吳茱萸研究論文

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子宮肌瘤是婦科最常見的良性腫瘤,由平滑肌纖維和結締組織組成,所以臨床上又稱子宮纖維瘤。子宮肌瘤好發于20～50歲的婦女,其中年齡＞40歲的婦女約有50%患有子宮肌瘤,但Cramer和Patel經尸體解剖(autopsy)的統計后認為子宮肌瘤的發生率高達75%［1］。

對于一個不需再生育的婦女而言,全子宮切除(totalhystectomy)是治療子宮肌瘤的方法之一,然而臺灣地區子宮切除術是否有過于泛濫的情形常受質疑。有研究指出臺灣地區子宮切除率以臺北、臺中、高雄為高。變異大多可由醫療資源分布解釋,而子宮切除年齡最高分布在40～44歲占29.9%。除癌細胞病變外,以生殖器脫垂的病變為最高,這可以由醫療不適當性解釋［2］。因而子宮切除的適當性除須由專家審視外,如果能有更多其他替代療法,也是對婦女的一種保障。

子宮肌瘤真正形成的原因,至今尚不清楚,但有不少研究認為雌激素(estrogen)與黃體素(progesterone)與子宮肌瘤的生長有密切關系,這些激素又必須透過生長因子(growthfactor)才能運作［3］，而人絨毛膜促性腺激素(human，HCG)也能調節生長。黃體素可刺激子宮肌瘤上皮生長因子(epidermalgrowhfactor)產生，造成子宮肌瘤的增生和分化。子宮肌瘤雖然是由單一的細胞突變開始,而雌激素可增加雌激素接受體(estrogenreceptor,ER)與黃體素受體(progsteronereceptor,PR)也可促進子宮肌瘤的增生。黃體素則對突變的正常子宮細胞有加速分裂和增生的作用［4］。

性腺激素釋放激素強化物(GnRHa)是經由降低GnRH接受體而使性腺分泌減少,進而使卵巢分泌雌激素和黃體素減少,而抑制子宮肌瘤生長［5］。根據國內研究,GnRHa在連續注射到12周時,達到最大的療效,大部分的子宮肌瘤會縮小為原來的一半。縮小的百分比和未結合PR濃度成反比,而和未結合ER關系不大。因此GnRHa可縮小子宮肌瘤,部分取決于子宮肌瘤上未結合性激素接受體濃度所影響［6］。

子宮肌瘤屬于中醫醫學“積聚”“瘕”范圍,瘕是泛指腹腔內的有形腫塊而言,所謂者,是指腹腔內有形的腫塊,有一定的部位,屬血病。所謂瘕者,是指腹腔內無形的氣塊,無一定的部位,屬氣病。《內經・靈樞・水脹篇》謂;“石瘕生于胞中,寒氣客于子門,子門閉塞,氣不得通,惡血當瀉不瀉,以留止,日益以大,狀如懷子,月事不以時下,皆生于女子,可導而下”。《校注婦人良方》謂“婦人腹中瘀者,由月經閉積,或產后血未盡,或風寒滯瘀,久而不消,則為積聚瘕矣”。因此中醫認為,六淫之邪,七情內傷,引起臟腑功能失調,氣血不合,以致氣滯血瘀,新血與舊血凝聚成塊,結于胞室,日益長大而成子宮肌瘤。

子宮肌瘤臨床表現為月經過多,經期延長,周期縮短,或不規則子宮出血,常會伴有不同程度的貧血。中醫認為,臟腑不合,氣滯血瘀,沖任失調是本病的主要原因,臨床上可以辨證分型治療。本病是以子宮出血為主要臨床癥狀,病久失血,而導致氣血兩虛,在治療時,除出血期以化瘀止血、平時破瘀消外,還必須結合補益氣血。對于瘕的治法,《內經》提出“堅者削之,結者散之,留者攻之,滯者導之”的原則;《女科經綸》：“善治瘕者,調其氣而破其血,消其食而豁其痰,衰其大半而止”。

