膽堿乙酰酶活性管理論文

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【摘要】目的研究銀杏葉提取物(EGb)對點燃模型幼鼠學習記憶等認知功能，對大鼠海馬乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）活性的影響。方法21、35日齡SD大鼠各40只，經初篩后隨機分為生理鹽水對照組、點燃對照組及EGb大、中、小劑量治療組，采用戊四氮（PTZ）誘導幼鼠點燃模型，以Y型電迷宮及生化檢測方法，觀察用藥前后大鼠學習記憶功能和海馬AChE、ChAT活性的變化。結果EGb呈劑量依賴性顯著改善實驗大鼠的學習記憶能力,并顯著抑制海馬AChE活性、增強ChAT的活性。結論EGb可以通過抑制功能腦區AChE活性、增加ChAT的活性,增強中樞膽堿能神經系統的功能，改善發育期癲疒間大鼠學習記憶功能。

【關鍵詞】銀杏葉提取物；學習記憶；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉移酶；點燃模型；大鼠

EffectofextractsofGinkgobilobaleafonthelearning-memoryabilityandtheactivity

ofAChEandChATinthehippocampusinratswithkindling-inducedepilepsy

DUANFangrong,YUANBaoqiang*

(DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofextractsofGinkgobilobaleaf(EGb)onthecognitivefunctionssuchaslearningandmemoryabilitiesandpossiblemechanismsinyoungratswithkindling-inducedepilepsy,andontheactivityofacetylcholinesterase(AChE)andcholineacetyltransterase(ChAT)inrat.Methods40postnatalday21(P21)and40postnatalday35(P35)Sprague-Dawley(SD)ratswererandomlyassignedrespectivelyinto5groups:normalsaline(NS)control,kindlingepilepsymodel,high,middleandlowdosageofEGb-treatedkindlingepilepsyafterpreliminaryscreeningbyY-mazetest.Thekindlingmodelwasestablishedbyanintraperitonealinjectionofpentetrazole(PTZ).Thevariationsoflearning-memoryabilityandtheactivityofAChEandChATinthehippocampuswereobservedbyY-mazetestandbiochemistrydetermination.ResultsEGbcouldobviouslyimprovetheachievementofY-mazetestofthekindlingmodelinadose-dependentmanner,withtheactivityofAChEandChATinthehippocampusinhibitedandincreased,respectively.ConclusionEGbcanimprovelearning-memoryabilityinepilepticratsofdevelopmentalphasebyincreasingtheChATactivityandreducingtheAChEactivity,whichmaycontributetoitsactioninimprovingtheabilityofcholinergicnervoussystem.

Keywords:extractsofGinkgobilobaleaf;learning-memory;AChE;ChAT;kindlingmodel;rats

銀杏葉提取物(extractsofGinkgobilobaleaf,EGb)是從銀杏葉中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有銀杏總黃酮苷、銀杏內酯和有機酸等，具有多價性藥理作用［1］。其作為一種中樞神經賦活劑，目前國內外已將EGb廣泛應用于治療腦動脈硬化、腦梗死后遺癥和老年神經精神癥狀如注意力不集中、記憶力減退、意識模糊等，在臨床上明顯地改善了腦功能不全患者的學習記憶能力，因而被認為是一種“認知增強劑”［2-4］。目前認知問題亦是癲疒間兒童在臨床診斷和治療中的常見癥狀，但尚缺乏較好的處理措施。而關于EGb對癲疒間患者尤其是癲疒間兒童學習記憶等認知功能障礙影響的實驗研究或臨床研究少見報道。本研究旨在探討EGb對癲疒間模型幼鼠認知功能的影響及可能機制，為臨床應用EGb治療癲疒間兒童認知功能障礙提供實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物21、35日齡SD幼鼠，體重55～95g，雌雄不分，由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2藥物及試劑EGb（銀杏總黃酮苷＞24%，銀杏內酯＞6%，峰比0.8～1.0,銀杏酸＜1×10-6%），由徐州富偉生化制品有限公司惠贈；戊四氮(PTZ)購于Sigma公司；AChE、ChAT試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3儀器Y型電迷宮，張家港生物醫學儀器廠生產；GL20C超速冷凍離心機，武漢科學儀器廠生產；752紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司生產;水浴箱，上海醫學儀器廠。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立參考文獻［5］方法。用PTZ亞驚厥劑量（32mg/kg）,腹腔注射,每天1次,連續注射28天。停藥1周后,再用相同劑量的PTZ測試。癲疒間發作行為按Racine標準分為6級,即：0級，未發作；Ⅰ級，頭面部抽搐；Ⅱ級，肌陣攣、跳起,但無直立；Ⅲ級，肌陣攣,雙前肢抬起伴有直立；Ⅳ級，強直-陣攣性驚厥；Ⅴ級，全身強直-陣攣性驚厥伴有翻滾、跌倒。凡顯示連續5次2級以上驚厥的大鼠,被認為達到點燃標準，即點燃模型制備成功。

