大鼠腦組織表達(dá)管理論文

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【摘要】目的觀察鋁負(fù)荷大鼠腦組織單胺氧化酶B(MAOB)的活性與表達(dá)改變，并探討尼莫地平對(duì)該動(dòng)物模型的影響。方法采用三氯化鋁（AlCl3）(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持續(xù)3個(gè)月，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷的動(dòng)物模型，尼莫地平(80mg/kg)在每次鋁給予4h后灌胃，觀察行為學(xué)、生化酶學(xué)、MAOBmRNA及蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)的變化。結(jié)果鋁負(fù)荷能明顯導(dǎo)致大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力和空間識(shí)別能力障礙，使其腦組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性顯著降低(P＜0.01)，而膽堿酯酶(AchE)活性顯著升高(P＜0.01)，超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低(P＜0.01)，而丙二醛（MDA）含量顯著升高(P＜0.01)，MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)；NMDP能明顯改善鋁負(fù)荷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙，明顯阻遏鋁負(fù)荷大鼠海馬組織ChAT與SOD活性的降低，AchE活性與MDA含量的增高，MAOB活性及其mRNA與蛋白表達(dá)的增加。結(jié)論鋁負(fù)荷致大鼠腦損傷涉及腦組織的MAOB活性與表達(dá)改變；NMDP可能降低鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB表達(dá)和活性，并增加SOD活性，減少自由基而保護(hù)大鼠慢性腦損傷。

【關(guān)鍵詞】尼莫地平；鋁負(fù)荷大鼠；單胺氧化酶B

由于阿爾茨海默病（AD）發(fā)病機(jī)制未明，目前尚缺乏理想的治療手段。尼莫地平是雙氫吡啶類鈣通道拮抗劑，脂溶性高，易通過(guò)血腦屏障，其擴(kuò)張腦血管，改善腦血供應(yīng)等作用已得到肯定并應(yīng)用于臨床，而其對(duì)老年癡呆認(rèn)知記憶障礙的改善作用〔1〕，機(jī)制至今仍不很清楚。有研究報(bào)道單胺氧化酶B（MAOB）的活性改變與神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元退變可能有密切關(guān)系〔2，3〕。為探討尼莫地平在改善老年癡呆等導(dǎo)致的認(rèn)知記憶障礙中的作用，本研究擬采用鋁負(fù)荷大鼠腦損傷模型，觀察腦損傷學(xué)習(xí)記憶障礙與腦組織MAOB改變的關(guān)系及尼莫地平對(duì)鋁損傷大鼠腦組織MAOB表達(dá)的影響，為神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)病機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)，為防治藥物的開(kāi)發(fā)探尋新方法與新途徑。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組清潔級(jí)3月齡Wistar大鼠100只，雄性，180～220g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2005002〕。按體重隨機(jī)分成3組，每組10只，即空白對(duì)照(溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉)組，鋁模型(AlCl3400mg/kg)組與尼莫地平組(80mg/kg)，灌胃容積1ml/100g體重。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，鋁模型組死亡2只鼠。

1.2方法

1.2.1試劑、藥品與儀器AlCl3·6H2O和葡萄糖酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純，臨用前用蒸餾水配制；尼莫地平(重慶科瑞制藥廠)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、膽堿脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR試劑盒（日本TaKaRa）、RNATriol、單去污劑裂解液、考馬斯亮藍(lán)、封閉液與辣根過(guò)氧化物酶等。DTT2型大鼠跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、DMS2型電腦全自動(dòng)程控Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)、UV265紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)genecycleTM，BioRad公司)與凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司)等。

1.2.2模型制備采用AlCl3(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持續(xù)3個(gè)月，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷的動(dòng)物模型。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1訓(xùn)練次數(shù)與跳臺(tái)潛伏期分別在給予藥物3月后次日，用跳臺(tái)法測(cè)定每組大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力。先將動(dòng)物放入反應(yīng)箱中適應(yīng)1min，然后通以電壓為36V的交流電5min，大鼠遭受電擊會(huì)跳上安全平臺(tái)，而走下平臺(tái)后會(huì)再次遭受電擊，記錄5min內(nèi)大鼠受電擊次數(shù)，作為大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊的學(xué)習(xí)能力。24h后測(cè)定大鼠的記憶成績(jī)，把大鼠置于安全平臺(tái)上，記錄大鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間即潛伏期，以此潛伏期作為大鼠的記憶成績(jī)，超過(guò)5min記為5min。

1.2.3.2尋臺(tái)潛伏期每組大鼠在完成被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試后，用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠空間定向能力測(cè)試。水溫24～25℃。整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程分為2個(gè)階段：第1階段，第1次訓(xùn)練時(shí)將大鼠放到平臺(tái)上適應(yīng)1min，后讓其自由游泳至平臺(tái)，3min內(nèi)未找到平臺(tái)者，實(shí)驗(yàn)者協(xié)助將其引至平臺(tái)，從第2天起，每天分上、下午分段訓(xùn)練，每段訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練時(shí)選擇1個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠進(jìn)行定向航行，持續(xù)訓(xùn)練4d；第2階段，即在第5天時(shí)進(jìn)行測(cè)試，撤去平臺(tái)，并任意將大鼠從最后一次訓(xùn)練時(shí)的入水方位放入，電腦記錄大鼠第1次跨越原平臺(tái)的時(shí)間即尋臺(tái)潛伏期(Stepdownlatency，SDL)，以此潛伏期作為大鼠的空間定向能力成績(jī)，超過(guò)2min以2min計(jì)算。

