ERMAP基因研究論文

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【摘要】人類ermap基因是新近發現的編碼紅細胞膜相關蛋白基因，其功能可能與紅系造血活動有關。為探討該基因在胎兒造血過程中的作用，收集9-36周難免流產胎兒共29例，分別抽提其肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉等9種臟器組織的RNA，取其中胎齡255周（25周過5天，下同）的胎兒各臟器組織的RNA進行Northernblot檢測，了解人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達譜，同時采用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法觀察該基因在不同胎齡胎兒組織中表達量的變化規律。結果Northernblot檢測顯示，人類ERMAP基因在255周胎兒肝臟和骨髓中表達陽性，而在脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉中表達陰性。FQ-PCR結果顯示，人類ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達，其表達量從第12周開始升高，18-20周達高峰，21周后逐漸下降；該基因在胎兒骨髓中的表達則從15周開始，27-32周達高峰，之后迅速下降，其表達量低于肝臟；在其余7個臟器中僅有部分標本呈現低水平表達。結論：人類ERMAP基因在胎兒肝臟中的表達規律與胎兒肝臟造血過程基本一致，在15-32周胎兒骨髓中的表達規律與胎兒期骨髓造血活動基本吻合，推測該基因的功能可能與胎兒發育過程中紅系細胞向肝臟和骨髓的遷移活動有關。

【關鍵詞】ERMAP基因；胎兒期；肝臟；骨髓；造血

ExpressionofHumanERMAPGeneinFetalTissues

AbstractHumanERMAP(hERMAP)isanovelgenecodingforerythroidmembrane-associatedprotein,whichmayplayaroleinerythropoiesis.ToexploretheroleofhERMAPinfetalhematopoiesis,29fetusesofinevitableabortionwiththefetalagesof9-36weekswerecollected,andthetotalRNAswereisolatedfromtheliver,spleen,kidney,heart,lung,thymus,brain,bonemarrowandskeletalmuscle,theRNAsfromwhichat255weekfetalagewereusedtodetecthERMAPexpressionsindifferentfetaltissueswithNorthernblot,andthehERMAPinvariousfetaltissueswerequantifiedbyFQ-PCR.Asaresult,NorthernblotshowedthathERMAPwasexpressedinliverandbonemarrowat255fetalage,butnotintheotherorgantissues.FQ-PCRresultsindicatedthatthehERMAPhadbeenstillexpressedin9-36thweekfetalliver,increasedstartingfrom12th-week,reachingapeakbetween18-20thweekanddecliningslowlystartingfrom21st-week.Inthefetalbonemarrow,expressionofthehERMAPbeganfrom15thweek,reachedahighestlevelbetween27-32ndweekandfellrapidlyfrom33rdweek,theexpressionlevelofwhichwaslowerthanthatinliver.Thelowlevelexpressionofthisgenewasobservedinsomespecimensofkidney,heart,lung,thymus,brainandskeletalmuscle.ItisconcludedthattheexpressionofhERMAPinfetalliverapproximatelyconsistentwithhaematopoiesisoffetalliver,andtheexpressionofthisgeneinbonemarrowaged15-32thfetalweekscoincideswithhaematopoiesisoffetalbonemarrow.ItsuggeststhatthefunctionofthehERMAPispossiblyrelatedwiththemigrationoferythroidcellstoliverandbonemarrowduringthefetaldevelopmentprocess.

KeywordshumanERMAP；fetalstage；haematopoiesis

近年來，Ye等［1-3］分別從鼠胚胎紅細胞和人胎肝cDNA文庫中篩選出編碼紅細胞膜相關蛋白（erythroidmembrane-associatedprotein，ERMAP）基因，并證實其高度特異表達于胎肝、成人骨髓等造血組織以及K562和HEL細胞系，其編碼的蛋白分子定位于網織紅細胞和原始紅細胞膜、293T細胞膜和其他胞漿小體上，分析顯示其為一跨膜蛋白分子，屬免疫球蛋白超家族成員。推測ERMAP可能通過細胞間的黏附和（或）識別，影響紅系造血，或在紅系相關性疾病、自身免疫性疾病和其他疾病中起一定

作用。目前關于該基因的特性與功能尚待進一步研究。本研究旨在通過觀察人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒各臟器組織中的表達譜及表達量的變化，探討該基因在胎兒造血過程中的作用。

材料和方法

材料

收集2004年3月至2004年11月由廣東省婦幼保健院、廣州醫學院第二附屬醫院、東山區婦幼保健院、海珠區婦幼保健院等醫院婦產科提供的難免流產胎兒，胎齡不限。均排除胎兒先天畸形、孕母遺傳性疾病、妊娠期間用藥史。胎兒離開母體后立即取肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉9種臟器組織，放入凍存管，置于-80℃冰箱保存。

