表觀遺傳學現(xiàn)象范文

導語：如何才能寫好一篇表觀遺傳學現(xiàn)象，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關鍵詞：遺傳性出血性毛細血管擴張癥；肝臟；計算機斷層掃描；血管造影

遺傳性出血性毛細血管擴張癥（Hereditary hemorrhagic telangiectasia， HHT），又稱Osler-Rendu-Weber病，是一種以出血和血管擴張為主要特征的常染色體顯性遺傳的血管發(fā)育異常性疾病。常見受累器官有皮膚、指（趾）、結(jié)膜、口、舌、胃腸道、肺、眼、肝及腦等，最常見的臨床表現(xiàn)是鼻衄和胃腸道出血。以往肝臟受累少有報道，約8%～10%的HHT患者可累及肝臟[1]，近年來更多研究指出HHT患者肝臟受累并不少見，有學者報道肝臟受累率可高達41%～78%[2]。然而許多臨床和影像醫(yī)師因缺乏對本病的認識而誤診。為提高對本病的認識，分析我院6例HHT累及肝臟患者的臨床及影像資料，探討其影像學特征，便于及早正確診斷。

1 資料與方法

1.1病例資料 搜集我院2004年6月～2013年6月經(jīng)HHT的診斷標準確診為HHT的6例患者。女3例，男3例，年齡10歲～47歲，病程2月～17年不等，2例有家族史。HHT診斷采用2000年HHT基金科學顧問委員會臨床診斷標準[3]：（1）反復自發(fā)性鼻出血；（2）多個特征性部位受累，如唇、口腔和鼻粘膜、手指等處；（3）內(nèi)臟受累，如消化道、肺、肝臟、腦等。（4）陽性家族史。具備以上3項者可明確診斷，符合兩項為可疑。

1.2檢查方法 所有患者彩超及多層螺旋CT檢查均在一周內(nèi)完成。腹部CT檢查采用多層螺旋CT（Lightspeed Plus，GE）行螺旋增強掃描。掃描層厚和間隔為5mm，行2.5mm層厚及1.25mm間隔重建；采用300～350mgI/ml非離子型對比劑，總量按1.5ml/kg，注射速度3.5mL/s，動脈期延遲25s，靜脈期延遲80s掃描。原始數(shù)據(jù)傳至ADW 4.3工作站，對所得數(shù)據(jù)行容積再現(xiàn)（volume rendering，VR）、多平面重組（multi-planar reformation， MPR）和最大密度投影（maximum intensity projection，MIP）等多種二維、三維圖像處理技術，以充分顯示病變血管。其中3例另行胸部和腦部CTA掃描，分別延遲18s、15s掃描，其他掃描條件同腹部。其中3例患者另行肝動脈DSA檢查，采用sidinger法插管造影，將導管端置于肝固有動脈和腸系膜上動脈造影。 4例行二維和多普勒超聲檢查。4例患者另行胃腸鏡檢查。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 本組HHT以無明顯誘因乏力、腹脹為主，其他表現(xiàn)為鼻衄、貧血、納差、活動后胸悶、氣喘等。實驗室檢查：RBC（ 0.72～4.80）×1012/L，2例正常，4例表現(xiàn)為不同程度的貧血；血紅蛋白（66～146）g/L，3例偏低，3例正常；6例乙肝標志物均陰性，1例HBcAb陽性。

2.2 CT表現(xiàn) 平掃示2例肝臟增大，2例肝脾增大，肝臟密度不均，內(nèi)可見不規(guī)則灶狀稍低密度影。動脈期示肝實質(zhì)強化不均，內(nèi)散在灶狀、小片狀強化的血池；4例可見肝靜脈及門靜脈增粗并提前顯影，2例單見門靜脈提前顯影，肝靜脈直徑最粗約13.4mm，門靜脈最粗約16.6mm；6例均見肝總動脈及其分支迂曲、增粗，肝總動脈直徑6.8～12.1mm，肝內(nèi)分支增粗、迂曲達肝臟邊緣。3例患者可見肝臟供血動脈的變異：1例肝左動脈起自增粗的胃左動脈，而肝右葉供血的兩支小動脈均直接起自腹腔干；1例肝固有動脈起自腸系膜上動脈；另1例可見起源于右鎖骨下動脈的膈下動脈沿縱隔、心包至膈下向肝臟供血；1例并發(fā)脾動脈瘤；門靜脈期部分病灶持續(xù)強化，同時肝實質(zhì)強化，肝動脈密度減低，門靜脈及肝靜脈顯示更清晰；2例可見肝內(nèi)膽管輕度擴張。以動脈期VR觀察肝動脈總體情況較好；以MIP顯示肝動脈擴張及肝內(nèi)異常強化的血管團最佳；MPR有利于多平面多角度顯示病變。胸部CT掃描發(fā)現(xiàn)3例患者肺血管畸形，但3例腦部CT均無陽性發(fā)現(xiàn)。

2.3 DSA表現(xiàn) 3例均見肝動脈及其分支明顯增粗、迂曲，可見變異血管分支向肝內(nèi)供血。肝實質(zhì)呈彌漫性團塊狀染色，肝靜脈提前顯影。腸系膜上動脈造影顯示門靜脈期向肝性血流，門脈主干及肝內(nèi)分支增粗，部分分支早顯。

2.4 彩色多普勒超聲表現(xiàn) 4例肝大，回聲增強，肝動脈迂曲擴張，CDFI：呈五彩鑲嵌狀彩色血流，流速快，阻力低，呈湍流型頻譜。4例肝靜脈近心端內(nèi)徑增寬，肝實質(zhì)內(nèi)可見團片狀較強回聲結(jié)節(jié)。

2.5 胃腸鏡表現(xiàn) 4例行胃腸鏡檢查均示慢性紅斑性胃炎，其中2例示陳舊性出血性胃底炎。

3 討論

HHT是一種血管壁發(fā)育異常的常染色體顯性遺傳病，遺傳性、血管畸形和出血素質(zhì)三聯(lián)癥為其特征。其分子基礎與Endoglin、ALK l和Smad 4基因突變有關，上述基因突變造成其編碼蛋白在血管內(nèi)皮細胞上表達的單倍劑量不足，缺乏維持正常結(jié)構(gòu)足夠的蛋白，血管壁彈力纖維及平滑肌缺乏，管壁變薄，完整性受損，導致毛細血管擴張、動靜脈畸形和動脈瘤。病變血管可因輕微外力發(fā)生破裂[4]。據(jù)此將其分為3型：HHT 1型通常為Endoglin基因突變所致，HHT 2型和HHT 3型分別為ALK 1和Smad 4基因突變所致[5]。盡管HHT的基因與表型的相關性尚不確定，但研究發(fā)現(xiàn)肺受累者多為HHT1型，而肝臟受累多為HHT2型[6]。

文獻報道肝臟HHT的典型表現(xiàn)是肝內(nèi)血管的異常分流，這種異常分流主要是肝動脈-肝靜脈分流，而肝動脈-門靜脈分流、門靜脈-肝靜脈分流較為少見[7]。但本組病例肝動脈-門靜脈分流更多見，可能與病例數(shù)較少有關。

CT表現(xiàn)為肝動脈顯影的同時門靜脈提前并持續(xù)顯影，其強化程度與動脈類似。以早動脈期顯示為佳。本組4例門靜脈和肝靜脈均提前顯影，提示肝動脈同時向門靜脈和肝靜脈分流。發(fā)生于動脈期的肝臟一過性灌注異常，反映正常肝臟雙重供血和動靜脈瘺分流的變化，被認為是動靜脈瘺的間接征象[8]，表現(xiàn)為邊界清晰的呈葉段或亞段分布動脈期短暫強化，門脈期呈等密度。文獻報道約13% HHT患者可見肝動脈供血變異[8]，本組3例患者顯示異常動脈供血，準確描述肝動脈變異有助于指導肝移植手術方案的制定。本組2例可見輕度膽管擴張，可能由于肝動脈擴張擠壓膽管或肝動脈向靜脈分流導致膽管缺血、壞死甚至肝壞死。本組病例動脈期肝實質(zhì)內(nèi)大小不等的灶狀、片狀強化較門脈期顯示明顯，其病理基礎可能為小的毛細血管擴張和大的融合的血管團[9]。對于HHT累及肝臟的CT表現(xiàn)，以動脈期顯示較佳。 CT血管成像可以多角度觀察清晰顯示肝內(nèi)畸形血管，通過MIP、MPR、VR等重建技術可清晰顯示病變的大小、位置、數(shù)量及其供血動脈、引流靜脈等信息，為臨床治療方案的選擇提供充分依據(jù) 。

彩超可以顯示肝內(nèi)動脈及靜脈情況，發(fā)現(xiàn)動靜脈瘺和血管畸形，能動態(tài)觀測動靜脈和門靜脈血流狀況，且操作方便、無創(chuàng)、方便，適合篩查及定期復查。但其空間分辨率低和整體顯示差，難以提供病變的詳細解剖情況及病灶具置，因而應用價值有限。CT血管成像可以多角度觀察清晰顯示肝內(nèi)畸形血管，通過MIP、MPR、VR等重建技術可清晰顯示病變的大小、位置、數(shù)量及其供血動脈、引流靜脈等信息，為臨床治療方案的選擇提供充分依據(jù)。DSA雖為有創(chuàng)檢查，但對有癥狀HHT病人的血流動力學測定、對出血病人行栓塞治療和肝臟移植術前計劃制定仍是有效的手段。本組2例DSA證實了CT血管成像的診斷。

綜上所述，肝動脈-肝靜脈分流、肝動脈-門靜脈分流、上述分流共存、肝實質(zhì)一過性灌注異常、小的毛細血管擴張、大的血管融合性團塊、肝動脈迂曲擴張、肝動脈解剖變異、門靜脈高壓等是HHT累及肝臟的較特征性CT和DSA表現(xiàn)，結(jié)合臨床表現(xiàn)及家族史，可對HHT做出正確診斷。

參考文獻

[1] Piantanida M， Buscarini E， Dellavecchia C， et a1. Hereditary haemorrhagic telangiectasia with extensive liver involvement is not caused by either HHTl or HHT2[J]. J Med Genet， 1996，33：44l-443

[2] Alonso-Treceno JL， Castaneira I， Escapa-Garrachon JM， et al. Nasal closure as definitive treatment for epistaxis in Rendu-Osler-Weber disease[J]. Acta Otorrinolaringol Esp， 2008. 59： 420-430.

[3] Shovlin CL， Guttmacher AE， Buscarini E， et al. Diagnostic criteria for hereditary hemorrhagic telangiectasia （Rendu-Osler-Weber syndrome） [J]. American Journal of Medical Genetics， 2000， 91： 66-67.

[4] 盧川，劉作勤.遺傳性出血性毛細血管擴張癥的影像學診斷和介入治療研究進展[J].介入放射學雜志，2008，17：290-293.

[5] 秦玲，劉珂，趙小強，等.遺傳性出血性毛細血管擴張癥的臨床研究[J].中國當代醫(yī)藥，2012， 19：55-56.

[6] Kuehl HK，Caselitz M，Hasenkamp S，et a1.Hepatic manifestation is associated with ALKl in hereditary hemorrhagic telangleetasia：identification of five novel ALKI and one novel ENG mutations.[J].Hum Mutat，2005，25：320-327.

[7] 連慶峰，劉學靜，閆欣，等.MSCT血管成像對肝臟遺傳性出血性毛細血管擴張癥的診斷[J].實用放射學雜志，2011，27：1180-1182.

[8] lanora AA，Memeo M，Sabba C，et a1.Hereditary hemorrhagic telangieetasia：multi-detector row helical CT assessment of hepatic involvement [J].Radiology，2004，230：250-259.