1.2.3.3腦組織ChAT、AchE、SOD活性和MDA含量測(cè)定在完成全部行為學(xué)測(cè)試后，處死大鼠，分離其海馬，用生理鹽水做成10%勻漿，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作。

1.2.3.4腦組織MAOB活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)10%海馬及皮質(zhì)組織勻漿各取0.1ml，按照MAOB試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟測(cè)定MAOB活性。參照大鼠MAOB基因庫(kù)，根據(jù)cDNA設(shè)計(jì)引物，引物由北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心合成，用來(lái)擴(kuò)增535bp的MAOB片段。另外從北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心購(gòu)買GAPDH引物一對(duì)作為內(nèi)參照，用來(lái)擴(kuò)增983bp的GAPDH片段。MAOB的上游引物為5′TGCTAGATAAGATCTGCTGG3′；下游引物為5′ATCCAATGTGTACGCAATTG3′；GADPH的上游引物為5′TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3′；下游引物為5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′；PCR反應(yīng)條件為95℃5min預(yù)變性，95℃1min、60℃55s與72℃90s，27個(gè)循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)成像與分析。Western印跡測(cè)定MAOB蛋白表達(dá)水平，以βactin為參照，辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)顯色，用可見(jiàn)紫外光凝膠掃描分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間差異采用Dunnett方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1鋁負(fù)荷大鼠腦組織生化指標(biāo)的變化及尼莫地平的影響與空白對(duì)照組比較，鋁模型組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯降低，AchE活性與MDA含量顯著增高（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯增加，AchE活性與MDA含量顯著降低（均P＜0.01）（表1）。

2.2鋁負(fù)荷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化及尼莫地平的影響與空白對(duì)照組比較，鋁模型組大鼠5min內(nèi)學(xué)會(huì)逃避電擊而需要的電擊次數(shù)明顯增加，而跳臺(tái)潛伏期明顯縮短，尋臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊而需要的次數(shù)明顯減少(P＜0.01)，而跳臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，尋臺(tái)潛伏期明顯縮短（均P＜0.01）（表2）。

2.3鋁負(fù)荷致大鼠腦組織MAOB活性與表達(dá)變化及尼莫地平的影響與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷組大鼠腦組織MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達(dá)均顯著增高（均P＜0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織MAOB活性與MAOBmRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01）（表3）。表1尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦組織ChAT、AchE、SOD活性與MDA含量的影響表2尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與空間識(shí)別能力損害的影響與鋁模型組比較：1）P＜0.01，下表同表3尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性與表達(dá)的影響

3討論

轉(zhuǎn)基因方法可以建立AD大鼠模型，并能較好地模擬AD特征改變，但建模時(shí)間長(zhǎng)，成本昂貴，很難廣泛用于研究〔4〕。動(dòng)物腦室注射、腹腔給予或者長(zhǎng)期口服鋁鹽，鋁可在腦皮層各區(qū)以及海馬異常沉積，引起動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的進(jìn)行性損害和神經(jīng)元退變〔5〕。因此，本室采用AlCl3(400mg/kg)持續(xù)灌胃大鼠的方法，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷模型。ChAT的表達(dá)和活性降低以及AchE活性的升高會(huì)造成乙酰膽堿含量下降，進(jìn)而出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙。因此ChAT和AchE表達(dá)和活性改變是AD等神經(jīng)元退行性疾病特征變化之一。本研究中，鋁模型組大鼠腦組織ChAT活性降低，AchE活性升高，同時(shí)大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力與空間識(shí)別能力損害，故此法建立神經(jīng)元退變大鼠模型是成功的。

關(guān)于鋁致神經(jīng)毒性，特別是致神經(jīng)元退變的機(jī)制，目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性鋁負(fù)荷可導(dǎo)致大鼠海馬SOD活性降低、MDA含量升高，提示與其他原因所致腦損傷相似，氧化應(yīng)激也參與了慢性鋁負(fù)荷致腦損傷、神經(jīng)元退變過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性、MAOBmRNA與蛋白表達(dá)顯著增高，提示鋁負(fù)荷致大鼠神經(jīng)元退變的毒性機(jī)制也與MAOB活性及表達(dá)增加有關(guān)。

本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，尼莫地平能明顯改善鋁負(fù)荷導(dǎo)致的大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力損害和空間學(xué)習(xí)記憶障礙，減輕海馬神經(jīng)元損傷，明顯增加鋁負(fù)荷大鼠海馬ChAT與SOD的活性，明顯降低鋁負(fù)荷大鼠AchE活性與MDA含量，表明尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦損傷具有保護(hù)作用；同時(shí)，尼莫地平也能顯著降低鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性，對(duì)抗鋁負(fù)荷引起的大鼠腦組織MAOBmRNA和蛋白表達(dá)增加。但尼莫地平對(duì)MAOB活性與表達(dá)的改變是該藥物直接作用引起，還是作為鈣通道拮抗劑間接作用所致，尚不清楚，有待深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

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