缺血性腦損傷管理論文

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【摘要】目的觀察HPK1對SD大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區錐體細胞的作用。方法采用四動脈結扎法建立大鼠全腦缺血模型,缺血15min后分別灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天。大鼠隨機分為假手術組、缺血/再灌注組、缺血/再灌注給藥組和缺血/再灌注溶劑對照組。缺血/再灌注給藥組再分為2組，分別腦室注射100g/L的HPK1AS-ODNs、HPK1MS-ODNs，每24h注射1次，連續3天，在最后一次注射24h后行四動脈結扎全腦缺血。使用免疫沉淀和焦油紫染色法等技術檢測相關信號蛋白的表達、活化水平及神經元細胞的死亡。結果在大鼠海馬神經元中有HPK1的表達，腦室注射AS-ODNs大鼠海馬CA1區存活錐體細胞明顯增多。結論HPK1反義寡核苷酸對缺血/再灌注引起的海馬神經元凋亡具有保護作用。

【關鍵詞】造血祖細胞激酶1;反義寡核苷酸;海馬；凋亡；大鼠

TheroleofHPK1inischemicbraininjury

LITing,ZHANGGuangyi*

(ResearchCenterforBiochemistryandMolecularBiology,JiangsuKeyLaboratoryofBrainDisease

Bioinformation,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleofHPK1inthepyramidalcellsinCA1regionoftherathippocampusafterbrainischemia/reperfusion.MethodsTransientbrainischemia(15min)andreperfusionwasinducedbythefour-vesselocclusionmethod(4-VO)toestablishratbrainischemiamodel,followedbyreperfusionof0min,30min,3h,6h,24h,3dand5d,respectively.Ratswererandomlyassignedto4groups:sham-operationgroup,ischemia/reperfusiongroup,drugtestgroupandvehiclecontrolgroup.Thedrugtestgroupwasinjectedwith100g/LHPK1AS-ODNs，MS-ODNsintothecerebralventricle,every24hfor3days,and24hafterthefinaladministrationwassubjectedto4-VO.Immunoprecipitationandcresylfastvioletstainingwereemployedtodetecttheexpressionofrelevantmessageproteins,activationandthedeathofthehippocampalneurons.ResultsItwasfoundthatHPK1wasexpressedinrathippocampusneurons.ConclusionsAdministrationofHPK1antisenseoligodeoxynucleotidescansignificantlyprotecthippocampusneuronsfromapoptosiswithoutdose-dependence.

Keywords:HPK1;antisenseoligodeoxynucleotide;hippocampus;apoptosis;rat

造血祖細胞激酶1（hematopoieticprogenitorkinase1，HPK1orMAP4K1）是造血系統特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于哺乳動物Ste20相關蛋白激酶的MAP4K家族［1］。HPK1主要在造血組織和細胞中表達。大量研究結果表明，HPK1參與許多信號級聯反應，包括MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信號、抗原受體信號、凋亡信號、生長因子信號以及細胞因子信號等。HPK1存在3種激活方式，即絲氨酸磷酸化、蘇氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化，Ling等［2］證明HPK1含有13個潛在的酪氨酸磷酸化位點，在造血系統內當其中某些酪氨酸磷酸化位點被ZAP-70(Zeta-chain-associatedproteinkinase70)激活后，HPK1將提供含有SH2結構域的蛋白質錨定位點。當HPK1的379位（小鼠）/381位（人類）酪氨酸殘基被磷酸化而激活后，HPK1具有了和SLP-76（SH2domain-containingleukocyteproteinof76kD）結合的能力。當HPK1被完全激活后，它可以選擇性地激活JNK(c-JunNH2-terminalkinase)的MAPK信號通路［3］。1996年應用PCR技術將HPK1從小鼠造血祖細胞中克隆出來后，研究表明HPK1主要在造血組織和細胞中表達，目前對于HPK1的研究主要集中在造血系統。本研究旨在探討HPK1是否存在于大鼠海馬神經元中及其在缺血性腦損傷中的作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及材料清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重250～300g，徐州醫學院實驗動物中心提供。

anti-HPK1（一抗）由SantaCruz公司提供；二抗（驢抗羊）和標準牛血清白蛋白購自美國Sigma公司。醋酸纖維膜（NC膜）為AmershanBiosciences公司產品；NBT/BCIP為Promega公司產品；其他試劑為國產分析純。

電動勻漿器購自美國Glas-Col公司，Z252MK臺式高速冷凍離心機購自德國HERMLE公司。

HPK1反義寡核苷酸序列（AS-ODNs）5′-AGGGTCCACGACGTCCATCC-3′、HPK1錯義寡核苷酸序列（MS-ODNs）5′-CACAGCGTCGTACCCGCAGT-3′由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2四動脈阻斷全腦缺血模型按Pulsinelli法［4］進行。