篇2

1 DNA甲基化和組蛋白乙酰化

1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA復制以后，在DNA甲基化酶的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子中胞嘧啶殘基的第5位碳原子上，隨著甲基向DNA分子的引入，改變了DNA分子的構(gòu)象，直接或通過序列特異性甲基化蛋白、甲基化結(jié)合蛋白間接影響轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化酶有兩種：一種是維持甲基轉(zhuǎn)移酶；另一種是重新甲基轉(zhuǎn)移酶。

1.2 組蛋白乙酰化 染色質(zhì)的基本單位為核小體，核小體是由組蛋白八聚體和DNA纏繞而成。組蛋白乙酰化是表觀遺傳學修飾的另一主要方式，它屬于一種可逆的動態(tài)過程。

1.3 DNA甲基化與組蛋白乙酰化的關系 由于組蛋白去乙酰化和DNA甲基化一樣，可以導致基因沉默，學者們認為兩者之間存在串擾現(xiàn)象。

2 表觀遺傳學修飾與惡性腫瘤耐藥

2.1 基因下調(diào)導致耐藥 在惡性腫瘤中有一些抑癌基因和凋亡信號通路的基因通過表觀遺傳學修飾的機制下調(diào)，并與化療耐藥有關。其中研究比較確切的一個基因是hMLH1，它編碼DNA錯配修復酶。此外，由于表觀遺傳學修飾造成下調(diào)的基因，均可導致惡性腫瘤耐藥。

2.2 基因上調(diào)導致耐藥 在惡性腫瘤中，表觀遺傳學修飾的改變也可導致一些基因的上調(diào)，包括與細胞增殖和存活相關的基因。上調(diào)基因FANCF編碼一種相對分子質(zhì)量為42000的蛋白質(zhì)，與腫瘤的易感性相關。2003年，Taniguchi等證實在卵巢惡性腫瘤獲得耐藥的過程中，F(xiàn)ANCF基因發(fā)生DNA去甲基化和重新表達。另一個上調(diào)基因Synuclein-γ與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關。同樣，由表觀遺傳學修飾導致的MDR-1基因的上調(diào)也參與卵巢惡性腫瘤耐藥的形成。

3 表觀遺傳學修飾機制在腫瘤治療中的應用

3.1 DNA甲基化抑制劑 目前了解最深入的甲基化抑制劑是5-氮雜脫氧胞苷（5-aza-dc）。較5-氮雜胞苷（5-aza-C）相比，5-aza-dc首先插入DNA，細胞毒性比較低，并且能夠逆轉(zhuǎn)組蛋白八聚體中H3的第9位賴氨酸的甲基化。有關5-aza-dc治療卵巢惡性腫瘤的體外實驗研究結(jié)果表明，它能夠恢復一些沉默基因的表達，并且可以恢復對順柏的敏感性，其中最引人注目的是hMLH1基因。有關地西他濱（DAC）治療的臨床試驗，研究結(jié)果顯示，結(jié)果顯示：DAC是一種有效的治療耐藥性復發(fā)性惡性腫瘤的藥物。 轉(zhuǎn)貼于

3.2 HDAC抑制劑 由于組蛋白去乙酰化是基因沉默的另一機制，使用HDAC抑制劑（HDACI）是使表觀遺傳學修飾的基因重新表達的又一策略。根據(jù)化學結(jié)構(gòu)，可將HDACI分為短鏈脂肪酸類、氯肟酸類、環(huán)形肽類、苯酸胺類等4類。丁酸苯酯（PB）和丙戊酸（VPA）屬短鏈脂肪酸類。PB是臨床前研究最深入的一種HDACI，在包括卵巢惡性腫瘤在內(nèi)的實體腫瘤（21例）Ⅰ期臨床試驗中有3例患者分別有4~7個月的腫瘤無進展期，其不良反應是短期記憶缺失、意識障礙、眩暈、嘔吐。因此，其臨床有效性仍有待于進一步在Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中確定。在VPA的臨床試驗中，Kuendgen等在對不同類型血液系統(tǒng)腫瘤中使用VPA進行了Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果顯示，不同的患者有效率差異甚遠。辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）是氯肟酸類中研究較深入的一種HDACI。其研究表明，體內(nèi)使用安全劑量SAHA時，可有效抑制生物靶點，發(fā)揮抗腫瘤活性。大量體外研究結(jié)果顯示，聯(lián)合使用DNA甲基化抑制劑和HDACI會起到更明顯的協(xié)同作用。

3.3 逆轉(zhuǎn)耐藥的治療 Balch等使用甲基化抑制劑—5-aza-dc或zebularine處理卵巢惡性腫瘤順柏耐藥細胞后給予順柏治療，發(fā)現(xiàn)此細胞對順柏的敏感性分別增加5、16倍。在臨床試驗中，Oki等將DAC和伊馬替尼（imatinib）聯(lián)合使用治療白血病耐藥患者，結(jié)果說明，應用表觀遺傳學機制治療惡性腫瘤確實可以對化療藥物起到增敏作用，并且在一定范圍內(nèi)其療效與體內(nèi)表觀遺傳學的改變呈正比。Kuendgen和Pilatrino等對HDACI和化療藥物的給藥順序進行研究，結(jié)果顯示，在使用VPA達到一定血清濃度時加用全反式維甲酸可增加復發(fā)性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征患者的臨床緩解率，這可能與VPA引起的表觀遺傳學改變增加患者對藥物的敏感性有關。

4 展望

總的來說，應用表觀遺傳學修飾機制治療腫瘤具有良好的應用前景，與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合來逆轉(zhuǎn)耐藥，將給攻克惡性腫瘤等疾病帶來新的希望。

參 考 文 獻

篇3

基因行為有“開關”

基因可以解釋部分隔代遺傳現(xiàn)象，但不能解釋全部。有一種神秘機制，超越基因，在它的作用下，你可能最大限度地與所處環(huán)境相適應，但也可能生病、郁悶或二者兼具。如今，越來越多的科學家相信，這一神秘機制“出軌”，正是肥胖癥等“生活方式病”席卷全球的原因。這就是所謂的“胚胎計劃”現(xiàn)象，即基因與環(huán)境積極互動，使生物盡可能存活。

這種化學變化影響基因行為――在不改變脫氧核糖核酸（DNA）序列的情況下，激活和關閉基因行為或使之低調(diào)發(fā)揮的機制，稱作“表觀遺傳”。每個有生命的生物體都有一個基本的表觀基因組，相當于控制基因功能的“使用手冊”。在整個生命中，生物體通過與環(huán)境互動編輯“使用手冊”，不斷添加或刪除“使用說明”。

環(huán)境影響可遺傳

生物學家長期以來認為，當遇上卵子，原有的表觀遺傳信息將被胚胎刪除。如今，越來越多的證據(jù)表明，在基因本身不發(fā)生任何變化的情況下，環(huán)境對基因產(chǎn)生的影響可代際遺傳。

2006年，美國研究人員發(fā)現(xiàn)，懷孕時吸煙的女性，其孫輩可能患哮喘。通過研究瑞典某農(nóng)村聚居區(qū)19世紀90年代以來的資料，研究人員發(fā)現(xiàn)，青春期以前營養(yǎng)攝入充足的男性，與在饑餓中長大的男性相比，其孫輩患糖尿病幾率高4倍。

上述現(xiàn)象表明，青春期是對外界環(huán)境影響最敏感的階段；而女性的卵子在母體還是胚胎時就已產(chǎn)生。由此推斷：原有的表觀遺傳信息并未在代際傳承間遭“抹殺”，胚胎的DNA中仍存有和卵子形成初期對外部環(huán)境的部分記憶。

英國劍橋大學桑格研究所斯蒂芬?貝克博士說，只要搞清健康組織中的表觀基因組是什么樣，就能知道病變組織的表觀基因組出了什么問題，“從理論上說，這將為研究所有疾病鋪平道路”。

心病來自出生前

最新研究顯示，表觀遺傳因素不僅影響人的身體素質(zhì)，還能誘發(fā)心理疾病。盡管心理疾病具有遺傳性，但單純的基因研究無法做出解釋。

心理學家耶胡達20世紀90年代初在美國開辦了心理診所，專門收治納粹大屠殺幸存者。奇怪的是，病人中數(shù)量最多的并非幸存者本人，而是他們的后代。這些人雖未經(jīng)歷大屠殺，卻也為心理焦慮和情感障礙所困擾。

2001年“9?11”恐怖襲擊給耶胡達的研究提供了機會。直接因“9?11”留下心理創(chuàng)傷的人并沒有預計的那樣多。于是，她把187名“9?11”時正懷孕的女性作為研究對象。她們當時距離爆炸中心非常近，后來均患上了“創(chuàng)傷后應激障礙”。她們的嬰兒出生一年后，壓力激素水平顯示，其心理處于高度焦慮狀態(tài)。

也許有人會說，那些母親因為基因的緣故更容易患上心理疾病，并把這些基因遺傳給下一代，但有一種現(xiàn)象讓我們相信這是“胚胎計劃”所致，即只有“9?11”發(fā)生時離預產(chǎn)期少于3個月的母親，她們的孩子更易產(chǎn)生心理焦慮。”

細胞“失憶”可防病

表觀遺傳學有助于各種疾病的病因研究取得巨大突破，那么如何預防和治療疾病呢？英國心理學家漢森說：“如果要改變肥胖癥的表觀遺傳，父母得在分娩甚至受精前就處于健康狀態(tài)。”漢森建議，從長遠來說，更有效的做法并不是把肌肉松弛的成年人騙進健身房，而是在青春期就養(yǎng)成健康的生活習慣。

如何通過修補表觀遺傳過程預防疾病？漢森和格盧克曼公布的一項實驗顯示，給按照“設計”一定會發(fā)胖的老鼠注射激素，該激素具有欺騙性，會給老鼠身體傳遞“已經(jīng)胖得可以”的虛假信息。老鼠們每天吃高熱量食品，其中未接受激素注射的老鼠迅速發(fā)胖，并患上高血壓和糖尿病；接受激素注射的老鼠則依然苗條。這是全球首例胚胎計劃可被逆轉(zhuǎn)或干預的證據(jù)，在醫(yī)學界轟動一時。

這并不是說，為預防肥胖癥，在孩子剛降生時，父母就要給他們注射激素。但重塑個體、使之與外界環(huán)境更協(xié)調(diào)的可能性的確激動人心。為把可能變成現(xiàn)實，賴克目前把從DNA中刪除表觀遺傳標記列為第一步，之后將試圖“‘說服’細胞放棄它們承載的信息，重新成為干細胞”。

上述設想沒有一項可能在短期內(nèi)用于臨床，但癌癥專家正在研發(fā)一種新藥，刪除基因中的表觀遺傳改變，激活本不該關閉的基因行為。此種藥物可用于白血病等疾病的治療。

篇4

摘要：乳腺癌是女性常見腫瘤，近年來發(fā)病率逐年上升，乳腺癌易感基因1（BRCA1）已經(jīng)證實與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。新輔助化療在乳腺癌綜合治療中的作用已得到廣泛證實，是對非轉(zhuǎn)移性的腫瘤在局部治療前進行的全身性的、系統(tǒng)性的細胞毒性藥物治療。可以顯著降低乳腺癌患者臨床分期，提高患者生存率和生存期限，最常適應于乳腺腫瘤較大或有大量淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，近來新輔助化療逐漸應用于早期乳腺癌患者。有研究報道乳腺癌患者BRCA1 基因表達水平高低與新輔助化療敏感性有關，可以解釋乳腺癌患者接受新輔助化療后有無緩解。