方法

總RNA的提取稱取50-100mg組織置于研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，轉移至含1mlRNA-solv的離心管中，按照RNA-sol試劑（Omega公司產品）說明書提取RNA，置于-80℃保存。用紫外透射燈(Amersham公司產品)分析其純度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0。提取物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實為完整RNA。

ERMAP基因表達譜的Northernblot觀察選取1個胎齡為255周(25周過5天）的胎兒，將上述9種臟器組織的總RNA在1%瓊脂糖凝膠上甲醛變性電泳3小時（5V/cm），在紫外分光光度儀下測量18S、28S條帶到點樣孔的距離，利用真空轉移儀轉膜2小時。然后以PCR方法分別標記ERMAP和β-actin探針（按照PCRDIGProbeSynthesisKit試劑盒說明書操作，引物由北京賽白盛有限公司合成），ERMAP引物序列為5′-GAGATGGCGAGTTCTGCT-3′，5′-CACCGTCCTCCCCTTATA-3′，β-actin引物序列為5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′。對照管加入無DIG標記的dNTPs。探針變性后進行預雜交及雜交，經過低嚴謹性和高嚴謹性洗膜后，加入Anti-Digoxigenin-AP孵育30分鐘，再加入CDP-Star顯色劑于尼龍膜上，將膜曝露在化學發光成像儀（美國System-genome公司產品）中檢測熒光信號。

ERMAP基因表達量的FQ-PCR檢測［5］取各臟器組織的總RNA逆轉錄制備cDNA（反應體系參照Promega公司試劑說明）。將已測定濃度的含有ERMAP基因cDNA序列的pBluescriptSK質粒（加拿大McMaster大學病理與分子醫學系Dr.DavidChui教授贈送）依次10倍稀釋成7個濃度級梯度作為模板，用于建立標準曲線。取同一樣品的等量cDNA作為PCR模板，分別加入ERMAP及β-actin的引物、探針以及TaqManUniversalPCRMasterMix（美國ABI公司產品），檢測ERMAP及β-actin的表達水平，兩者之比即為ERMAP在各組織中的相對表達量。ERMAP和β-actin引物與MGB探針由上海基康有限公司合成，序列如下：ERMAPprimer1：5′-CATGTGACGGAGGTGGACAA-3′ERMAPprimer2：5′-CAGCTTTATGGAGTTTTCCTTTTTCT-3′ERMAPMGBprobe：FAM-CTTCTTTCAGACCATGCTA-MGBβ-actinprimer1：5′-ACGGCCAGGTCATCACCAT-3′β-actinprimer2：5′-AAGGCTGGAAGAGTGCCTCAG-3′。β-actinMGBprobe：FAM-CAATGAGCGGTTCCG-MGB。

統計學處理

基因的相對表達量以±SD表示，采用OriginPro7.5軟件進行資料分析和繪圖。

結果

人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達譜

Northernblot顯示肝臟和骨髓表達陽性，而脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉等表達陰性（圖1）。

胎肝組織RNA以ERMAP探針雜交后，其陽性條帶到點樣孔距離為4.04cm，推算出目的基因的mRNA長度為3.6kb，與人類ERMAPmRNA長度一致。

人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒組織中表達量的變化

FQ-PCR標準曲線將已測定濃度的含有ERMAP基因cDNA的質粒pBluescriptSK依次10倍稀釋成108-102cps/μl等7個濃度梯度，經FQ-PCR后獲得典型的倒“S”型曲線，可檢測到熒光信號的起始循環數（Ct）與模板濃度對數值的相關函數為У=－3.557Ct38.152，r2=0.998178。

人類ERMAP基因在胎兒肝臟和骨髓中的表達量ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達，其表達量從第12周開始升高，18-20周達高峰，21周后逐漸下降。ERMAP基因在胎兒骨髓中的表達則從15周開始，27-32周達高峰，之后迅速下降，各階段的表達量均低于肝臟（附表，圖2）。Table.ExpressionofERMAPinfetalliverandbonemarrowatdifferentfetalages（略）

人類ERMAP基因在胎兒其它臟器中的表達量檢測脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉7種臟器各17個標本，結果顯示ERMAP基因僅在部分標本中低水平表達，其表達的陽性率（即各臟器陽性例數與總例數之比）分別為20%、7.6%、25%、13%、20%、7.6%和25%。