1.3動物分組及處理隨機分組：①Sham組，手術不缺血；②腦缺血/再灌注組（I/R組），腦缺血15min后再灌注30min、3h、6h、24h、3天、5天；③溶劑對照組（TE組），腦室注射Tris-EDTA，連續3天，在最后一次注射24h后進行缺血/再灌注；④錯義寡核苷酸組（MS組），腦室注射MS-ODNs，方法同TE組；⑤反義寡核苷酸組（AS組），腦室注射AS-ODNs，方法同TE組。

1.4腦室注射參照文獻［5］方法。

1.5海馬CA1區HPK1檢測

1.5.1樣品制備大鼠缺血15min再灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天時，斷頭快速取腦，分離雙側海馬。按文獻［6］方法制備海馬CA1區組織總蛋白。

1.5.2蛋白含量測定按Lowry等［7］方法，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.5.3免疫印跡法蛋白樣品（50μg/L）經SDS-PAGE分離后，以半干轉法轉移至NC膜，室溫封閉4h(1﹪BSA,10mmol/LTris，10mmol/LNaCL，0.1﹪Tween20)，加入一抗，4℃過夜。用洗滌液洗膜，加入相應二抗，37℃保溫2h，封閉液洗膜。以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應。

1.6缺血/再灌注5天海馬CA1區組織學觀察大鼠腦海馬CA1區組織學切片制備參照文獻［6］方法。

在高倍鏡下觀察海馬CA1區神經元，有清楚的細胞核、胞體著色良好的計為存活神經元，神經元存活程度以CA1區1mm長度內成活的大錐體神經元數量表示。

1.7統計學處理數據以±s表示，2組間數據比較采用新復極差法，多組間數據比較采用單因素方差分析（AZOVA）,P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1大鼠腦缺血/再灌注不同時間的HPK1免疫印跡分析結果如圖1所示，在缺血/再灌注不同時間海馬CA1區都可以檢測到HPK1的表達。

2.2缺血/再灌注5天后海馬CA1區組織學觀察Sham組海馬CA1區錐體細胞核圓而蒼白；I/R組海馬CA1區錐體細胞胞體皺縮，細胞核固縮；AS組錐體細胞形態保持較好。圖2。

（焦油紫染色，×40，×400）AS組海馬CA1區存活的神經元數量較I/R組、TE組、MS組明顯增多；I/R組、TE組、MS組海馬CA1區存活的神經元數量相近（P＞0.05）。見圖3。

3討論

HPK1是一個97×103的絲/蘇氨酸蛋白激酶，它在淋巴細胞中對于調節JNK細胞信號通路起著重要的作用［1］。大量的研究結果證明，HPK1主要在造血組織和器官中表達。但在神經系統中HPK1起著什么樣的作用至今未見報道（網絡檢索）。HPK1的N末端由1個Ste-20樣激酶結構域、4個脯氨酸富集motif、1個caspase切割位點組成，C末端為1個Citron同源結構域［2］。Hu等［8］發現造血祖細胞瞬時表達HPK1可以通過MLK3-MKK4/7-JNK信號通路激活JNK，但不能激活ERK或p38-MAPK信號通路。Kiefer等［1］報道HPK1可以通過它的第3和第4個脯氨酸富集區與MLK3的SH3結構域相互作用。在體外實驗中，HPK1通過磷酸化MLK3的絲氨酸281位而激活MLK3繼而激活JNK。本室早期的研究結果也證實MLK3在大鼠瞬時腦缺血中發揮著重要作用，在缺血15min再灌注6h時其磷酸化水平達到高峰［5-6］。于是，我們提出HPK1是否也參與了腦缺血/再灌注所引起的神經元死亡的細胞信號轉導通路呢？

因此，我們首先通過免疫沉淀技術檢測了在大鼠海馬神經元細胞中HPK1的表達。結果證實在大鼠海馬神經元細胞中存在HPK1的表達。既然HPK1在大鼠海馬神經元細胞中有表達，那么它有何作用呢？為了回答這一問題，我們設計了HPK1的反義寡核苷酸（HPK1AS-ODNs），腦室注射HPK1AS-ODNs預處理組大鼠海馬神經元與I/R組相比明顯降低了腦缺血/再灌注所誘導海馬神經元死亡。以上結果證明，HPK1存在于大鼠海馬神經元，并且HPK1AS-ODNs對缺血/再灌注所引起的CA1區神經元缺失有保護作用。

本實驗首次在整體水平證實HPK1存在于大鼠海馬神經元細胞中，并且發現我們設計的HPK1的反義寡核苷酸對于對缺血/再灌注所引起的CA1區神經元缺失有保護作用。這對今后我們進一步研究HPK1在全腦缺血中的作用及其分子機制提供了新的思路。

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