關鍵詞：乳腺癌；新輔助化療；BRCA1 基因

乳腺癌在全世界范圍內(nèi)是最常見的女性腫瘤之一，占所有腫瘤的23%。每年約有1百萬新增病例。美國癌癥社會（American Cancer Society）發(fā)現(xiàn)，乳腺癌死亡率從1990年來一直在穩(wěn)定下降，這得益于早期診斷的出現(xiàn)和越來越規(guī)范的治療體系。乳腺癌在中國大陸地區(qū)女性常見死亡原因中排名第四。隨著乳腺癌的發(fā)病率的提高，年輕女性患者也越來越常見，這可能主要與飲食逐漸西化，久坐的生活方式，生育的延遲以及外界環(huán)境中化學物質(zhì)的污染有關。 1新輔助化療與乳腺癌BRCA1基因甲基化 乳腺癌易感基因（BRCA1）是1990年Hall等發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌發(fā)生有緊密聯(lián)系的一組基因[1]，是主要的乳腺腫瘤易感基因。BRCAl基因定位于17q2l，長約81 Kb。共有24個外顯子，其中第1、4號外顯子不編碼氨基酸，第11號外顯子最長，約3.4 Kb，占整個編碼區(qū)的61％[2]。BRCA1基因突變的乳腺癌患者有獨特的病理學特征和基因表達方式。現(xiàn)在相關研究人員正在對不同人群中乳腺癌患者BRCA1基因突變的范圍進行調(diào)查，我國臺灣地區(qū)的調(diào)查提示BRCA1基因突變與乳腺癌的發(fā)生關聯(lián)不大[3]。BRCA1基因啟動子甲基化被認為是基因表達缺失的機制之一，并且在9~32%的散發(fā)性乳腺癌中有表達。Hsu[4]等發(fā)現(xiàn)BRCA1基因啟動子甲基化在56%的早期散發(fā)性乳腺癌患者中存在。大多數(shù)BRCA1基因甲基化的腫瘤中BRCA1蛋白表達缺失或明顯減少,表明在這些腫瘤中存在表觀遺傳基因沉默。BRCA1基因啟動子甲基化的乳腺癌患者的雌激素受體和基底細胞表型表達下降[5]。 散發(fā)性乳腺癌患者雖然未發(fā)現(xiàn)體細胞BRCA1基因突變，但也存在其他機制導致BRCA1基因的失活[6]。表觀遺傳學修飾所致的基因沉默被認為是腫瘤抑制基因失活的重要機制。啟動子CpG島高度甲基化可致BRCA1表達缺失。表觀遺傳學上BRCA1基因失活和源于BRCA1基因突變者腫瘤中普遍的病理學特征有關。之前有統(tǒng)計證實大約10%的散發(fā)性乳腺癌患者中存在BRCA1基因CpG島區(qū)高度甲基化[7]。表觀遺傳學中BRCA1基因沉默所致的基因變化與BRCA1基因突變腫瘤中觀察到的變化相似。這些發(fā)現(xiàn)證實了表觀遺傳學中BRCA1基因失活在散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。目前還不是很明確表觀遺傳學的失活和BRCA1基因轉(zhuǎn)錄沉默是否與散發(fā)性乳腺癌中的三陰性乳腺癌或基底細胞樣乳腺癌特異性相關，一些研究報道的數(shù)據(jù)提示BRCA1基因表達缺失和三陰性乳腺癌相關，其他亞型則無[8]。 2新輔助化療與乳腺癌BRCA1基因表達 乳腺癌易感基因1（BRCA1）通過轉(zhuǎn)錄伴隨核苷酸切除修復在DNA修復中起著重要的作用。有報道散發(fā)性乳腺癌患者同時存在BRCA1甲基化和BRCA1的mRNA的表達缺失的情況。散發(fā)性乳腺癌患者中軀體BRCA1突變較為少見。然而大約30%的散發(fā)性乳腺癌和70%的卵巢癌患者中BRCA1基因存在表觀遺傳學調(diào)控下降的現(xiàn)象[9]。BRCA1表達能調(diào)節(jié)對化療的細胞應答。臨床乳腺癌研究提示BRCA1在預測對DNA損傷媒介和紫衫類為基礎的化療的應答中起到一定作用。 BRCA1 mRNA表達水平可以作為生存率的最強的預測指標。BRCA1基因在DNA修復中起著至關重要的作用。散發(fā)性乳腺癌BRCA1表達降低與基因突變無關，與BRCA1基因啟動子獲得甲基化及調(diào)控BRCA1基因表達的上游通路異常有關[10]。 BRCA1基因編碼在S期和G2期表達的細胞周期調(diào)控蛋白。在非小細胞肺癌中，患者生存率較低可能與BRCA1基因過度表達相關。在散發(fā)性乳腺癌中，BRCA1基因表達下降或缺失與腫瘤等級高，淋巴結(jié)分期高，腫瘤較大，侵襲血管，雌激素受體陰性，孕激素受體陰性及結(jié)局不好相關。BRCA1基因起著多功能的作用，在很多正常細胞功能中都有涉及。因此，功能性BRCA1基因表達缺失可能對化療的細胞應答有重要影響，尤其對用DNA損傷介質(zhì)處理的患者可能有預測價值。 3展望 乳腺癌對新輔助化療的應答與生存率息息相關。從新輔助化療獲得最大生存獲益的患者即對新輔助化療完全應答。我們使用蒽環(huán)類藥物治療后BRCA1 表達水平作為疾病進展時間和總生存率的標記物,研究提示BRCA1 mRNA表達水平較低的散發(fā)性乳腺癌患者可能從蒽環(huán)類藥物為基礎的化療中得到最大獲益。一部分散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1表達較低下，使用以DNA損傷為基礎的化療藥物后，BRCA1基因突變攜帶者與BRCA1基因未突變攜帶者相比更可能達到病理完全緩解。使用以鉑類為基礎的化療藥物后，BRCA1 mRNA表達較低的散發(fā)性卵巢癌患者較BRCA1 mRNA表達較高患者有更長的生存期。 參考文獻： [1]Watanabe Y,Maeda I,Oikawa R,et al.Aberrant DNA methylation status of DNA repair genes in breast cancer treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Genes Cells,2013,45（4):89-95. [2]Alili C,Pages E,Curros Doyon F,et al.Correlation between MR imaging-prognosis factors and molecular classification of breast cancers[J].Diagn Interv Imaging,2014,95(2):235-242. [3] Raphael J,Mazouni C,Caron O,et al.Should BRCA2 mutation carriers avoid neoadjuvant chemotherapy[J].Med Oncol,2014，31(3):850-855. [4] Mulligan JM,Hill LA,Deharo S,et al.Identification and validation of an anthracycline/cyclophosphamide-based chemotherapy response assay in breast cancer[J].J Natl Cancer Inst,2014，106(1):335-342. [5]Rovera F,Chiappa C,Coglitore A,et al.Management of breast cancer during pregnancy[J].Int J Surg,2013,11(4):64-68. [6]Badora A,Kaleta B,Nowara E,et al.Multiple primary malignancies in BRCA1 mutation carriers--two clinical cases[J].Ginekol Pol,2013，84(10):892-896. [7] Huszno J,Budryk M,Ko?osza Z,et al.The influence of BRCA1/BRCA2 mutations on toxicity related to chemotherapy and radiotherapy in early breast cancer patients[J].Oncology,2013，85(5):278-282. [8] Ratanaphan A.A DNA Repair BRCA1 Estrogen Receptor and Targeted Therapy in Breast Cancer[J].Int J Mol Sci,2012,13(11):14898-14916. [9] von Minckwitz G, Martin M. Neoadjuvant treatments for triple-negative breast cancer(TNBC)[J].Ann Oncol,2012,32(5):35-39. [10]Sousa B,Cardoso F.Neoadjuvant treatment for HER-2-positive and triple-negative breast cancers[J].Ann Oncol,2012,23(4):237-242.編輯/許言

篇5

關鍵詞：DNA甲基化，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，CpG島，腫瘤

引言

基因組表觀遺傳學是相對于傳統(tǒng)的遺傳學而提出的一個概念，其研究的不是基因序列的改變，而是研究基因組的修飾變化所引起的基因表達改變。這種修飾是可遺傳的，可對生物體產(chǎn)生長期效應[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學的一個重要研究內(nèi)容，是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成的，主要包括DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。研究表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）缺陷而引起的基因表觀遺傳改變往往伴隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文綜述了近年DNMTs在腫瘤中的研究進展。

1 DNA甲基化現(xiàn)象

DNA甲基化是哺乳動物基因組最常見的修飾方式。它是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化下，以甲硫氨酸為供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第五個碳原子上。DNA甲基化是一個可逆的過程，在體內(nèi)同時存在著主動或被動的去甲基化過程。

2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）

DNA甲基化修飾是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成的。目前為止，在哺乳動物體內(nèi)主要存在三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，分別命名為DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。其中，DNMT 3又分為DNMT 3A和DNMT 3B兩個亞型。DNMT 2，雖然具有與其他的DNMT同源的序列，并且能夠甲基化小的tRNAs，但是目前通常認為它不是DNA甲基化酶。

2.1 DNMT 1

DNMT 1是第一個被克隆出來的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。它由N-端的調(diào)節(jié)區(qū)，C-端的催化區(qū)組成，該酶的催化能力需要N-端和C-端的相互作用。但也有研究表明，DNMT1的半胱氨酸富集區(qū)可與未甲基化的CpG島作用。這說明除了催化區(qū)域外，DNMT1的其他結(jié)構(gòu)域與酶的活性有重要關系。DNMT 1可以維持基因組中的全部甲基化。一般認為，它主要負責在DNA復制的過程中保持原來的DNA甲基化狀態(tài)。也就是說母鏈模板上某個位置的胞嘧啶被甲基化，在DNA復制時，DNMT 1就會識別這種半甲基化，催化子鏈相應位置的胞嘧啶發(fā)生甲基化。

2.2 DNMT 3

DNMT 3A和DNMT 3B都是由N-端的調(diào)節(jié)區(qū)，C-端的催化區(qū)組成，其C-端不需要與N-端相互作用就可以有催化活性，有很強的重新甲基化能力也具有保持甲基化的能力。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，小鼠生殖細胞中存在新的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3C。DNMT3C表現(xiàn)出與DNMT3B的高度一致性，并且專攻新的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化。除上述對哺乳動物的DNA甲基化必不可少的酶外，DNMT家族還包括另外兩個成員，DNMT2和DNMT3L。DNMT3L沒有催化活性，起調(diào)控作用，以DNMT3L-DNMT3A異四聚體的形式促進胞嘧啶殘基甲基化。

2.3 DNMTs在腫瘤中的作用

近年來，DNA甲基化和人類疾病，尤其是和腫瘤之間關系引起研究人員的關注。許多研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化模式的改變導致了腫瘤的發(fā)生。在很多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)DNMTs的表達異常。這說明DNMTs在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。通過研究者對DNMTs損傷病人樣本的研究，發(fā)現(xiàn)DNMTs的異常與腫瘤發(fā)展之間存在一定的關系。DNMTs的異常主要可分為三類：表達異常，突變和缺失。

2.3.1 DNMTs表達異常

在眾多研究發(fā)現(xiàn)，DNMT表達異常可導致癌癥的發(fā)生。DNMTs（DNMT1，DNMT3A，DNMT3B）的過表達導致某些基因高度甲基化和致癌因子激活。在實體瘤中，DNMT1過表達導致病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后不良。在大量的患有腫瘤的病人樣本中發(fā)現(xiàn)DNMT3A或者DNMT3B高度表達，在肝細胞中，高表達的DNMT3A具有致癌作用[2]。DNMT3B和CTCF高表達對乳腺癌中的 BRCA1 失活至關重要[3]。此外，在某些腫瘤中也出現(xiàn)DNMTs表達降低的現(xiàn)象。如Cao等在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，DNMT3A表達量明顯下降。這些研究說明，DNMTs的表達異常和腫瘤密切相關。

