深究組織工程微粒皮膚的構建及其性能

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摘要：目的探索利用人成纖維細胞和York豬脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)微粒復合構建組織工程微粒皮膚的可行性并對其進行初步研究。方法體外培養(yǎng)取自胎背的人成纖維細胞，用PKH26標記，將細胞與ADM微粒復合構建微粒皮膚，用熒光顯微鏡觀察、電鏡觀察和MTT法檢測組織工程微粒皮膚的性能。結果脫細胞真皮基質(zhì)微粒均勻柔軟，彈性、韌性好，三維結構完整且排列規(guī)則。細胞與ADM微粒的復合情況良好，2h后開始黏附，2d后增殖明顯，10d增殖達到高峰；7d時取材，HE和SEM顯示成纖維細胞在ADM微粒表面成層黏附，并分泌大量基質(zhì)；細胞生長良好。結論利用人成纖維細胞和York豬的ADM微粒可以構建具有活性的組織工程微粒皮膚。

關鍵詞：組織工程微粒皮膚脫細胞真皮基質(zhì)成纖維細胞

皮膚是覆蓋與保護體表的重要組織器官。由于炎癥、潰瘍、外傷、燒傷、腫瘤術后及先天性畸形等原因常造成皮膚的缺損與異常。對于這種組織缺損目前多采用自體皮膚移植，這種方法不僅造成供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷，而且經(jīng)常受供皮來源的限制。隨著組織工程技術研究的深入，應用組織工程皮膚修復皮膚缺損是目前皮膚缺損修復研究的熱點之一。脫細胞真皮基質(zhì)(acellulardermalmatrix，ADM)是目前最有應用前景的支架材料，它去除了引發(fā)宿主排斥反應的細胞成分，完整地保留了細胞外基質(zhì)的形態(tài)結構和組成成分，力學性能好，抗原性低，可誘導具有再生能力的成纖維細胞、表皮細胞、血管內(nèi)皮細胞按照應有的組織學方式長入真皮層，其臨床應用效果最好，并且其在體內(nèi)降解吸收與宿主組織改建相一致。筆者在實驗中借鑒燒傷治療中的微粒皮技術，利用改良消蝕法(另文發(fā)表)制備相容性良好的ADM微粒，與成纖維細胞復合構建組織工程微粒皮膚，以期延展組織工程在皮膚缺損修復上的應用前景。

一、材料與方法

1、材料

York豬(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；超凈工作臺(Nuair公司)；CO2孵箱(Nuair公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；低溫高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；培養(yǎng)板(Falcon公司)，；取皮鼓(無錫新達輕工機械有限公司)；恒溫箱(HHS21-4型，上海躍進醫(yī)療器械廠)；掃描電子顯微鏡(TXA-840，日本電子光學公司)；真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；全自動酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司MK3型酶標儀)。

2、新型脫細胞真皮基質(zhì)微粒的制備

取York豬(20kg)新鮮背部皮膚，切成5cm×10cm大小，用取皮鼓反向取皮，去除含豬表皮面約0.3mm厚的皮片；將余下的豬真皮，再用取皮鼓同法于近表皮面取約0.3mm厚皮片，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰蛋白酶消化90min，大量純水沖洗，然后將皮片用4%NaOH溶液消蝕，B型超聲清洗儀間斷振蕩清洗，每隔4h更換消蝕液1次，消蝕18h時將皮片取出，用滴加青、鏈霉素的PBS浸洗24h以上，其間多次換液，直至溶液變?yōu)榍辶粒琾H7.2。最后將皮片放于-80℃冰箱，反復凍融3次，每次4h，使細胞完全破裂崩解。然后置冷凍干燥機凍干，再用物理方法切割成約0.3mm×0.3mm×0.3mm大小的ADM微粒，用PVC袋分裝、60Co照射、無菌保存。取部分材料用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片后常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色和掃描電鏡觀察，觀察ADM微粒的顏色、結構和細胞殘留情況。

