件
色譜柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm）；流動相：A為乙腈，B為水；流速：1.0mL·min-1；采用梯度洗脫法，0～8分鐘（26:74），8:10～40:40分鐘（34:66）；檢測波長203nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量20μL。
2.2線性范圍關(guān)系的考察
分別精密稱取三七總皂苷對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1各約6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對照品溶液各注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以峰面積(A)對進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1回歸方程分別為：A=327127.8W－681.2（r=0.9991）；A=406964.1W+787.9（r=0.9991）；A=262563.9W－5498.7（r=0.9996），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂Rb1分別在進(jìn)樣量0.2981～0.6956μg、1.2768～2.9792μg和1.1539～2.6925μg范圍內(nèi)時，峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系。
2.3精密度試驗(yàn)
取含量測定項(xiàng)下對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣六次，記錄色譜圖，量取峰面積，計(jì)算平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的峰面積平均值分別為151792、802039.7和476940.7，RSD分別為0.81%、1.73%和1.62%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。
2.4供試品溶液的制備
取上柱流出液濃縮至干，精密稱定干粉一定量，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)溶至10mL量瓶，濾過。精密量取續(xù)濾液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.5工藝參數(shù)的考察
2.5.1洗脫劑濃度的考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉(zhuǎn)移至氧化鋁柱（中性氧化鋁50g，內(nèi)徑4cm，干法裝柱），然后分別用35%、55%和75%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總皂苷含量和收率。
從以上結(jié)果可知，當(dāng)用75%乙醇洗脫時，總皂苷含量最高，但收率太低，而用55%乙醇洗脫時雖然收率比用35%乙醇洗脫時略低，但總皂苷含量高6%左右，因此，洗脫劑確定為55%乙醇。
2.5.2洗脫劑用量考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉(zhuǎn)移至氧化鋁柱（中性氧化鋁50g，內(nèi)徑4cm，干法裝柱），然后用55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總苷含量和收率。
從以上結(jié)果可知，隨著洗脫劑用量的增加，得到總皂苷的含量逐漸下降，考慮收率，以10倍量55%的乙醇洗脫比較合適。
2.5.3吸附劑用量考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉(zhuǎn)移至氧化鋁柱（柱1：中性氧化鋁25g，內(nèi)徑2cm；柱2：中性氧化鋁50g，內(nèi)徑4cm；柱3：中性氧化鋁100g，內(nèi)徑5cm），然后用10倍量55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總苷含量和收率。
從以上結(jié)果可知，隨著吸附劑氧化鋁用量的增加，收率逐漸降低，而含量呈上升趨勢，氧化鋁用量為5倍與10倍相比較，前者雖然總皂苷含量略低，但已經(jīng)大于80%，而且收率較高，因此吸附劑氧化鋁的用量確定為5倍。
2.6中試驗(yàn)證結(jié)果
取三七總皂苷原料3份，精密稱取質(zhì)量分別為44.4g，42.8g和47.9g，分別用50%乙醇適量溶解，分別轉(zhuǎn)移至氧化鋁柱，中性氧化鋁用量為三七總皂苷的5倍，然后用10倍量55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，在60℃以下減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC測定方法，分別測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量。
從以上三批中試結(jié)果可知，按選定的精制工藝可以制備總皂苷含量大于80%的三七總皂苷原料，且收率大于70%，說明此精制工藝是可行的。
3結(jié)論
3.1氧化鋁柱層析精制三七總皂苷的最佳工藝為：洗脫劑的濃度為55%乙醇，洗脫劑的用量為10倍量吸附劑的用量，吸附劑用量為5倍三七總皂苷的用量。
3.2本實(shí)驗(yàn)提出了一種新的三七總皂苷的精制方法—氧化鋁柱層析，具有分離效果好、工藝簡單、投資少、處理量較大等優(yōu)點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，大孔吸附樹脂法具有選擇性好、吸附容量大、安全無毒、再生容易等優(yōu)點(diǎn)，但由于應(yīng)用時間相對較短，還存在著一些問題，因此，在純化中藥有效成分的工藝過程中，兩種純化方法可以互相結(jié)合，取長補(bǔ)短，共同促進(jìn)中藥制劑的不斷發(fā)展。
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