2.3.2 DNMTs 突變

體細胞的DNMTs突變是許多腫瘤的顯著特征，并且能夠?qū)е履[瘤的惡性轉(zhuǎn)化[4]。在癌癥基因組中發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中，DNMT1 失活引起的突變導致全基因組的甲基化狀態(tài)改變[5]。在血液惡性腫瘤中存在DNMT3A突變。急性骨髓白血病（AML）和骨髓異常增生癥（MDL）中DNMT3A頻繁地突變[6]。此外，DNMT3A突變，特別是催化區(qū)域的突變會大幅降低酶活性[6]。這些研究表明突變的DNMTs在破壞基因組甲基化以及在腫瘤的形成中扮演著重要的角色。

2.3.3 DNMTs 缺失

研究發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠中敲除DNMT3A后，誘發(fā)了造血干細胞的擴散[6]。此外DNMT3A缺失導致T細胞淋巴瘤和肺部腫瘤的發(fā)展。這些結(jié)果暗示DNMT3A可能作為腫瘤的抑制基因。還有研究表明，DNMT1有助于維持甲基化，缺失會導致DNA去甲基化，DNMT1對細胞淋巴瘤預防和維護是至關重要的。因此，DNMTs基因的缺失參與腫瘤的發(fā)展。

3 結(jié)語

DNA甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。DNMTs的表達異常，是腫瘤細胞的一個特征。因此DNMTs有望成為研發(fā)治療癌癥藥物的靶點。另外，基于某些基因在腫瘤的發(fā)展進程中的重要作用，這些基因所具有的甲基化的特性則為腫瘤的診斷和治療提供新的方向。

參考文獻（References）

[1]Pechalrieu D. DNA methyltransferase inhibitors in cancer： From pharmacology to translationalstudies

[2]Zhao Z. Depletion of DNMT3A suppressed cell proliferation and restored PTEN in hepatocellular carcinoma cell

[3]Cai FF. Pyrosequencing quantified methylation level of BRCA1 promoter as prognostic factor for survival in breast cancer patient

[4]Baylin SB. A decade of exploring the cancer epigenome - biological and translational implications

[5]Vafadar-Isfahani N. ，Decoupling of DNA methylation and activity of intergenic LINE-1 promoters in colorectal cancer

篇6

關鍵詞　遺傳學實驗　教學創(chuàng)新　開放式教學　實驗管理

中圖分類號：G423　文獻標識碼：A

現(xiàn)代生命科學以及由此衍生出的生物技術和生物工程與基因都發(fā)生著絲絲縷縷的聯(lián)系。遺傳學正是研究基因的科學。遺傳學基礎理論的發(fā)展和應用研究，已使工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等相關領域發(fā)生了巨大變革。隨著新技術、新方法的出現(xiàn)，遺傳學的研究內(nèi)容也正發(fā)生著深刻的變化，并導致社會對人才的基本素質(zhì)提出了更高的要求。作為人才培養(yǎng)搖籃的高等教育，怎樣適應學科發(fā)展的需要，在生命科學領域培養(yǎng)出創(chuàng)新型人才，是高等教育工作者一直在思考的問題。

遺傳學實驗教學作為理論教學的補充，不僅能驗證教材上抽象的理論，輔助學生掌握知識，還可以訓練學生動手能力和創(chuàng)新思維，可以有效地調(diào)動學生學習積極性。而傳統(tǒng)的《遺傳學》實驗教學中存在著一些共有的問題：經(jīng)典驗證性實驗多，探究性實驗少，不能滿足學生掌握新技術、新方法的要求；實驗課和理論課脫節(jié)，教學評價體系不合理。0此外，由于遺傳學實驗自身的特點，部分實驗需要持續(xù)很長時間，但由于課堂教學時間和教學條件的限制不能開展。因此，如何利用有限的課時安排合理設計遺傳學實驗教學內(nèi)容，打破傳統(tǒng)的封閉式教學模式，建立科學合理的實驗評價體系，是從事遺傳學教學實驗教師一直都努力試圖解決的問題。

基于以上考慮，筆者在開展遺傳學教學和實驗室管理的過程中，逐步改革教學內(nèi)容和教學模式，將課堂四十五分鐘改為課堂與課外相結(jié)合，通過幾年的實踐總結(jié)了一些心得，在此與大家分享。

1　新時期遺傳學實驗教學的特點

遺傳學中學科滲透和交叉現(xiàn)象很普遍，這也體現(xiàn)在遺傳學實驗中。如果把生命科學的課程體系比喻為一棵大樹，遺傳學就是這棵大樹的主干之一。由于化學、物理學、計算科學等內(nèi)容的滲入，現(xiàn)代遺傳學已經(jīng)衍生出了發(fā)育生物學、分子生物學、基因組學、生物信息學、基因工程等學科。在現(xiàn)代生命科學專業(yè)課程設置中，一般都會設置相關課程，這些課程都和遺傳學存在聯(lián)系，也與遺傳學教學內(nèi)容知識點存在交叉。因此，遺傳學實驗項目的設置極易與其它課程出現(xiàn)“撞車”現(xiàn)象。比如：有絲分裂和減數(shù)分裂在細胞生物學實驗中也可以開設：植物DNA提取實驗在分子生物學實驗中也可以開設。一旦“撞車”出現(xiàn)，不僅耽誤學生學習，浪費課時，還會讓學生在不斷地重復中對課程產(chǎn)生厭倦，覺得該課程可有可無，失去學習興趣。避免與其它課程實驗重復，既保證學生在有限的課時學到最多的知識，也能最大程度訓練學生的動手能力。

實驗持續(xù)時間長是遺傳學實驗教學的另一個特點。與生物學中的其它學科的實驗不同，遺傳學實驗中有很大部分是需要通過長時間培養(yǎng)實驗材料，中間過程持續(xù)觀察才能完成的，比如果蠅雜交實驗和生活史觀察實驗、植物有性雜交實驗。與此相矛盾的是，實驗教學安排的時間相對分散，每次課時間很短，在教學管理上教務管理部門也要求教師在指定時間完成實驗教學，這就限制了一些實驗項目的開設。

遺傳學是一門飛速發(fā)展的學科，不斷有新知識、新技術補充到遺傳學中。比如，在傳統(tǒng)教材中不涉及基因組學的內(nèi)容，而最近20年，基因組學已經(jīng)成為遺傳學的重要組成部分。除此之外，發(fā)育遺傳學、行為遺傳學、反向遺傳學、表觀遺傳學和生物信息學等分支學科的內(nèi)容也不斷補充到了遺傳學教材中。在理論課講述這些最新知識的同時，實驗課怎樣保持和理論課一致，怎樣為學生提供消化這些知識的動手機會?針對這一特點，要求在開設遺傳學實驗時，應隨時跟蹤學科最新進展，設計和更新實驗項目，或者發(fā)動學生自主設計實驗鞏固書本知識。

2　遺傳學實驗開放式教學內(nèi)容取舍的原則

遺傳學實驗項目的選擇，首先應兼顧理論性與實踐性、基礎與應用、經(jīng)典與現(xiàn)代這幾對矛盾。遺傳學是理論性和實踐性都很強的學科，實驗安排時應根據(jù)本專業(yè)培養(yǎng)目標和學生實際情況，合理安排基礎性實驗與應用性實驗，并適當設計一些新的實驗。對于重點院校的學生，應加強理論性實驗，鼓勵學生自主設計實驗驗證某一結(jié)論。而應用型人才培養(yǎng)的學校則應當偏向應用性、實踐性實驗項目的開設，以滿足學生畢業(yè)后進入工作崗位后的動手需求。

遺傳學實驗項目確定應考慮其它實驗課程，避免教學內(nèi)容沖突。在實驗項目的選擇上，我們對以前安排的實驗內(nèi)容進行了重新編排，比如：“植物DNA提取”、“隨機擴增多態(tài)性分析”等在《分子生物學》課程里會涉及到的實驗內(nèi)容在遺傳學實驗里就大膽地放棄，讓學生在《分子生物學》實驗里完成，而在遺傳學實驗中則加入RFLP驗證孟德爾遺傳定律的內(nèi)容，直接將分子生物學實驗結(jié)果引入遺傳學分析中，既驗證了孟德爾遺傳定律，也讓學生初步認識了分子生物學在遺傳學中的應用。對于有絲分裂和減數(shù)分裂的觀察，《細胞生物學》實驗也會涉及到，但兩門課觀察的重點不同，細胞生物學側(cè)重觀察染色體結(jié)構(gòu)，而《遺傳學》實驗側(cè)重染色體行為及分裂時期的觀察，這樣的實驗在開設時應向?qū)W生講明觀察重點，并且與《細胞生物學》實驗課協(xié)調(diào)，將兩個內(nèi)容合并在遺傳學實驗中開出。

打破時間和空間限制。遺傳學實驗中有部分實驗持續(xù)時間長，很難僅靠課堂時間完成實驗，也不利于安排實驗。以前在安排此類實驗時，受多種因素的限制，一般都不予開設。實驗室開放對提高學生的實驗操作技能、切實開展綜合性或設計性試驗項目、推動并幫助學生開展科研和畢業(yè)設計成效顯著，是培養(yǎng)學生實踐動手能力和創(chuàng)新精神的有效途徑。所以我們在教學中考慮將傳統(tǒng)的課堂實驗和開放實驗相結(jié)合。開放性實驗適合于周期比較長的實驗，比如果蠅大實驗中，教師在課堂上以多媒體的形式充分講解了實驗要求及注意事項后，讓學生領取果蠅瓶，課外自己收集和培養(yǎng)果蠅，隨時可以觀察果蠅的生活史。這個過程既培養(yǎng)了學生的觀察習慣和動手能力，也使學生對作為遺傳學研究重要材料的果蠅的接觸更充分，觀察更仔細，讓學生對遺傳學研究材料和方法產(chǎn)生了濃厚的興趣。

3　遺傳學實驗開放式教學的實施與實驗室管理

驗證實驗是課堂教學的補充，便于學生理解課堂抽象的知識。然而，由于驗證性實驗驗證的理論、方法、步驟及結(jié)果都是已知的，使實驗教學過程變成教師照本宣科講述，學生機械地模擬重復的過程，造成學生實驗積極性不高，對實驗結(jié)果的成敗不重視，盲目的承認失敗甚至篡改實驗數(shù)據(jù)以求相符。設計性實驗可以訓練學生的思維能力和動手能力，讓學生學會獨立開展工作。一些報道強調(diào)驗證性實驗過多，難以提高學生的創(chuàng)新能力，應加大綜合性、設計性實驗的比例。而宋興舜等則認為應將驗證性實驗與設計性實驗有機結(jié)合。0在以 前的實驗教學安排中，設計型實驗由于內(nèi)容分散，管理麻煩，是大家不愿觸及的方面。如何在有限的課時里兼顧鞏固知識和能力訓練，在安排實驗內(nèi)容的時候需要深思熟慮。為適應學科的快速發(fā)展，在遺傳學實驗教學中，必須強化教師的開放式教學理念，強化學生的動手實踐和自主創(chuàng)新意識。從課堂教學和課外研究兩個方面，通過對實驗教學觀念開放、教學內(nèi)容開放、實驗室和實驗時間開放、教學方法和手段開放等進行分析，探討開放式教學在遺傳學實驗中的應用。。