漢方醫學已有數千年之歷史,而且是累積經驗的循證療法之一,由于化學藥物引起的藥害,以及食品添加物或清潔劑引起的公害等,引起人們對利用自然藥物的興趣,紛紛把目光轉向天然中藥。依據漢方的思想,絕大多數的婦女疾病是屬于體內“血”的異常,中醫所謂的“血”,不單是指血液,也包括淋巴液或激素作用。中醫對女性的生理及病理獨具慧眼,其用藥經驗可以說是數千年來累積而成。

中藥的運用是幾千年來前人智慧結晶所在,其內容相當豐富且千變萬化。從《內經》、《傷寒論》始,前人從藥物的升降浮沉,四氣五味,虛實補瀉,臟腑歸經,針對人體陰陽表里,寒熱虛實,把數百種藥物歸納,依據理論用于臨床。

本研究已建立細胞模式,以期能從天然產物中找出明確具有治療子宮肌瘤之中藥,為醫師臨床用藥提供參考,造福更多的婦女。

1實驗材料

1.1中藥材來源本項研究所測試的中藥材來自臺北南京泰生堂參藥有限公司,實驗中藥材見表1。

表1單味藥材50%酒精之萃取率略

1.2儀器(1)回轉式真空減壓濃縮機(SwitzerlandBUCHIRE111);(2)離心機Centrifuge5415C(Eppendorf);(3)冷凍干燥機(Eyela;CoolAce.CA-105);(4)微量電子天秤(Shimazu,LibrorACF-200)；(5)顯微鏡(Olympus,Tokyo)；(6)二氧化碳培養箱(EspecBNA-211)；(7)血細胞計數器(Hemocytometer;Bright-line)；(8)組織培養角瓶(Corning)；(9)組織培養皿(Falcon)；(10)96-Well組織培養盤(Corning)；(11)微量吸管(Biohit)；(12)高溫滅菌器(Tomin1MedicalEquipmeneCo,LTD;TM-325)；(13)過濾膜(Coming)；(14)-80℃冰箱(EnviromentalEquip.Co;So-Low)。

1.3子宮肌瘤細胞由榮民醫院婦產科提供病理檢體。當患者在婦產科門診,以內診與超聲波掃描確診為子宮肌瘤,依臨床路徑安排入院手術治病者,以做本研究之素材。即由此類患者在手術切除后,立即切取肌瘤組織,放入轉輸液(DMEM)中,送實驗室做組織培養。

1.4試藥與試劑

1.4.1培養液（1）DMEM(Dulbecco’sMinimumEssentialMedium)；（2）FetalBovineSerum(Hyclone:CatNo.1115-L)；（3）Penicillin-Strepetomycin(Seromed:CatNo.03-033-1B)；（4）L-Glutamine(Seromed:CatNo.0020-1B)；（5）NAA(Mem-EagleNon-essentialAminoAcidsSolution)；（6）L-Glutamine200mM(Gibco:CatNo.25930-081)。

1.4.2染色劑（1）Trypanblue(Sigma)；（2）MTT:{3(4,5-dimethylthiazoled1-2-y1)-2,5-dipheyltetrasoliumbromide}(BoehringerMannheimGmbKCatNo.1465007)。

1.4.3一般化學藥品（1）DMSO(Merck,Germany,K23951931,Max0.05%H2O)；（2）SodiumHydrogenCarbonate(Merck,Germany,NaHCO3;Proanalysis)；（3）Isopropanol(Merck,Germany)。

1.4.4測試藥品與酵素（1）B-Estradiol(SigmaUSA)E-2758Lot79H0941；（2）Progesteronl(SigmaUSA)P-8783Lot80K0885；（3）Trypsin,2.5%(SigmaUSA)Lot1077108；（4）Trypsin-EDTA(SigmaUSA)Lot1089908；（5）LSAB(Dako,Denmark,CodeNo.K0675)；（6）MonoclonalAnti-HumanProgesteronereceptors(Dako,Denmark,clonepgR636,1:50)。

