瘢痕成纖維細胞鈣網蛋白研究論文

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目的觀察鈣網蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮膚成纖維細胞內的表達情況。方法采用免疫細胞化學染色和原位ELISA技術對體外培養的瘢痕及正常皮膚成纖維細胞進行CRT分布定位及表達水平研究。結果瘢痕和正常皮膚成纖維細胞在處于增殖生長狀態時，胞漿及核內均有不同程度的CRT表達，其中瘢痕成纖維細胞表達CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明顯高于正常皮膚成纖維細胞水平(A:1.43±0.12),差異有非常顯著意義(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮膚成纖維細胞內則均無CRT表達。結論瘢痕成纖維細胞內CRT的豐富表達對促進細胞遷移、信號傳遞及鈣存儲等方面均有著積極作用。

Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedinHSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionInHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2+sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion.

【Keywords】HypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression

增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作為創傷及外科手術后常見且十分棘手的皮膚組織疾病，瘢痕組織內成纖維細胞異常活化和細胞外間質過度沉積既是HS的重要組織學特征，也是HS發生、發展的物質基礎。鈣網蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作為一種存在于非肌細胞內質網上的主要鈣結合蛋白得以認識的［1］，近幾年的研究發現：除具有鈣離子儲藏作用外，CRT在參與并調節眾多細胞生物學活性功能上有著積極影響［2-5］，同時它還作為自身抗原在某些免疫性疾病的發病機制中有著極其重要的價值［6］。我們通過CRT抗體并利用原位ELISA及免疫細胞化學染色技術檢測瘢痕成纖維細胞體外表達CRT水平，輔以正常皮膚成纖維細胞作對照，探討CRT在瘢痕成纖維細胞發揮異常生物學活性功能中的作用。

1材料與方法

1.1組織標本

增生性瘢痕及正常皮膚組織標本均取自住院病人，年齡17～40歲。患者在取標本前無長時間外用各種防治增生性瘢痕藥物史，不伴腫瘤及其他嚴重疾患；瘢痕組織生長時間均在6～9個月之間。

1.2主要試劑及物品準備

羊抗CRT抗體：Michalak博士惠贈。辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。細胞培養基：DMEM添加10%小牛血清(上海華美生物技術有限公司)。96孔塑料培養板及100mm培養皿(丹麥Nunc公司)。

1.3成纖維細胞培養

手術切取增生性瘢痕及正常皮膚組織，去皮下脂肪，0.01%新潔爾滅浸洗10min，PBS洗3次，用組織剪將組織剪成細小碎塊并接種于培養皿內，加少量10%小牛血清的DMEM培養基，37℃5%CO2靜止培養，3天后補充少量培養劑，隔2天換液，見有細胞從組織塊爬出生長后每天換液，傳代。

1.4CRT免疫細胞化學染色

體外培養的成纖維細胞去培養基后，PBS輕洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗體37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反應1h，DAB顯色；顯微鏡下觀察顯色信號。

1.5CRT原位ELISA檢測［7］

選擇第5代培養細胞為實驗對象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，調整細胞濃度至106/ml，每孔100μl接種于96孔培養板內。培養16h后，去培養劑，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應5min，PBS洗；與0.1%TritonX-1004℃作用3min后，進一步分別與5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗體(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀釋的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反應；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反應。ELISAreader上讀取492nm的P值。

2結果

2.1成纖維細胞初代培養結果

在體外相同培養條件下，細小的瘢痕及正常皮膚組織塊接種后2天見有部分貼壁，培養1周后有少量的成纖維細胞從組織塊邊緣爬出，2周后細胞在組織塊周圍呈暈狀分布，此后細胞開始向外旺盛擴散增殖。顯微鏡下觀察瘢痕及正常皮膚組織來源的成纖維細胞形態，發現細胞均呈細小梭形狀，二者未見明顯差異。

2.2成纖維細胞CRT表達的免疫細胞化學染色結果

原代培養的瘢痕及正常皮膚成纖維細胞在未生長融合前，細胞內均有不同程度的CRT陽性表達；一旦細胞生長融合后，在融合區內的成纖維細胞中均未見有明顯的CRT陽性信號出現，但在融合區邊緣仍處于增殖、遷移擴散的瘢痕及正常皮膚成纖維細胞內，則仍有CRT的陽性信號分布；就二種細胞內CRT的表達信號強弱來看，瘢痕成纖維細胞內的CRT陽性信號相對較強，而正常皮膚成纖維細胞內CRT陽性信號相對較弱；另外，當瘢痕及正常皮膚成纖維細胞以較高密度傳代培養時，細胞內CRT表達在接種后16h較為明顯，而在培養24h細胞接近融合時信號較弱。轉