基于以上考慮，筆者在教學過程中逐步安排了一些開放性驗證實驗和設計性實驗，比如植物染色體觀察的實驗，要求學生獨立選材，同學之間選材不能相互重復，做到實驗項目的選材開放；實驗開始前獨立設計方案，方案內(nèi)容應包括水培獲得新生根尖、材料前處理過程、染色方法的選取、壓片過程、觀察和拍照等步驟，每一步驟都應有詳細說明，實驗方法的選擇上保持開放：方案設計完成經(jīng)老師同意后，完成一個植物材料的染色體裝片制備并提交染色體圖，實驗過程開放。這些實驗過程均要求學生在課堂以外自由安排時間完成。經(jīng)過幾年的實踐，結(jié)果發(fā)現(xiàn)85以上％的學生能獨立完成實驗，70％以上的學生需要反復多次才能完成任務。在實驗過程中，動手能力強的同學還能將這一實驗與染色體核型分析實驗結(jié)合，提交核型分析圖。通過該部分設計性實驗操作，學生在觀察了不同物種具有不同的染色體的同時，學會了查閱文獻的方法和工作方案的制訂，認識了教材中選取蠶豆或洋蔥作為染色體觀察材料的原因，認識到要完成一張效果良好的染色體裝片的艱難。對實驗教師來說，這種發(fā)散式的教學方法，也積累了很多植物材料的細胞遺傳學操作的知識，為以后改進實驗奠定了基礎。很多學生反映類似的開放性實驗時間可自由安排，實驗過程可放開思維，進入實驗室操作學會了一些基礎的科研技能。此外，還認識到了實驗準備的艱辛，更珍惜以后的實驗機會了。

在實驗教材中將果蠅實驗分為果蠅生活史、果蠅雜交和果蠅唾腺染色體制備等幾個獨立實驗。我們改進后的實驗則以果蠅為主線，要求學生從野生型果蠅的收集到生活史觀察再到唾腺染色體制備融合為一個大實驗，要求學生在實驗教材所提供知識的基礎上，在規(guī)定時間內(nèi)完成實驗內(nèi)容，而將雜交實驗和孟德爾遺傳定律的驗證實驗改用其它實驗材料來完成。

不可否認的是，將部分遺傳學實驗從課堂移到課外增加了任課教師和實驗室工作人員的工作量，在管理上開放性實驗也增加了難度。開放式實驗教學要求教師在課外時間也要進入實驗室指導，實驗室經(jīng)常處于開放狀態(tài)，實驗儀器設備和藥品的使用管理能在一定程度上放開。在實際操作中，我們采用教師網(wǎng)上答疑和在指定時間指導相結(jié)合的方式對學生進行輔導。在實驗室管理上，試劑方面控制關鍵藥品的使用，常規(guī)藥品可以適當放開，對一些配制難度較大的溶液統(tǒng)一配制；對顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)的使用則采取專人負責制，保證儀器的安全。而水培實驗和果蠅飼養(yǎng)實驗等內(nèi)容則允許學生將材料帶回宿舍，便于學生隨時觀察。

4　開放式實驗教學的考核指標體系

實驗教學考試方法的改革作為實驗教學改革的重要內(nèi)容之一，是當前教學改革中值得深入研究與實踐的問題。以前實驗考核的方式主要以實驗報告為主，針對這樣的考核方式，學生常出現(xiàn)相互之間抄襲，作業(yè)敷衍的現(xiàn)象，既不能反映學生實驗的真實水平，考核指標也比較單一。針對這些問題，結(jié)合我們的開發(fā)性實驗，我們重新制訂了實驗成績評價標準，經(jīng)過我們設計改進后的實驗考核主要包括驗證性實驗考核和開放性實驗考核兩部分。驗證性成績的記錄擯棄了以前單純看實驗報告打分的情況，在實驗中對實驗結(jié)果提出規(guī)定要求，課堂上實時檢查并記錄學生的實驗結(jié)果，要求學生立即在實驗結(jié)果欄描述結(jié)果并由教師及時確認，防止課后抄襲。對實驗原理、實驗步驟等內(nèi)容也杜絕抄襲課本，要求用自己的語言表述。每次實驗結(jié)束后均布置思考題，啟發(fā)學生動手之后學會思考，發(fā)掘問題。在開放性實驗部分，教師將實驗設計方案納入評分范圍，實驗進行過程中記錄平時成績，對實驗結(jié)果不做硬性要求，但可作為評分參考。

在平時實驗成績記錄之外，還單獨設計了期末實驗考試。期末實驗考核采取開放式考核，擬定考試題目范圍，讓學生獨立設計實驗步驟，獨立實驗，在規(guī)定時間內(nèi)獨立完成詳盡的實驗報告。這些評分方式考查了學生搜集資料，獨立開展項目的能力。這樣的考試既靈活，也發(fā)揮了學生的主觀能動性，更訓練了學生的科研思維，為以后進入研究崗位奠定基礎。

5　結(jié)束語

篇7

NATs作用方式

NATs在生理以及病理過程中起重要作用,作用機理包括:基因組印記(genomicimprinting)、選擇性剪切、X染色體失活、mRNA穩(wěn)定性維持、翻譯調(diào)節(jié)、RNA輸出、DNA甲基化以及組蛋白修飾等[20]。基因組印記是一種是由親本來源不同而導致等位基因表達差異的一種表遺傳現(xiàn)象。這類印記基因約占基因組基因的1%,是哺乳動物和顯花植物的獨特現(xiàn)象。大部分印記基因都分布在印記基因簇內(nèi),其中包含大量的非編碼RNA基因[21]。NATs還參與發(fā)育過程調(diào)控,對各種應激的適應和對病毒感染的響應[22]。NATs通過直接的反義–正義RNA相互作用,或通過編碼與正義RNAs共表達的蛋白來調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄物,從而調(diào)控正義RNAs的編碼潛能[23]。反義轉(zhuǎn)錄物對正義轉(zhuǎn)錄物的影響表現(xiàn)在以下兩個方面[24]:(1)不一致調(diào)節(jié)或反饋調(diào)節(jié),反義轉(zhuǎn)錄物通過負性調(diào)節(jié)方式沉默或抑制同源正義RNAs或蛋白質(zhì);(2)一致調(diào)節(jié)或正反饋調(diào)節(jié),正義和反義轉(zhuǎn)錄物共表達,反義轉(zhuǎn)錄物增加了正義RNAs水平或相應蛋白質(zhì)水平[25]。

負反饋調(diào)節(jié)負反饋調(diào)節(jié)指反義轉(zhuǎn)錄物濃度下降導致正義轉(zhuǎn)錄濃度增加(圖2)。例如在某些情況下為了刺激新生血管形成[26],通過G蛋白偶聯(lián)受體CD97靶向其編碼的反義配基DDX39最終獲得增強的信號[4]。P15(CDKN2B)是一個腫瘤抑制因子,與正常淋巴細胞相比,白血病淋巴細胞含有較高濃度的p15反義轉(zhuǎn)錄物,但是p15本身濃度卻很低,提示在白血病中p15與其反義轉(zhuǎn)錄物水平呈負相關[25]。這些結(jié)果提示,NATs的上調(diào)也許與腫瘤抑制基因非正常沉默密切相關,NATs可能通過相似方式又影響了其他基因。

正反饋調(diào)節(jié)正反饋調(diào)節(jié)方式是指:①單獨靶向反義RNA導致正義mRNA下調(diào);或②反義RNA和正義RNA同時下調(diào),從而使常規(guī)的正義基因表達被附帶或協(xié)同下調(diào)(圖2)。轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2在神經(jīng)干細胞分化成寡樹突膠質(zhì)細胞系中起重要定向作用。研究表明,Nkx2.2的NAT過表達促進Nkx2.2mRNA水平適度增加,并增強了神經(jīng)干細胞向寡樹突膠質(zhì)細胞系的分化的潛能[27]。參與對低氧分壓的適應的缺氧誘導因子(HIF-1)是一個異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,其亞基HIF-1a在非狀透明細胞腎腫瘤中高表達,同時HIF-1a的NAT表達也上調(diào)[28]。Wrap53是p53的反義轉(zhuǎn)錄RNA,它可以靶向5′非翻譯區(qū),從mRNA和蛋白水平上增加內(nèi)源性p53表達[29]。Liu等[30]發(fā)現(xiàn)了幾個在早期成骨細胞分化中的NATs,這些NATs增強了干擾素誘導跨膜蛋白5(IFITM5)的表達和成骨細胞分化。鑒于這些正反饋調(diào)節(jié),NATs被認為可能是一個潛在的治療多種疾病的藥物靶點。

NATs作用機制

NATs可能通過直接的與正義轉(zhuǎn)錄物相互作用,或通過對mRNA轉(zhuǎn)錄、突變、運輸和翻譯等靶點的影響來調(diào)節(jié)基因表達[20,27]。NATs的調(diào)節(jié)作用以雙鏈RNAs為基礎,其作用機制包括RNA編輯[31]、RNA干擾[32]、RNA封閉[33]和轉(zhuǎn)錄干擾[34]等。在某種生理刺激下,NAT的啟動子也有一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[35],一些NATs和他們相應的正義轉(zhuǎn)錄物有可能互相競爭結(jié)合相同的轉(zhuǎn)錄因子,提示NATs和他們的正義轉(zhuǎn)錄物能共表達或成反比表達[36]。此外,DNA甲基化和/或組蛋白修飾也參與了基因表達調(diào)節(jié)[37]。因此,NATs與DNA甲基化和組蛋白修飾之間可能存在直接的聯(lián)系。

RNA編輯靶向核編碼RNA和病毒RNA雙鏈區(qū)域的腺嘌呤脫氨酶(ADARs)是一類RNA編輯酶。這些酶在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,可通過改變mRNA中的密碼子,使基因組中編碼信息多樣化。ADARs在已知底物中的功能提示這些酶通過多種方式微調(diào)和優(yōu)化很多生物通路。

RNA干擾反義RNA能夠影響mRNA生物轉(zhuǎn)化的最早期過程,包括調(diào)控染色體結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄起始和剪切等。在血管平滑肌細胞中,RNA干擾介導的一氧化氮合酶反義mRNA(sONE)的下調(diào)增加了內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)的表達。內(nèi)皮細胞中,過表達的sONE削弱了eNOS表達。結(jié)果提示,sONE參與了轉(zhuǎn)錄后eNOS的調(diào)節(jié)[27]。

RNA封閉RNA封閉就是由于反義RNA與正義RNA配對形成雙鏈,封閉了正義轉(zhuǎn)錄物(pre-mRNA)的剪切位點,使pre-mRNA發(fā)生選擇性剪接改變,或抑制了反式作用因子與pre-mRNA結(jié)合,最終導致靶mRNA運輸、翻譯抑制或降解。

轉(zhuǎn)錄干擾轉(zhuǎn)錄干擾是由于NATs在轉(zhuǎn)錄時,正義—反義RNAs雙鏈(dsRNAs)上的兩個RNA聚合酶Ⅱ發(fā)生聚集碰撞而引起的。在簡單的真核生物中,例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),在基因及其調(diào)控元件之間由于相互擠壓碰撞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄干擾是不可避免的[34]。

DNA甲基化DNA甲基化發(fā)生在CpG島,并且通過頭甲基化酶(DNMTs),例如DNMT3A和DNMT3B來甲基化[38]。Dnmt1以半甲基化DNA為底物來維持DNA甲基化。腫瘤的表觀遺傳標志物在總體基因組DNA中低甲基化,而在腫瘤抑癌基因中超甲基化[39]。但是,起始和協(xié)助DNA甲基化的機制還很不清楚。Imamura等[40]報道鞘氨醇激酶1(Sphk1)的NAT過表達誘導CpG島去甲基化,而在正義鏈3′非CpG位點重新甲基化。在遺傳性地中海貧血中血紅蛋白a2(HBA2)能指導CpG島甲基化[41]。NAT介導的CG去甲基化和非CG甲基化提示這可能是表觀遺傳的一個新機制[10]。