3、成纖維細胞的分離培養(yǎng)及擴增

背部皮膚取自合法水囊引產(chǎn)的5月齡男胎，將其切成2mm×5mm的條塊，在4℃下用含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的PBS浸泡沖洗，修剪多余的脂肪和肌肉組織，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰酶4℃消化，機械分離表皮層和真皮層，將真皮層吹散，收獲其中的成纖維細胞，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，用含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)并傳代，取2～9代生長良好的成纖維細胞使用。

4、PKH26標記成纖維細胞

細胞示蹤劑PKH26是親脂性的熒光染料，散發(fā)紅色熒光。它可以與細胞膜不可逆地結合，對細胞進行熒光標記。按文獻所述方法，在nitName="℃">25℃條件下進行，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰酶消化對數(shù)期生長的細胞，制備單細胞懸液，計數(shù)。用PBS洗滌上述單細胞懸液，離心5min，小心吸去上清，加入1ml專用重懸液DiluentC重懸細胞，在染色之前即刻，在另一離心管中配制濃度4×10-6mol/L的PKH26染料。迅速均勻地將1ml重懸細胞液和1ml的染料液相混合，輕輕吹打、混勻，孵育2～5min。加入等量的血清終止反應，放置1min，再加入等量的含血清DMEM。離心，移去上清，將細胞移入新的離心管中，用PBS洗滌3次。加入10mlDMEM洗滌細胞，培養(yǎng)、傳代。在熒光顯微鏡下檢查標記的成纖維細胞染色效果和熒光強度，并觀察細胞的活力。

5、組織工程微粒皮膚的構建

將制備好的ADM微粒用DMEM浸泡24h后，平鋪于12孔板中，以2×106/孔密度加入培養(yǎng)好的2～9代成纖維細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)2周，每天換液，用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，第3、7天取材HE染色，電鏡掃描。同法準備另一鋪好ADM微粒的12孔板，加入同樣濃度PKH26標記的成纖維細胞，培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察細胞在微粒上的黏附、生長情況。

6、細胞增殖檢測

在96孔板中，將成纖維細胞分別按2×103/孔接種在已滅菌處理好的ADM微粒上，加入DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)至100μl，在37℃、體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組直接接種細胞到孔板中，空白對照以100μlDMEM培養(yǎng)液代替細胞懸液接種，隔日換液。接種后第0、2、4、6、8、10、12天用MTT法測細胞在微粒上的增殖情況:先換無血清培養(yǎng)液80μl孵育2h，再加MTT(質(zhì)量濃度5mg/ml)20μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中4h后，棄去孔內(nèi)上清加DMSO100μl，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育10min，待沉淀溶解后在酶標儀上讀取吸光度(A)值，檢測波長570nm。根據(jù)A值繪出增殖曲線。每組56孔，每時相檢測點測8孔，重復4次。

7、統(tǒng)計學方法

對照組和實驗組各時間點A值均采用均數(shù)±標準差表示，利用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keul(SNK)法，設定α=0.05。組間比較采用t檢驗。

二、結果

1、脫細胞真皮基質(zhì)微粒觀察

脫細胞真皮基質(zhì)微粒外觀呈瓷白色，厚度為3000μm左右，表面(乳頭層側)平整光滑(圖1a)，微粒均勻，質(zhì)地柔軟，有彈性，韌性好。鏡下觀察可見膠原纖維稍松散但排列規(guī)則，三維結構完整(封二插圖圖1b)，真皮基質(zhì)內(nèi)未見細胞及細胞碎片存在。掃描電鏡顯示，膠原纖維連續(xù)不斷，相互交織成立體網(wǎng)狀結構，排列整齊，分布均勻，孔隙直徑約20~50μm，孔隙間相互連通(圖1c)。

2、組織工程微粒皮膚的細胞生長情況觀察

成纖維細胞在ADM微粒上2h即可黏附，2d后在微粒上開始增殖，可以看見細胞在微粒上生長良好(封二插圖圖2a)，7d時可見大量成纖維細胞以微粒為核心生長數(shù)層并分泌大量基質(zhì)(封二插圖圖2b)。7d時，在熒光顯微鏡下可見與ADM微粒復合的PKH26標記的成纖維細胞數(shù)量增多(封二插圖圖"0"NumberType="1"Negative="False"HasSpace="False"SourceValue="2"UnitName="C">2c)。電鏡掃描顯示復合7d后，成纖維細胞在ADM微粒上生長伸展良好(圖2d)。