此外，CRT在瘢痕及正常皮膚成纖維細胞內的表達區域無明顯差異，往往在細胞漿、核膜及核內均有表達。

2.3成纖維細胞CRT表達的ELISA檢測結果

根據CRT免疫細胞化學染色結果，我們對第5代瘢痕及正常皮膚成纖維細胞(接種后培養16h)進行CRT表達的ELISA檢測，其中正常皮膚成纖維細胞組的CRT表達值為1.43±0.12(A)，瘢痕成纖維細胞組為1.97±0.15(A)，二組間差異有非常著性意義(P＜0.01)。

3討論

增生性瘢痕是傷口上皮化愈合后組織內成纖維細胞異常活化即繼續旺盛增殖并分泌大量膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外間質所造成的一種組織病理改變，有關瘢痕成纖維細胞為何異常活化一直是整形燒傷外科領域里重點探索的課題之一。轉化生長因子β1、腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1和類胰島素生長因子-1等在增生性瘢痕組織內的過度表達一直被認為是引起成纖維細胞異常活化不可忽視的因素，但越來越多實驗研究表明瘢痕成纖維細胞自身生物學特性改變是觸發其功能異常的關鍵［8］。我們通過對細胞內CRT的表達檢測，進一步發現CRT不但在瘢痕成纖維細胞內分布廣泛，而且其表達量明顯高于正常皮膚成纖維細胞內水平。

CRT作為鈣離子主要結合蛋白，早期研究認為CRT主要是通過影響細胞內鈣離子的儲存與釋放而影響細胞的一些生物學活性效應，但近幾年的研究結果表明CRT除上述作用外，它在細胞遷移擴散及細胞內相關基因表達等方面均有直接的介導和調節作用。1997年，Zhu等人［9］通過對B16細胞CRT表達的深入研究發現實細胞內的CRT分子常常與整合素粘附分子的α鏈胞內區結合并成為雙向傳導細胞內外信號的復合體；Coppolino等人［5］利用CRT缺乏而整合素表達正常的胚胎干細胞進行細胞體外遷移粘附研究，證實在正常培養條件下干細胞的遷移擴散能力很弱，而經轉染CRT基因后，細胞的遷移粘附作用顯著增強。因此，Coppolino認為細胞內CRT與整合素粘附分子直接參與細胞的信號傳導、粘附、遷移擴散等生物學活性功能。Tsai等［10］曾利用體外結締組織收縮模型發現增生性瘢痕組織來源的成纖維細胞在體外有著比正常皮膚成纖維細胞更強的遷移擴散能力，并認為其作用可能與細胞內肌動蛋白絲積聚有關。筆者在博士后研究工作階段卻發現在相同培養條件下增生性瘢痕組織來源的成纖維細胞除有著較強遷移擴散能力外，還具有高表達β1、α1、α2、α3及α4整合素粘附分子的特性［11］，從而提示瘢痕成纖維細胞的強遷移擴散能力與高表達整合素粘附分子有關；而從本實驗對CRT在瘢痕成纖維細胞內的表達情況來看，細胞內其CRT表達并不屬持續性表達，CRT的高表達期一般是在細胞的遷移擴散階段，而當細胞融合后細胞內CRT表達甚少。但就與同一時期培養的正常皮膚成纖維細胞相比，瘢痕成纖維細胞內的CRT表達則顯得更為豐富。因此，結合我們以往的研究工作結果，我們認為：瘢痕成纖維細胞異常的遷移擴散能力是細胞內豐富的CRT、整合素粘附分子表達及肌動蛋白絲積聚共同作用的結果，其中積聚的肌動蛋白絲是其異常遷移擴散的重要動力來源，而有效表達的CRT及整合素粘附分子則是細胞與細胞外間質之間遷移動力的傳遞媒介；另外，CRT的豐富表達對瘢痕成纖維細胞鈣離子的儲存、釋放及其信號傳導等也有著重要的意義。

參考文獻

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10TsaiCY,HataK,ToriiS,etal.Contractionpotencyofhypertrophicscar-derivedfibroblastsinaconnectivetissuemodel:invitroanalysisofwoundcontraction.AnnPlastSurg,1995,35:638-646.

11趙燁德，何清濂，紀徐淮，等.瘢痕成纖維細胞整合素表達實驗研究.第二軍醫大學學報，1998，19：330-332