組蛋白修飾組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、小泛素相關修飾和糖基化。不同修飾方式相結(jié)合導致基因活化或基因抑制[42-43]。組蛋白乙酰化和甲基化也許對DNA修復和基因轉(zhuǎn)錄有直接的影響。通常,組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HACs)和組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDACs)介導的組蛋白乙酰化是一個基因活化的標志[39,44]。組蛋白甲基化由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)。組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)的單、雙和三甲基化與轉(zhuǎn)錄活化密切相關,然而組蛋白H3第9位賴氨酸(H3K9)的雙和三甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制密切相關[45]。而且,組蛋白H3第20位賴氨酸甲基化與轉(zhuǎn)錄也密切相關[46]。Xist基因與X染色體失活有著密切關系,在啟動子區(qū)域,Xist基因反義轉(zhuǎn)錄物Tsix通過募集組蛋白修飾蛋白復合物可以使Xist失活[47]。在H3K4細胞中P15的反義轉(zhuǎn)錄物通過增加H3K9的二甲基化和減少H3K4二甲基化來下調(diào)P15。在啟動子區(qū),正義和反義轉(zhuǎn)錄物之間的雙向結(jié)構(gòu)的形成可能直接或間接的促進或抑制組蛋白–修飾蛋白復合物的結(jié)合。因此,NATs和組蛋白修飾之間的相互作用也為表觀遺傳學提供了新的機制。NATs和DNA甲基化,NATs和組蛋白修飾以及DNA甲基化與組蛋白修飾之間的密切關系均已被發(fā)現(xiàn)。在基因啟動子區(qū)CpG島的超甲基化引起了局部組蛋白的去乙酰化。H3K4的去甲基化與啟動子甲基化相關,然而低乙酰化誘導了DNA甲基化[48]。因此,在基因調(diào)節(jié)過程中,不同種類的表觀遺傳修飾緊密聯(lián)系而且協(xié)同作用。

NATs與疾病

NATs與腫瘤據(jù)報道在腫瘤中,大部分基因組發(fā)生了去甲基化,轉(zhuǎn)錄噪音增加可能引起反義轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生,反義轉(zhuǎn)錄物進而影響關鍵抑癌基因功能,最終導致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。Orfanelli等[49]在黑素瘤TRPM2位點發(fā)現(xiàn)一種新型的正義TRPM2-TE和反義轉(zhuǎn)錄物TRPM2-AS。在黑素瘤中TRPM2-TE和TRPM2-AS表達上調(diào),而且他們的活化與CpG島甲基化狀態(tài)有關。TRPM2-TE敲除和野生型TRPM2一樣增加了黑素瘤對凋亡和壞死的易感性。缺氧誘導因子1(HIF-1)的一個反義轉(zhuǎn)錄物aHIF已經(jīng)被證明在正常人組織中廣泛表達[50],在腎癌中由于vhl基因突變引起aHIF永久性的過表達[28]。此外,在乳腺癌中aHIF過表達,且aHIF表達水平與腫瘤預后呈負相關[28,51]。在永生化的淋巴細胞系中低氧可以誘導aHIF產(chǎn)生[28],表明HIF-1的反義轉(zhuǎn)錄物aHIF與HIF-1a共同參與了代謝調(diào)控通路。Survivin是一個新型的凋亡抑制劑,在腫瘤細胞中表達,而在正常成熟組織中不表達,被認為是一種很有潛力的抗腫瘤治療的靶點。在一種人來源的結(jié)腸癌細胞系中,誘導survivin的一個NATs效應細胞蛋白酶受體(EPR-1),導致survivin表達下調(diào),同時引起細胞增殖減慢,凋亡增加,對抗腫瘤制劑敏感性也增加。此外,EPR-1可使皮下腫瘤尺寸顯著減小,如果與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用這種效應會增強。這些結(jié)果提示,通過誘導EPR-1cDNA來調(diào)節(jié)survivin也許是一種非常有潛力的治療結(jié)腸癌的方法[52]。Ca-paccioli等[53]發(fā)現(xiàn)了一個bcl-2/IgH的反義轉(zhuǎn)錄物下調(diào)了人濾泡淋巴瘤細胞系t(14;18)DOHH2中bcl-2基因表達。

NATs與人類其它疾病與目前廣泛應用的沉默基因或改造在mRNA剪接方式等方法相比,體內(nèi)特異性基因的上調(diào)是基因治療的可望而不可及的目標。Modarresi[54]及其同事成功上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達。他們通過抑制BDNF的一個NAT來阻斷寡核苷酸向小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運輸,從而抑制了BDNF水平,這將是大量神經(jīng)退行性疾病治療的一個重要靶點,如果采用小分子或microRNA抑制劑,有可能導致不相干基因活化。亨丁頓舞蹈癥(Huntington’sdisease,HD)是一種漸進性的神經(jīng)退化疾病,是由亨丁頓(HTT)基因外顯子的一個CAG重復擴增而引起。Chung等[55]鑒定出HTT反義RNA(HTTAS),即一個在HD重復序列位點的NAT,HTTAS從4個選擇性位的起始轉(zhuǎn)錄,在HD大腦組織中發(fā)現(xiàn)2個HTTAS剪切異構(gòu)體。幾乎所有的人類遺傳疾病均是由于個別幾個相關基因或調(diào)控序列的突變而引起的。Tufarelli等[56]研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因模型小鼠以及分化的干細胞中,RNA反義轉(zhuǎn)錄物介導相關CpG島的沉默和甲基化。這些發(fā)現(xiàn)提出了一個人類遺傳性疾病發(fā)生的新機制。

總結(jié)與展望

綜上所述,哺乳動物NATs的主要特點如下[24]:(1)NATs比以前假設的種類更多;(2)NATs代表一種基因調(diào)節(jié)現(xiàn)象;(3)NATs更普遍的是代表非編碼RNA;(4)NATs以順式(與相應正義轉(zhuǎn)錄物在相同位點)或反式(與相應正義轉(zhuǎn)錄物相隔一段距離)形式出現(xiàn);(5)只有很少數(shù)NATs功能被注釋;(6)有一些NAT參與生理或病理功能調(diào)節(jié);(7)NAT可能是一類潛在的新興藥物靶點,可以使正義基因和/或轉(zhuǎn)錄物上調(diào)或下調(diào)。NATs是一類調(diào)節(jié)RNAs,在mRNA和/或蛋白水平上,對正義轉(zhuǎn)錄物起重要調(diào)節(jié)作用[8]。通過正義—反義雙向結(jié)構(gòu)的形成,NAT以正反饋或負反饋方式調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄物。在正反饋調(diào)節(jié)中,通過上調(diào)腫瘤抑制基因NATs來再活化異常沉默的腫瘤抑制基因。相反,在正反饋調(diào)節(jié)中,過度表達的原癌基因可以被下調(diào)的NATs沉默。對不能耐受化療藥物毒性的患者來說,NATs可能是另一種新型的治療方法。而且,在腫瘤組織中NATs的表達水平與正常組中不同。因此,NATs可以作為監(jiān)測腫瘤發(fā)展的分子標志物。表觀遺傳的改變是可逆的,并且在疾病的發(fā)生和發(fā)展中逐漸引起了重視。表觀遺傳治療也被認為是最有前景的治療方法之一[57]。最近,兩類抑制DNA甲基化或組蛋白乙酰化的表觀遺傳藥物已經(jīng)被研制,包括DNMT抑制劑(例如,5-氮雜胞苷和地西他濱),HDACs抑制劑(曲古菌素A,異羥肟酸),部分藥物已經(jīng)應用與臨床[58-59]。但最近研究表明,一些患者不能耐受藥物毒性。因此,探尋其他有前景的藥物是必須的。調(diào)節(jié)RNAs在表觀遺傳過程中起重要作用,這為藥物設計策略提供了新的未來。很多調(diào)節(jié)RNAs對蛋白編碼基因敏感[60]。

篇8

1 資料與方法

1.1 一般資料 426例HBV感染者均為本院門診及住院患者，男334例，女92例，年齡（42.15±11.87）歲，均為漢族，且無親緣關系。所有病例診斷符合2005年中華醫(yī)學會肝病與感染病學分會修訂的病毒性肝炎診斷標準，同時排除HIV、TP及其他肝炎病毒感染。樣本收集均獲患者知情同意。按疫病類型將患者分為四組，其中乙肝病毒攜帶組98例，男62例，女36例；慢性乙型肝炎組116例，男92例，女24例；乙肝硬化組102例，男86例，女16例；乙肝肝癌組110例，男86例，女24例。

1.2 基因組DNA的提取 采用硅膠柱純化方式，從700 ?L抗凝血液中提取淋巴細胞基因組DNA。UV計測定DNA濃度及純度，并將樣本稀釋至10 ng/?L，分裝保存。

1.3 PCR-RFLP 從SNPs數(shù)據(jù)庫下載SNP的標準序列，Primer Premier 6.0軟件設計引物：上游：5’-3’CCTTTGCCCAGTGTATC，下游：5’-3’TGTATGCCAAGCCATTTG（上海英濰捷基公司合成），內(nèi)切酶BclI位點T/GATCA（NEB公司提供）。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)35次，72 ℃延遲5 min結(jié)束PCR反應。產(chǎn)物37 ℃過夜酶切，65 ℃ 30 min，終止反應。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，送上海英濰捷基公司測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學處理 SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算等位基因頻率和基因型頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗及各組間比較均采用 字2檢驗，以P>0.01表示符合H-W平衡，以P<0.05表示各組間比較差異有統(tǒng)計學意義，非條件Logistic回歸校正年齡及性別等因素，進行關聯(lián)分析，計算比值比（Odds Ratios， OR）及其95%可信區(qū)間（Confidence Intervals， CI）表示相對危險度。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定及測序驗證 PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物見圖1～2。

2.2 H-W平衡判定及各基因型、等位基因的頻率分布 診斷明確的乙型肝炎患者總計426例，樣本經(jīng) 字2檢驗，P=0.85，統(tǒng)計學檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，具有代表性，見表1。GG、CC和GC 3種基因型頻率及G、C等位基因頻率在樣本中的分布比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.113，P=0.104）。乙肝肝癌組GG基因型頻[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務.]率低于乙肝攜帶組、乙肝肝硬化組、慢性乙型肝炎組，與前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.086，P=0.285），與慢性乙型肝炎組比較差異均有統(tǒng)計學意義（字2=6.152，P=0.046）；GC、CC基因型頻率高于其余三組，僅與慢性乙型肝炎組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.046）。慢性乙型肝炎組G等位基因頻率高于乙肝肝癌組，比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=5.605，P=0.018）；C等位基因頻率低于其余三組，僅與乙肝肝癌組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.018）。