討論

人類胚胎期造血經歷了卵黃囊造血、肝脾造血和骨髓造血等造血部位的遷移過程。卵黃囊造血始于妊娠第3周，終止于第8周。在妊娠第5周肝臟發育成完善的血竇系統，造血干細胞（hemotopoieticstemcells，HSC）隨血流遷移并種植于肝臟，進入了胎肝造血期。隨著胚胎的不斷發育，胎肝來源的HSC不斷遷移至骨髓血管外基質，在骨髓腔中分化成熟，形成骨髓造血。骨髓造血一直持續至出生后，成為終身的造血器官。除了遷移至骨髓外，胎肝的HSC還可遷移、定植于脾臟、胸腺和淋巴結，并在其中開始造血活動。在整個胚胎造血過程中，各器官的造血活動是連續不斷、此消彼長的。但是期間的調控機理如何，至今尚未闡明。越來越多的研究表明，某一器官的造血能力主要取決于其造血微環境，當一個器官的微環境不再適合造血活動時，其中的造血干細胞便隨血液流向其它組織，與其中的成分相互作用，從而啟動造血細胞的增殖與分化，最后形成新的造血中心［4］。造血細胞的遷移和定植是由造血細胞表面的一系列黏附分子與造血微環境中相應的配體結合后所引起的信號轉導的結果［6］，這種黏附分子與相應配體相互作用，在造血細胞增殖和分化過程中同樣發揮著重要的調節作用。造血微環境中的黏附分子及其配體，與細胞外基質、細胞因子、轉錄因子等共同形成造血調控網絡的分子基礎。紅系造血細胞發育過程的不同階段，其細胞膜表面的黏附分子的表達呈現一定的時空規律［7］。hERMAP基因編碼紅細胞跨膜蛋白，為一黏附分子，屬免疫球蛋白超家族成員。Xu等［3］證實，hERMAP基因表達于第12周和23周的胎肝紅細胞、成人骨髓，以及第8-12周臍帶血中的網織紅細胞和原始紅細胞，提示該基因在胚胎紅系造血中可能起到一定的作用。但Xu的研究僅為定性研究，且未對該基因在胚胎臟器中的表達量作連續動態觀察。本研究在本課題組建立的hERMAP基因FQ-PCR檢測方法的基礎上［5］，對hERMAP基因在不同胎齡器官組織中的表達量進行動態觀察。結果顯示，該基因在妊娠9-36周胎兒肝臟中均有表達，其表達規律與胎兒肝臟造血過程基本一致。該基因在胎兒骨髓中的表達則始于15周，30-32周達高峰，這與胎兒期骨髓造血活動基本吻合，但妊娠32周后骨髓造血活動仍然存，而hERMAP基因的表達卻迅速下降。由附表和圖2可見，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的表達量出現較為明顯的下降，我們認為這可能與粒系細胞的生成有關。早期胎肝所產生的幾乎全部是幼稚紅細胞，妊娠3-4個月胎兒紅細胞約為109/L，妊娠4個月左右胎肝開始有明顯的粒細胞生成。而在此階段，胎肝所生成的紅細胞數量并無明顯的增加。由于本研究的檢測結果是以hERMAP與β-actin的表達量之比表示的，反映的是hERMAP在各組織中的相對表達量。因此，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的相對表達量下降，之后胎肝造血進入旺盛階段，紅系造血明顯活躍，紅細胞數量可達1011/L，hERMAP的表達量出現高峰，直到21周后隨著肝臟造血活動減弱而逐漸下降［8］。由上述結果推測，人類ERMAP基因的功能可能與胎兒發育過程中紅系細胞向肝臟和骨髓的遷移活動有關，在肝臟造血后期以及妊娠后期，大量造血細胞向肝臟和骨髓的遷移活動基本完成，其基質內的ERMAP配體數量下降，ERMAP基因的表達水平也隨之下降；但ERMAP蛋白與其配體作用的機制如何，其是否參與了胚胎紅系造血細胞增殖和分化的調控，仍有待下進一步的研究證實。研究結果還顯示，該基因在胎兒脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉等臟器組織中的表達水平較低或不恒定。取胎齡255周的胎兒臟器進行Northernblot檢測也同樣證實了該基因主要表達于胎肝及骨髓組織，而在其它臟器組織中表達陰性，推測可能與下列因素有關：①在胚胎造血過程中，雖然卵黃囊、胎肝或骨髓的HSC可遷移、定植于脾臟、胸腺，但其產生的造血細胞數量遠不如胎肝和骨髓［9］，所以ERMAP基因的表達量較低；②腎臟、心臟、肺臟、大腦及肌肉不是造血器官，缺乏ERMAP的特異性配體，但由于胎兒血液中含有一定數量的HSC，在這些器官或組織中亦可以檢測到ERMAP的低水平表達，但并不恒定。遺憾的是，由于取材條件所限，本研究未能觀察到hERMAP在妊娠9周以前以及36周以后的表達情況，因此未能對胚胎發育全過程的ERMAP基因表達規律作更全面的動態研究。

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