2實驗方法

2.1單味藥之制備將單味藥經粉碎后,加十倍重量之50%酒精,60℃水浴回流抽取2h,趁熱過濾。同法兩次后合并濾液經減壓濃縮制約1/10體積量。經冷凍干燥得粉末狀濃縮物,其產率見表1所示,將冷凍粉末置于20℃冰柜中以備下列實驗使用。

2.2一般溶液之配制

2.2.1PBS(phosphatebuffersolution)之配制將KCl0.2g，NaCl3.0g，NaH2PO4・7H2O2.16及KH2PO40.2g溶于次蒸餾500ml中,高壓減菌后使用。

2.2.2MTT配制方法稱取MTT5mg溶于10ml成濃度500μm,制完全溶解后以0.22μm之過濾膜過濾。

2.3檢測藥物之制備實驗前將冷凍干燥之各種藥品精稱10mg,以1mlDMSO溶解,再用研缽細磨后,以0.22μmmicrofilterunit過濾,分別調制成濃度為10mg/ml之stocksolution。每次檢測時,加入2μlstocksolution于每孔含198μl培養液中,使最后單位藥之濃度100μg/ml。

2.4試驗細胞之制備

2.4.1子宮肌瘤和正常子宮組織從榮民醫院手術室取出后,置于含DMEM的試管中,以冰塊冷凍帶回實驗室,于1h內切碎進行組織培養。

2.4.2子宮肌瘤和正常子宮組織將其分別切成1mm之小塊,加入1.5mg/mlcollagenasetypeⅡ和0.25%trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠狀,用膠吸管打散細胞(pipetting),經離心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再離心后去上清液。加入5mlDMEM均勻分布于培養皿,2天換一次培養液,于5%CO237℃培養7～14天。待細胞生長形成單層細胞(monolayer)細胞數約1×106cells/ml既可使用。

2.5試驗細胞之染色將初代培養的子宮肌瘤細胞和正常細胞,培養于培養皿中,利用免疫組織化學方法,經染色、照相后,作為試驗細胞鑒別區分之用。組織培養之新鮮標本于培養基中,以PBS溶液清洗,再以0.03%過氧化氫溶液浸泡30min,經PBS溶液清洗10min,接著進行免疫化學染色,所使用的單株抗體為抗人類黃體素接受抗體(monoclonalanti-humanprogesteronereceptorsantibody)。以適當濃度之單株抗體與培養細胞作用約1h,經PBS溶液洗10min后,以經生物素標示之二次抗體(biotinylatedsecondaryantibodies)作用30min,在經PBS溶液清洗10min后,以經具有過氧化酶之卵蛋白作用30min,經PBS溶液清洗10min后,以呈色劑(DAB,3,3-diaminobenzidine)呈色5min,以PBS溶液清洗,以蘇木精做對比染色,之后置于鏡下觀察照相［7～9］

2.6Bcl-2蛋白之制備利用0.25%trypsin將細胞處理成懸浮液后,將細胞稀釋成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培養盤中,使每孔約含2×106個細胞,放入5%CO2培養箱中37℃培養。次日,細胞生長形成單層細胞(monolayer)后,倒掉培養液,更換新鮮培養液后備用。同時各孔加入estradiol或progesterone(stocksolution濃度各為10μg/ml、100μg/ml)(13)1μl后24h,再加入中藥(stocksolution濃度為10mg/ml)10μl使濃度成為100μg/ml。24h后沖下細胞,離心(12000r）20min去上清液后加RIPA30μl備用。第一組Estradiol(10ng/ml)；第二組Estradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Estradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

2.7Westernblot分析法［10，11］利用BioquantProtein(200μl)將細胞萃取物定量,按比例取出加入proteindye3μl。將Totalproteinloading至10%SDS-PSGE后,以80V電泳3h,利用電轉印槽(Electrotransfertank)以270mA1h,將蛋白質面SDS-PAGE轉至PVGEmembrane后,加入Blockingsolution(1%BovineserumBSA)1h,分別加入Bcl-2rabbitpolyclonalIgG,α-tubulinmousemonoclonalIgM(1∶1000)4℃置1夜,再以PBST清洗,分別加入anti-rabbitIgG和anti-mouseIgG(1∶5000)1h后,再以PBST清洗后加呈色劑至呈色為止,再以清水洗去呈色劑后曬干。