根據(jù)非條件Logistic回歸校正年齡、性別混雜因素，以乙肝肝癌組為病例組分別與其他組比較進行分層分析，HMGB1基因位點1176G/C基因多態(tài)性在乙肝肝癌組與乙肝攜帶者組比較差異有統(tǒng)計學意義（OR=0.301，95%CI：0.092-0.989，P=0.048，Recessive model）；乙肝肝癌組與慢性乙型肝炎組（OR=3.792，95%CI：1.206-11.919，P=0.023，Dominant model）比較差異有統(tǒng)計學意義；肝癌組與輕型肝病組（乙肝病毒攜帶組+慢性乙型肝炎組）（OR=0.227，95%CI：0.061-0.852，P=0.028，Dominant model；OR=0.225，95%CI：0.058-0.866，P=0.03，Codominant model）比較差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生機制復雜，病因尚未確定，目前主要認為與肝炎病毒、致癌物質(zhì)、飲水污染、寄生蟲病等眾多環(huán)境因素及遺傳因素有關。肝癌有明顯的家族聚集現(xiàn)象，其本質(zhì)是因為遺傳因素和肝癌之間存在明顯的相關性。通過遺傳學和表觀遺傳學改變引起原癌基因活化和抑癌基因滅活是導致肝癌發(fā)生的重要生物學過程。我國學者發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存有導致肝癌的易感基因，此舉拉開了研究肝癌相關易感基因的帷幕[20]。

HMGB1基因位于13q12染色體上，編碼產(chǎn)物HMGB1已被證實參與了HBV感染后肝癌發(fā)生的過程，Yan等[12]指出HMGB1通過激活TLR4和RAGE信號通路，促進肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)HMGB1 mRNA及蛋白在肝癌組織中表達最高，指出HMGB1的過度表達是肝癌發(fā)病的一個重要因素。繼Kornblit等[14]人首次報道HMGB1基因總共存在6個SNP和4種基因突變后，其基因多態(tài)性與SIRS、同種異體T細胞移植免疫反應、產(chǎn)后膿毒癥、MODS等多種疾病的相關性已被陸續(xù)報道[15-18]。Deng等[19]在研究HMGB1 1176G/C多態(tài)性與HBV感染臨床表型的關聯(lián)性分析中指出GG基因型人群對慢性乙型肝炎、肝硬化、急性乙型肝炎的易感性高于CC、GC基因型人群，G等位基因的HBV感染風險明顯高于C等位基因，但與HBV感染后肝癌的關聯(lián)性未予報道。

本研究結(jié)果提示，HMGB1 intron4 1176G/C多態(tài)性與HBV感染后HCC的發(fā)生有關聯(lián)。攜帶GG基因型的人群對HB[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務.]V感染后HCC的患病風險度增加，該慢性乙型肝炎人群更易發(fā)展成乙肝后肝癌，而攜帶CC基因型的人群感染HBV后發(fā)生HCC的風險較低。G等位基因不僅與HBV感染嚴重肝病密切相關，而且與HBV感染后肝癌的發(fā)生相關。HBV感染后HCC的發(fā)生，影響因素繁多，遺傳背景尤為復雜。在分析其與HMGB1基因多態(tài)性的關聯(lián)性時，種族和地域的差異、樣本量不足、來源局限、等位基因連鎖不平衡現(xiàn)象、基因突變特征、其他微效基因的相關影響、環(huán)境及宿主因素等諸多因素均可干擾 研究結(jié)果，要考證其準確性，仍需要多中心、大樣本的臨床觀察及研究。

參考文獻

[1] Tanaka M， Katayama F， Kato H， et al. Hepatitis B and C virus infection and hepatocellular carcinoma in China： a review of epidemiology and control measures[J].J Epidemiol， 2011， 21（2）： 401-416.

[2] The Ministry of Health of the People's Republic of China. 2011 Chinese Health Statistics Yearbook （Section 9-3-1）[M].http：//61.49.18.65/htmlfiles/zwgkzt/ptjnj/year2011/index2011.html（accessed November 15，2012）.

[3]晏澤輝，鄧國宏，王宇明.乙型肝炎的宿主遺傳易感性的研究進展及前景[J].世界華人消化雜志，2005，13（8）：1002-1007.

[4] Deng C Q，Deng G H，Wang Y M. Relationship between polymor-phisms of 3-hydroxy-s-methyglutaryl coenzyme A reductase gene and hepatitis B virus infection[J].World Journal of Gastroenterology，2005，17（5）：2086-2089.

[5] Deng C Q， Deng G H， Wang Y M. eNOS gene 894G/T polymorphisms among patients infected with HBV[J].Virologica Sinica， 2005， 20（6）： 476-479.

[6] Liu K， Zhang L， Lin X， et al. Association of GST genetic polymorphisms with the susceptibility to hepatocellular carcinoma （HCC） in Chinese population evaluated by an updated systematic meta-analysis[J].PLoS One， 2013， 8（2）：e57043.

[7] Yao X， Zeng H， Zhang G， et al. The associated ion between the VDR gene polymorphisms and susceptibility to hepatocellular carcinoma and the clinicopathological features in subjects infected with HBV[J]. Biomed Res Int， 2013， 20（9）：953-974.

[8] Wang Y， Zhang H H， Chen Y H， et al. Correlation between interleukin-28B genetic polymorphisms and primary hepatocellular carcinoma[J]. Chinese Journal of Preventive Medicine， 2012， 46（6）：527-532.

[9] Pan N， Chen K， Qiu J， et al. Human leukocyte antigen class I alleles and haplotypes associated with primary hepatocellular carcinoma in persistent HBV-infected patients[J].Hum Immunol， 2013， 74（6）： 758-763.

[10] Clark A， Gerlach F， Tong H V， et al. A trivial role of STAT4 variant in chronic hepatitis B induced hepatocellular carcinoma[J]. Nfect Genet Evol， 2013， 18（6）： 257-261.

[11] Gu X， Wang H， Wang A， et al. An intronic polymorphism rs2237062 in the CXCL14 gene influences HBV-related HCC progression in Chinese population[J]. Mol Biol Rep， 2012， 39（2）： 797-803.

篇9

【關鍵詞】 腫瘤抑制基因;DNA甲基化;胃癌

Abstract:Epigenetics is the study of genetic changes in gene expression without the sequence change of DNA， in which DNA methylation is one of the most widely studied epigenetic mechanism. CpG island is the sequence of human genome， located mainly in the promoter as well as the first extron regions. The size of it is nearly 100～1 000 bp and it links with 60% of human coding genes. Methylation of CpG sites in the promoter regions of genes can lead to decreased expression and silence the tumor suppressor genes and contribute to oncogenesis. The research development of DNA methylation in gastric carcinoma was reviewed in this article.

Key words：tumor suppressor genes; DNA methylation;gastric carcinoma

胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計，其死亡率居全球惡性腫瘤死亡率的第二位，嚴重的危害著人類的健康和生命。胃癌發(fā)生的機制目前仍不是很清楚，研究表明，細胞無限增殖及分化受阻是腫瘤發(fā)生的基本過程，隨著分子生物學和基因工程技術的迅速發(fā)展，人們逐漸深化了對腫瘤發(fā)生學的認識。近年研究結(jié)果顯示腫瘤的發(fā)生是多基因異常共同作用的結(jié)果，包括癌基因活化和腫瘤抑制基因失活，有關表遺傳學研究顯示[1]，表遺傳學異常參與了腫瘤發(fā)生過程，而且在某種腫瘤的發(fā)生中起重要作用，其中DNA異常甲基化可致基因表達減弱或基因沉默，是導致腫瘤抑制基因失活的重要機制之一。本文就胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中一些腫瘤抑制基因DNA異常甲基化研究進展作一綜述。

1 DNA甲基化及其作用

表遺傳學(epigenetics)是1939年由waddington首先提出的。表遺傳學是研究在DNA序列沒有改變的情況下，所發(fā)生的可遺傳性基因表達的改變[1]168-174。其中包括DNA甲基化、基因組印記、染色體組蛋白修飾、隔離蛋白以及非編碼RNA調(diào)控等方式，這種模式傳遞給子代細胞是不依賴DNA序列的。其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一種表遺傳學表達機制。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases DNMTS)的介導下，二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位原子上的H被S—腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代，使之變成5—甲基胞嘧啶(5-methy1cytosine，m5C)[2]的化學修飾過程。甲基化酶包括維持甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT 1) 和重新甲基化酶(DNMT 3a，DNMT 3b)。維持甲基化酶的作用是識別子代DNA 雙鏈中親代單鏈上已甲基化的CpG 位點，催化互補單鏈的胞嘧啶(C) 發(fā)生甲基化;重新甲基化酶的作用是使非甲基化的雙鏈DNA 發(fā)生甲基化的過程[3] 。DNA的甲基化修飾反應主要發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶，CpG 位點以兩種形式存在，一種為分散于DNA中，正常情況下這些 CpG二核苷酸甲基化可作為一種宿主基因的保護機制，它會抑制重復子轉(zhuǎn)錄以及重復子同源性重組，還可以抑制“寄生”DNA序列(如逆轉(zhuǎn)錄病毒片段)的侵入;另一種是CpG 結(jié)構(gòu)高度聚集在一起，即CpG 島(CpG island)。CpG島在基因組內(nèi)呈不連續(xù)分布，通常位于基因的啟動子區(qū)域(promoter region)，也可位于第一外顯子區(qū)域， 故又稱5′-CpG 島[4]。在正常細胞中，CpG 島通常不發(fā)生甲基化修飾，而腫瘤組織常發(fā)生其相關基因啟動子區(qū)域的異常甲基化。DNA 甲基化異常可分為甲基化增強、甲基化減弱和甲基化轉(zhuǎn)移酶水平增高三種情況，其中抑癌基因甲基化增強在腫瘤中最常見。可通過改變基因的構(gòu)型或與核內(nèi)甲基化CG序列結(jié)合蛋白結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn)錄復合物，從而導致其表達沉默，使腫瘤抑制活性喪失，被認為是腫瘤抑制基因失活的重要途徑。另外，DNA 的甲基化還可促進腫瘤相關基因突變，因5-甲基胞嘧啶可自發(fā)性或在SAM 作用下引起鄰位脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ辜谆腃pG 突變?yōu)門pG，因此其也是甲基化促進惡變的機制之一。

CpG島甲基化是一種基因外修飾，在正常細胞中基因的甲基化大多發(fā)生在其啟動子CpG 島之外，而在腫瘤細胞中某些抑癌基因的CpG島甲基化則導致該基因轉(zhuǎn)錄失活，故在腫瘤研究中檢測基因啟動子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)，對于闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制及建立早期診斷方法均具重要意義。目前DNA甲基化的檢測方法比較多，其中廣泛應用的技術是甲基化特異性的PCR技術(MSP)和甲基化敏感的單堿基延伸技術(Ms-SNuPE)，這些技術的敏感性高，特異性強，適用于微量DNA或石蠟包埋DNA。在MSP技術的基礎上，又先后發(fā)展了基于熒光檢測方法的實時定量PCR(MethyLight)和依賴于限制性核酸內(nèi)切酶的甲基化分析方法(COBRA)，這些技術提高了檢測的敏感性，實現(xiàn)了高通量和高特異性。此外，有人將MSP技術與變性高效液相色譜法(DNPLC)相結(jié)合，來測定整個CpG位點的甲基化。近年，中國科學院化學研究所與清華大學的研究人員合作，發(fā)展了基于水溶性陽離子型共軛聚合物的新DNA甲基化分析方法。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(FRET)研究了質(zhì)粒和人腫瘤細胞p16基因啟動子區(qū)特異CpG位點的甲基化狀態(tài)該技術具有較高的靈敏度和特異性。引物無需熒光標記，檢測在均相溶液中進行，無需分離、純化等手段，而且與高通量分析兼容，在癌癥臨床診斷上具有潛在的應用價值[5]。

2 胃癌相關基因的甲基化

近年研究結(jié)果顯示，多種基因的異常甲基化在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。有研究[6]表明，DNA的甲基化率在胃癌前病變轉(zhuǎn)化為癌的過程會發(fā)生改變。Kang等[7] 對非腫瘤胃黏膜和胃腫瘤進行p16、hMLH1、DAP—kmase、THBS1、及TIMP-3等5種基因檢測，發(fā)現(xiàn)除DAP—kmase甲基化的頻率相近之外，其他基因從慢性胃炎到腸化生及從腺瘤到腺癌甲基化頻率都有不同程度的增高。因此認為，這些基因的高甲基化在胃癌變發(fā)生過程中的較早階段就已出現(xiàn)，這為胃癌的早期診斷提供了新思路。

