網箱養殖患病草魚鑒別與感染

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草魚Ctenopharyngodonidellus屬鯉形目鯉科，是中國重要的淡水養殖魚類，它與鰱、鳙和青魚一起，構成了中國著名的“四大家魚”．草魚是草食性魚類，已經有1700多年的養殖歷史［1］．由于草魚養殖具有周期短、肉味鮮美、經濟效益高等特點，目前草魚已經成為烏江網箱養殖量最大的魚類品種．然而，隨著烏江流域的工農業發展和人口增長，每年都有大量的工業和生活污水流入烏江，使烏江水質變差（尤其在枯水季節），魚病發生頻繁，給草魚養殖造成了很大的經濟損失．因此，其病害的防治顯得十分迫切．目前，rRNA和rDNA作為分子指標廣泛應用于細菌遺傳特征和分子差異研究［2］．大量已知細菌的rRNA基因數據已被測定并輸入了國際基因數據庫，成為細菌鑒定和分類的參照系統［3］．本研究以患病草魚為材料，對分離所得菌株采用16SrRNA基因序列測定，將測序結果輸入國際基因數據庫，通過同源性比對鑒定致病菌．然后用致病菌接種健康草魚，進一步驗證其致病性，從而為草魚的病害防治提供病原依據．

1材料與方法

1．1試驗材料患病草魚標本（5尾）于2008年4月采自烏江上游主要支流中的偏巖河養殖場，采集時標本材料個體病征相似．其中2尾草魚病癥為爛鰓、爛尾、爛鰭，體表發紅；3尾草魚病癥為爛鰓、爛鰭，體表、腸發紅，腸道出血．

1．2細菌的分離用無菌棉簽分別沾取患病草魚體表患處、鰓部、腸內溶物、體內血液、肝臟表面和肝臟內部，并分別涂布于營養瓊脂培養基平板上．將接種后的平板倒置于27℃恒溫培養箱中培養12h．長出菌落后取出平板，將平板中不同的菌落分別轉接到空白營養瓊脂培養基平板中，轉接后的平板倒置于27℃恒溫箱中培養12h．重復此步驟幾輪，直至一個平板中只長有一種菌落［4］．將純化后的平板取出，對細菌的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀和顏色等進行觀察記錄．

1．3基因組DNA的提取和16SrRNA基因的擴增、測序及數據處理參見李順等［4］的方法．

1．4細菌的回復感染

1．4．1細菌的培養將分離到的細菌接種于營養瓊脂培養基平板上，置于27℃隔水式恒溫箱中培養，直至長出菌落．

1．4．2細菌懸液的制備取已長出菌落的平板，在超凈工作臺上用滅菌生理鹽水洗下菌苔于試劑瓶中制成細菌懸液，保存于冰箱中（4℃）．回復感染前，將細菌懸液用滅菌生理鹽水分別以0，5，10，100和1000倍梯度稀釋．

1．4．3細菌懸液體積分數測定用平板菌落計數法測定細菌懸浮液中活菌數目．各梯度菌液體積分數（細菌密度）約為1×1010，2×109，1×109，1×108，1×107個／mL．

1．4．4感染草魚用于回復感染的健康草魚取于烏江偏巖河養殖場網箱中，體長15～20cm，體質量80～150g，每組10尾．用不同體積分數的菌液以肌肉注射（1mL／尾）和浸泡兩種方式感染試驗魚（兩種方式都用以上幾種梯度的菌液感染），對照組注射相同劑量的生理鹽水．將以上試驗魚置于3m×3m的水泥魚池中（水深70cm，連續充氧），連續觀察15d．

2結果與分析

2．1菌落外部形態和革蘭氏染色結果將純化后的平板取出，對細菌菌落進行形態觀察，再革蘭氏染色［5］后觀察．通過比較外部形態和革蘭氏染色結果，從5尾患病草魚中共得到7株不同菌株（表1）．

2．216SrRNA基因的擴增結果對分離到的7個菌株的16SrRNA基因進行PCR擴增，均擴增出一條約600bp的片段（圖1）．

2．316SrRNA測序結果I菌株的測序結果（580bp，不包括引物序列）見表2（其余菌株的測序結果略）．

2．4菌株的鑒定對16SrRNA基因部分序列正、反方向測序的結果進行拼接，拼接后的測序結果輸入到NCBI網站（）．利用BLAST工具，對序列進行同源性比對分析，所得結果見表3．

2．5回復感染將初步鑒定的以上細菌分別接種到健康草魚，發現注射感染后致病體積分數在1×108～1×109個／mL之間．4．浸泡感染組和對照組在回復感染后的15d內均無明顯癥狀．

3討論

隨著現代生物技術的飛速發展，16SrRNA基因序列分析技術在微生物分子檢測及分類鑒定中得到了廣泛的應用．以16SrRNA基因為目的基因的現代分子生物學技術能精確地揭示微生物種類及遺傳的多樣性，從而使16SrRNA基因序列分析成了微生物分類鑒定的主要依據，已被廣泛應用到菌種鑒定、群落對比分析、群落中系統發育及多樣性的評估等領域，是一種客觀和可信度較高的分類和鑒定方法［6］．本研究用微生物學常用的細菌分離純化方法從患病草魚中分離出7株菌株，分別擴增出了16SrRNA基因約600bp的片段．一般認為，16SrDNA序列同源性大于99％，可以認為屬于同一種；同源性大于95％而小于98％，可以認為是同一個屬的不同種；同源性在93％～95％之間，可以認為屬于不同的屬［7］．通過對16SrRNA基因序列進行同源性比對分析，初步鑒定Ⅰ為沙雷氏菌，II為腐生葡萄球菌，III為熒光假單孢菌，IV為產堿普羅威登斯菌，V為嗜水氣單孢菌，VI為殺鮭氣單孢菌，VII為不動菌屬．將以上初步鑒定的不同細菌接種到健康草魚，沙雷氏菌、腐生葡萄球菌、熒光假單孢菌、產堿普羅威登斯菌和嗜水氣單孢菌在體積分數為1×108～1×109／mL時開始致病，對草魚的危害較大，可以判斷它們可能是網箱養殖草魚發病的主要病原．殺鮭氣單孢菌、不動菌屬以及浸泡感染的癥狀不明顯，加大體積分數是否致病有待進一步研究．在對細菌引起魚類病害的研究中，對嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌可以引起魚類及其他多種水生動物患病有大量報道［8－17］．

在本試驗中，嗜水氣單胞菌在接種后第3天開始死亡，試驗期間死亡率為60％，主要癥狀為豎鱗、掉鱗和皮膚充血等，與其他學者的結果［10－11］相一致；殺鮭氣單孢菌在本實驗中的結果與其他學者的研究結果［18］不一致，我們將就此進一步研究以證實其是否致病．