2.8半致死量濃度(Theconcentrationof50%inhibition,IC50）之測定實驗前將冷凍干燥之各種藥品分別經稱2、4、6、8、10、12、14、16mg以DMSO1ml溶解,再用研缽細磨后,以0.22μlmicrofilterunit過濾,分別調至成不同濃度之stocksolution。每well加入stocksolution2μl于含198μl培養基中,使最后中藥濃度為40、80、120、160、200、240、280、320mg/ml。第二天觀察細胞生長情形,進行Tetrazolium反應法(MTTassay,計算其IC50）。

2.9細胞毒殺百分率之計算公式CI%=1-(實驗組之OD值/對照組之OD值）×100%。

2.10統計學方法各藥物之抑制率分別以平均標準偏差(Mean±SD)表示之,統計皆用student’st-test方法計算。

3實驗結果

單味藥對子宮肌瘤細胞和正常細胞毒性百分比(CytotxicityIndex)之比較;在20種單味藥中，王不留行、吳茱萸、生雞內金、水蛭(100μg/ml)對子宮肌瘤的細胞毒性百分比(CytotoxityIndex)較正常細胞高很多,見表2～4、圖1。

圖1中藥對子宮肌瘤細胞毒性百分比

表2單味藥對正常細胞和子宮肌瘤細胞的細胞毒性百分比（略）

表3王不留行對不同濃度子宮肌瘤細胞毒性百分比（略）

表4王不留行對子宮肌瘤細胞之IC50略

半致死量濃度在不同細胞之測定結果,王不留行汲水置在子宮肌瘤細胞的濃度,都小于正常細胞的濃度,顯示子宮肌瘤細胞對于這些中藥較為敏感,也較正常細胞有效。

Bcl-2蛋白質Westernblot分析法結果：正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞在Estradiol(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2的變化。Myometriumcell和Myomacell的第二組比第三組顏色較淡,第五組比第四組顏色較淡,顯示Bcl-2較少。子宮肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受Estradiol(10ng/ml)刺激而減少,因此第四組顏色要比第三組深,Bcl-2顯示溶媒對實驗結果影響不大,正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞各有六組;第一組Etradiol(10ng/ml)；第二組Etradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Etradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

子宮肌瘤細胞加入王不留行的Bcl-2測定：正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞在Estradio(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2蛋白質的變化Myometrium和Myomacell的Westenblot第二組。第五組色較淡,顯示Bcl-2較少。

4討論

在本實驗中單味藥三菱、莪術、生雞內金、水蛭對子宮肌瘤的細胞毒性百分比反而比正常細胞較低。三菱、莪術辛苦,性平和,入肝、脾二經能入血分以破血瘀,又能走氣分以氣消積,可抑制血小板聚集及血栓形成,也可擴張血管改善微循環。生雞內金、水蛭主術惡血、瘀血、月閉,破血瘕積聚。生雞內金不僅能加強消積化瘀之功效,亦顧護脾胃,亦可以散血去瘀、消腫定痛,水蛭會產生類似前列腺環素(prostacyclin,PGI2)可抑制血小板凝集、降低血壓并釋放出胞漿素原(plaminogen)［12］。

王不留行有催乳通經、消腫

【關鍵詞】吳茱萸

【摘要】目的觀察單味中藥對子宮肌瘤之影響。方法應用terazolium(MTT)反應法,針對傳統中藥以50%乙醇之萃取物進行子宮肌瘤細胞生長抑制試驗。結果發現20種單味中藥(吳茱萸,王不留行,水蛭等)對子宮肌瘤細胞抑制率較正常子宮細胞明顯增高。結論子宮肌瘤細胞半致死量濃度(IC50)之測定,較正常子宮細胞為低,顯示這些中藥對子宮肌瘤細胞較為敏感,應可經由細胞凋亡的途徑,而抑制子宮肌瘤細胞生長。

【關鍵詞】王不留行；吳茱萸；水蛭；生黃芪；子宮肌瘤細胞；細胞凋亡