1.2.2動物分組及藥物處理先用Y型電迷宮初步篩選21、35日齡大鼠各40只，然后進行點燃模型的制備，造模成功后隨機分為5組(n=8)：生理鹽水組(NS組)、點燃對照組(PTZ組)、EGb大劑量300mg/kg治療組(PTZ+EGb1組)、EGb中劑量200mg/kg治療組(PTZ+EGb2組)、EGb小劑量100mg/kg治療組(PTZ+EGb3組)。EGb以5%的乙醇為溶劑制備成10%的混懸液，采用灌胃給藥,NS組和PTZ組給予相同體積的生理鹽水,每日1次，連續給藥7天。所有大鼠均在同一實驗室和動物中心操作和飼養，以保持喂養、光照、噪聲等條件相同。

1.2.3學習記憶功能的訓練與評定參照王躍春［6］方法，電流強度0.7mA，電壓50V，電擊延時5s。

篩選：將大鼠放入Y型迷宮箱中適應3min后，給予適當電擊，至其對3臂均探索進入為止，選擇活躍、對點擊反應較敏感、逃避反應迅速者供測試用。淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠。

訓練及評定：采用隨機休息不固定訓練次數法，以大鼠在足底通電后15s內一次性進入安全區的反應為正確,直至大鼠在連續10次電擊中有9次或以上正確（9/10標準）為達到學會標準，以每只大鼠達學會標準所需電擊次數表示大鼠的學習記憶成績。所有訓練在1個實驗日內完成。各組在造模后次日及治療后7天進行認知功能的評定。

1.2.4海馬AChE、ChAT活性的測定在完成認知功能評定步驟后斷頭處死大鼠,冰臺上迅速取腦并剝離海馬,用濾紙吸去海馬上的血液,精密稱重,腦重∶生理鹽水以1∶9比例加入4℃生理鹽水制成腦勻漿,3000r/min離心10min,取上清液待測。

海馬AChE、ChAT活性的測定嚴格按試劑盒說明進行，752型紫外分光光度計進行比色。腦組織蛋白測定采用考馬斯亮蘭試劑盒。

設定每毫克組織蛋白樣本在37℃保溫6min,水解反應體系中1μmol基質為1個AChE活力單位；在pH7.2條件下，25～30℃時每分鐘轉移1nmol乙酰膽堿的能力定義為一個ChAT活力單位。

1.3統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，所有計量資料數據以±s表示；多組間的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，治療前后的比較采用配對t檢驗（Paired-SamplesTTest）,不同日齡組的比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-SampleTTest)；P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1點燃模型的建立PTZ腹腔注射1周左右大鼠陸續出現程度不等的疒間性發作,為Ⅰ～Ⅲ級,以后發作程度逐漸加劇,在連續注射28天后所有大鼠均達到點燃標準。大鼠的疒間性發作基本上在每次腹腔注射PTZ后5～6min出現,一般在10min左右達到高峰,高峰過后時而表現安靜,時而有陣發性陣攣,一般30min后很少再有抽搐發作。PTZ點燃成功的大鼠,有慢性、自發性、復發性的發作過程。

2.2各組大鼠行為學測試Y型電迷宮測試結果見表1。

2.2.1治療前不管是21日齡還是35日齡的大鼠，PTZ各組與其同齡NS組相比，達到學會標準所需的電擊次數明顯增多(P<0.01)，而PTZ各組之間沒有明顯差異(P>0.05)；21日齡與35日齡的PTZ各組相互比較，前者達標次數亦明顯增多(P<0.05);21日齡與35日齡的NS組相互比較差異無統計學意義。表1各組大鼠Y型電迷宮試驗達標所需電擊次數與NS組比較：*P<0.01；與治療后PTZ組比較：#P<0.01；與PTZ+EGb2組比較：※P<0.01；與同組治療前比較：☆P<0.05；與21日齡組比較：△P<0.05。

2.2.2治療后2個日齡EGb治療組達到學會標準的次數均明顯少于同齡PTZ組(P<0.01)；同齡EGb大、中、小劑量治療組相互比較,達到學會標準的次數隨EGb治療劑量的減少逐漸增多，呈現劑量依賴性遞增(P<0.01)；各EGb組的2個年齡段之間卻未示明顯差異(P>0.05)。

21日齡、35日齡各組治療前后相互比較，EGb各劑量治療組治療后達標次數均明顯少于治療前(P<0.01或P<0.05)；NS組、PTZ組治療前后差異無顯著性統計學意義。