3、組織工程微粒皮膚的細胞增殖情況檢測復合培養(yǎng)2、4、6、8、10、12d時微粒組成纖維細胞的增殖活力比較結果見圖3。由MTT結果可知，10d時組織工程微粒皮膚上的細胞與之前時間段相比增殖明顯(P<0.05)，特別是與2d時的增殖情況相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

三、討論

理想的人工真皮，其內(nèi)部應具有一定孔徑和孔隙率，以利于組織中成纖維細胞和毛細血管的長入，并且在移植后一段時間保持其網(wǎng)狀結構。這樣既具有合適的被吸收率和降解速度，同時，又具有良好的創(chuàng)面黏附性。ADM作為天然的生物材料，保持了細胞外基質(zhì)的主要成分及結構，而脫去了細胞成分，從而最大限度地降低了免疫原性，且有較好的組織相容性，為其應用于創(chuàng)面修復提供了物質(zhì)基礎，并且ADM本身無毒性，其降解產(chǎn)物可被機體吸收，不對機體產(chǎn)生危害；同時，膠原的三維空間結構具有一定的強度，是構建組織工程支架的良好材料。作為永久性人工真皮支架，ADM已應用于臨床，對改善創(chuàng)面的愈合提供了新的選擇。但由于ADM植入創(chuàng)面后血管化速度較慢，移植成分常因血供困難而愈合欠佳或壞死，特別是異種ADM的移植。因此，加速ADM血管化，對提高ADM支架的實用性，有著重要的臨床意義。研究表明，成纖維細胞能夠分泌多種細胞外基質(zhì)和生長因子，誘導表皮細胞、內(nèi)皮細胞增殖，利用成纖維細胞的這種特性，將成纖維細胞種植于人工支架上，可以降低排異反應，增加生物親和性，促進創(chuàng)面肉芽組織生長。Hansbrough等在PGA/PLA網(wǎng)上種植異體成纖維細胞，培養(yǎng)2～3周，網(wǎng)孔中可被融合的成纖維細胞及其合成分泌的基質(zhì)填充，植入創(chuàng)面后易于血管化，適于與網(wǎng)狀皮片復合移植。但當不種植成纖維細胞時，單純的PGA/PLA網(wǎng)血管化較慢，導致重疊移植的網(wǎng)狀皮片壞死。因此，在人工替代物中引入成纖維細胞，可提高生物親和性，加速新生血管形成。這可能與其分泌多種細胞因子、生長因子和細胞外基質(zhì)成分，從而增強真皮替代物的親和性，促進血管化有關。肖仕初等報道，在ADM上種植成纖維細胞構建活性人工真皮，細胞基本上是在表面生長，向支架內(nèi)部生長緩慢。

筆者實驗借鑒燒傷臨床的微粒皮技術，將成纖維細胞種植于自制的一種新型具有良好生物相容性的脫細胞真皮基質(zhì)微粒上，期望能夠獲得一種血漿容易滲透、血管易于長入、應用方便的組織工程脫細胞真皮基質(zhì)微粒皮膚。從實驗中可以看出，種植前2d，成纖維細胞在ADM微粒上能夠較好黏附，但增殖緩慢，之后細胞增殖明顯加快，10d時達到增殖高峰。這一點從細胞增殖曲線和熒光顯微鏡觀察結果也得到了印證。雖然細胞在ADM微粒上的增殖不如直接在培養(yǎng)板上生長，但兩組細胞的增殖活性并沒有統(tǒng)計學差異，這與其他相關報道的結果不完全一致。對HE顯微照片和電鏡照片觀察可見，構建好的組織工程微粒皮膚上成纖維細胞呈多層生長，并分泌大量細胞外基質(zhì)，與天然皮膚的結構相似。綜上所述，筆者在實驗中所構建的微粒皮膚是具有生物活性的組織工程產(chǎn)品，通過進一步的體內(nèi)實驗有望擴展組織工程皮膚的應用范圍。