2.3生化檢測不管是21日齡還是35日齡的大鼠，PTZ組與各自的NS組比較，海馬AChE、ChAT的活性都明顯降低(P<0.01)；各EGb治療組與其同齡PTZ組相比，隨治療劑量的增加，AChE活性逐漸降低、ChAT活性則逐漸提高，呈劑量依賴性(P<0.01)；各組的2個年齡段之間AChE、ChAT的活性均未示明顯差異(P>0.05)。見表2。表2各組大鼠海馬AChE、ChAT活性的比較與PTZ組比較：☆P<0.01；與PTZ+EGb2組比較：△P<0.01；與21日齡PTZ組比較：▲P>0.05

3討論

點燃模型作為一種最常用的癲疒間動物模型,具備慢性、自發性和復發性特征,點燃一旦建立,動物的這種腦細胞及驚厥行為敏感性可長期維持及至終身,較好地模擬了人類癲疒間的進行性發展和長期反復的自限性發作形式。許多研究表明，不同形式癲疒間發作過程中常伴有海馬結構內選擇性神經元脫失、苔蘚纖維出芽(sprouting)和特異性突觸重建等形態學改變［7-9］，在人類復雜部分性發作和兒童期癲疒間患者亦可觀察到同樣的變化［10］,這表明點燃與人類癲疒間的形成可能有共同的機制，因此點燃模型是研究慢性癲疒間較理想的動物模型。臨床資料顯示癲疒間患者中30%～40%存在認知功能障礙［11］，在兒童患者更為顯著，臨床上表現為某種程度的學習困難或學習不能、語言能力的損傷等，但臨床上對此缺乏有效的手段來改善這一現狀。

本實驗采用戊四氮化學點燃方法,復制出了接近人類癲疒間的慢性癲疒間模型，本實驗的行為學觀察結果發現:點燃組大鼠學習記憶能力顯著低于NS組,與文獻報道結果相似，說明本造模法穩定可靠,適用于學習記憶等高級神經功能活動的研究。試驗結果還顯示，21日齡模型鼠的行為學指標與35日齡的相比，差異具有顯著性，與以往研究結果相一致，即癲疒間幼鼠起病越早，對學習記憶等認知功能損傷越嚴重［12］。

目前認為中樞膽堿能系統與學習記憶功能的關系極為密切，有資料表明,海馬的膽堿能系統直接參與信息的儲存和回憶。而AChE及ChAT是膽堿能神經元的標志酶，兩者共同維持著中樞膽堿能系統重要的神經遞質——乙酰膽堿（ACh）的動態平衡,在多種高級腦功能包括學習記憶過程中發揮重要作用，所以用AChE及ChAT的活性來反映膽堿能系統的功能較為可靠。許多藥理學及臨床研究已證實海馬和新皮層的膽堿能損傷可以損害大鼠和人的記憶功能。我們的研究顯示,點燃大鼠的學習記憶能力明顯減退,同時伴有海馬AChE、ChAT活性降低,提示戊四氮誘導的學習記憶障礙與海馬及新皮層膽堿能系統的功能降低有關，這與以往的研究結果一致。在應用銀杏葉提取物EGb治療后發現，EGb顯著改善了癲疒間鼠的學習記憶功能，還顯著降低AChE的活性，增強ChAT的活性，并且在100～300mg/kg范圍內，EGb的這種藥理作用呈劑量依賴性增強。表明EGb能改善癲疒間大鼠學習記憶功能的機制可能與抑制腦AChE活性、增加ChAT的活性,從而提高ACh含量,增強中樞膽堿能神經系統的功能有關。諸多的研究顯示，EGb還可能通過促進大腦海馬膽堿的再攝取、減少M型膽堿受體和腎上腺素受體及遞質的丟失、促進大腦循環代謝、增強膽堿能神經元神經營養因子受體的敏感性等途徑發揮改善學習和記憶能力的功能［13］。近年來的臨床研究也發現EGb可明顯改善血管癡呆患者的智能障礙，這種作用可能與EGb加速神經沖動的傳導,易化突觸傳遞,從而有利于信息獲得、記憶鞏固和再現有關［14］。本實驗中2個不同年齡段對應組間生化指標比較未示顯著差異，說明除膽堿能系統外可能還有其他機制影響癲疒間幼鼠的學習記憶功能。

本實驗結果提示：EGb可以通過抑制學習記憶功能腦區AChE活性、增強ChAT活性、增強中樞膽堿能神經系統的功能來改善點燃模型幼鼠的學習記憶功能障礙，為EGb用于臨床治療癲疒間兒童認知功能障礙提供了理論和實驗依據，并且進一步拓展了EGb的藥用價值。

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