2.1 p16基因甲基化

p16基因又稱多腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS)，定位于9p21 位點，由2個內(nèi)含子和3 個外顯子組成。該基因編碼的蛋白是一種重要的細胞周期負調(diào)控蛋白，可與D型細胞周期蛋白(cyclinD)競爭性結(jié)合細胞周期蛋白依賴激酶CDK4 和CDK6而抑制蛋白激酶活性，使腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)中抑癌基因Rb的表達產(chǎn)物(PRb)不能磷酸化而保持活化狀態(tài)，抑制轉(zhuǎn)錄因子EF解離，使細胞周期進展最關鍵的G 1/S轉(zhuǎn)換停滯，對細胞周期起負調(diào)控作用。因此，p16 基因的變異或其蛋白的失活會導致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調(diào)節(jié)途徑的失控，而使細胞過度增殖，導致腫瘤發(fā)生。目前研究表明p16基因的純合缺失和點突變異常多種腫瘤的發(fā)生有關。在胃癌中p16基因異常甲基化主要發(fā)生在外顯子1和啟動子區(qū)域，且基因啟動子的高度甲基化更為常見。Lee等[8]最早報道了p16 甲基化與胃癌的關系，他們用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶研究了9 個胃癌細胞株，發(fā)現(xiàn)2個細胞株有甲基化，而且不表達p16mRNA;體外以去甲基化劑5-deoxy-ezecytidine對胃癌細胞系處理后，因CpG島異常甲基化而封閉的基因又重新表達。Ficorella 等[9]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌中p16 基因啟動子區(qū)域高甲基化是導致其轉(zhuǎn)錄失活的重要原因。Bai等[10]利用誘發(fā)Wistar 大鼠胃癌模型研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠胃黏膜向胃癌演變過程中，p16 基因甲基化是在胃癌發(fā)生過程的較早階段出現(xiàn)，其甲基化的頻率在正常胃上皮中為2.7%， 在慢性萎縮性胃炎中為16.7%，在腸上皮化生中為37.5%，在胃腺瘤中為64.7%，在胃癌中則高達82.5%。Abbaszadegan 等[11]通過MSP 和免疫組化等方法同時對52 例胃癌患者組織和血清中p16基因甲基化及蛋白表達情況分析后，認為p16 啟動子區(qū)高甲基化在胃癌發(fā)生中起重要作用，并且與胃癌惡性程度相關。同時提出血清中DNA 甲基化水平的檢測可能是胃癌早期檢查的一個重要的生物學指標。

2.2 DNA錯配修復基因(MMR)、CpG甲基化表型(CIMP)與胃癌

研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的發(fā)生中存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)和 CpG甲基化表型(CpG island methylator phenohype，CIMP)兩種分子途徑。在DNA MMR中起主要作用的是基因hMLH1 和hMSH2。MMR通過修復DNA堿基錯配、降低自發(fā)性突變，而增強DNA的保真性和維持基因組的穩(wěn)定性。Herman等[12]最早報告了在結(jié)直腸癌中MMR hMLH1失活與DNA甲基化有關，后來發(fā)現(xiàn)胃癌中同樣存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)亞型，但還沒有胃癌中有關DNA MMR發(fā)生突變的報道。Fleisher 等[13]檢測了65 例胃癌組織的hMLH1甲基化情況發(fā)現(xiàn)，隨著胃癌中MSI頻率的降低hMLH1基因的甲基化率也隨之降低。由此推測，hMLH1基因啟動子區(qū)域甲基化與MSI有關，有可能是該基因失活的一種普遍機制。Poplawski等[14]通過甲基化敏感限制性內(nèi)切酶PCR(MSRE-PCR)對比分析27例胃癌患者與25 例健康人后認為，hMLH1 甲基化對胃癌形成有促進作用。由此可見，hMLH1啟動子的甲基化與胃癌的發(fā)生有關，可能是胃癌發(fā)生機制中的早期分子事件。

CpG甲基化表型(CIMP)是指一些病例同時存在多個基因甲基化的現(xiàn)象。CIMP已在大腸癌、肝癌、肝內(nèi)外膽管癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、膀胱癌等惡性腫瘤中得到證實。由于胃癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素相互作用的結(jié)果，也涉及許多相關基因的異常表達，因此多基因的啟動子甲基化的研究也就自然得到了研究人員的青睞，而且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CIMP與胃癌有著密切的關系。Kim等[15] 通過檢測40例早期胃癌組織中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP—K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化狀況發(fā)現(xiàn)，除了2 例基因甲基化陰性外，CIMP盡然高達40%。可見，啟動子甲基化在早期胃癌中是一種普遍現(xiàn)象。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生的不同階段、不同基因的啟動子甲基化表達狀況是不同的，有的基因隨胃癌的進展其甲基化發(fā)生率有不斷升高的趨勢，而在健康青年人標本及胎盤中未發(fā)DNA甲基化。可見CIMP在胃癌的發(fā)生中是一早發(fā)事件，可以利用此特征作為胃癌的早期診斷指標，同時對建立胃癌相關基因的甲基化譜也具有積極的作用。

APC 基因是一種抑癌基因，編碼的APC蛋白可以抑制上皮細胞增殖而抑制腫瘤的發(fā)生。早期研究證實該基因是結(jié)直腸癌的管家基因，近來研究發(fā)現(xiàn)該基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。曾有學者用免疫組化方法分析了120 例胃癌病人的APC基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APC缺失率為78%，因此認為APC 基因缺失可能與胃癌的發(fā)生有關。近年來大量的研究顯示APC基因啟動子1A部位甲基化與胃癌發(fā)生關系密切。Hosoya等[16]研究發(fā)現(xiàn)APC基因啟動子1A蛋白表達率與甲基化率在正常胃粘膜和非癌粘膜中保持一致，在癌粘膜中甲基化率增高。而1B均未發(fā)現(xiàn)有甲基化。由此可見，ACP啟動子甲基化主要發(fā)生在1A部位，且ACP啟動子1A部位的甲基化可能是胃癌發(fā)生的一個中間環(huán)節(jié)，而不是胃癌發(fā)生的始動因素。3 結(jié) 語

通過對胃癌相關基因甲基化分析發(fā)現(xiàn)，多種相關基因甲基化是胃癌形成的重要機制之一。DNA甲基化異常不僅可在手術標本中檢測到，還可從各種體液如外周血清中檢測到，為臨床應用帶來極大便利，因此腫瘤相關基因啟動子甲基化狀態(tài)是一種非常有前途的生物標記物，可作為腫瘤的敏感性生物標志物。檢測胃癌相關基因啟動子異常甲基化不僅可用于高危人群監(jiān)測、腫瘤風險評估、胃癌早期診斷，還可用于判斷腫瘤遷移情況，預測胃癌手術、放化療療效等。由于DNA甲基化是一個可逆的過程，故通過恢復僅被抑制而未發(fā)生突變或丟失的生長調(diào)控基因表達.來恢復細胞正常生長調(diào)控功能，并且已有這方面的動物模型研究證實了這一想法。故DNA的去甲基化將為癌癥的治療提供新思路。由于一些病原體的感染可以誘發(fā)腫瘤相關基因甲基化從而導致胃癌的發(fā)生，故預防感染和及時的根除這些病原體會對預防胃癌的發(fā)生有重要的意義。

參考文獻

1] Baylin SB，Herman JG.DNA hypermethylation in tumorigenesis：epigetics joins genetics[J].Trends Genet，2000，16(4)：168-174.

[2] Jeltsch A，Beyond Watson and Crick . DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases[J].Chem Biochem ，2002，3(4)：274-293.

[3] 夏丹，范偉.DNA甲基化與腫瘤相關性研究進展[J].中國誤診學雜志，2009，9(6):1275-1276.

[4] Takai D，Jones PA. Comprehensive ana1ysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(6):3740-3745.

[5] Feng F，Wang H，Han Y，et al.Fluorescent conjugated polyelectrolyte as an indicator for convenient detection of DNA methylation[J].Am Chem Soc，2008，130:11338-11343.

[6] Kim TY，Jong HS，Jung Y，et a1.DNA hypermethylation in gastile cancer[J].Aliment Pharmacol Ther，2004，20(1)：131-142.

[7] Kan g G H，Shim Y H，Jung H Y，et a1.CpG island methylatien in premalignant stages of gastric carcinoma[J].Cancer Res，2001，61(7)：2847-2851.

[8] Lee Y Y，Kang S H，Seo J Y，et al. Alterations of p16 and p15 genes in gastric carcinomas[J].Cancer，1997，80:1889-1896.

[9] Ficorella C，Cannita K，Ricevuto E，et al. P16 hypermethylation contributes to the characterization of gene inactivation profiles in primary gastric cancer [J].Oncol Rep，2003，10(1):169-173.

[10] Bai H，Gu L K，Zhou J，et al. p16 hypermethylation during gastric carcinogenesis of Wistar rats by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine[J]. Mutat Res，2003，535(1):73-78.

[11] Abbaszadegan M R，Moaven O，Sima HR，et al. p16 promoter hypermethylation: a useful serum marker for early detection of gastric cancer[J].World J Gastroenterol，2008，14(13): 2055-2060.

[12] Herman J G，Umar A，Polyak K，et al. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylationin colorectal carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(12):6870-6875.

[13] Fleisher A S，Esteller M，Wang S，et al. Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter in human gastric cancers with microsatellite instability [J].Cancer Res，1999，59(6):1090-1095.

[14] Poplawski T，Tomaszewska K，Galicki M，et al. Promoter methylation of cancer-related genes in gastric carcinoma[J].Exp Oncol，2008，30(2):112-116.

篇10

[關鍵詞] 三細胞；早期分裂；囊胚形成；預測

[中圖分類號] R714.8 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210（2014）10（a）-0069-03

Prediction research on blastocyst formation for early division in vitro based on three-cell embryo

HUANG Cuiyu DONG Yunqiao CHEN Chuangqi SHI Zhe

Department of Reproductive Health and Fertility， Guangdong Maternal and Child Health Care Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China

[Abstract] Objective To develop a prediction method of blastocyst formation in vitro by observation the three-cell embryo stage in specific time window of fertilization embryo post intracytoplasmic sperm injection （ICSI）. Methods Human immature oocytes were further cultured until maturity before ICSI was performed. Continuous observation of three-cell stage after ICSI of 33.9-42.9 h were preformed per hour， and the blastocysts rate were recorded post ICSI for 6 d. Results The blastocysts rate of fertilization embryo， which underwent the three-cell stage （76.67%） were higher than those without three-cell stage （4.17%）， and difference between the two groups was significant （P < 0.05）. Furthermore， the highest blastocysts rate was identified in fertilization embryo which three-cell stage observed 39.9 h post ICSI. Conclusion The three-cell embryo stage can be used as a potential reference to estimate blastocysts rate of fertilization embryo.

[Key words] Three-cell embryo； Early division； Blastocyst formation； Prediction

囊胚培養(yǎng)是目前體外培養(yǎng)過程中挑選最具發(fā)育潛能胚胎的有效方法[1-2]。但是，囊胚培養(yǎng)體系還不夠完善，通過體外受精（IVF）獲得的胚胎有50%～70%不能發(fā)育為囊胚[3]，因此輔助生殖過程中因無囊胚形成是導致周期取消率升高的主要原因。此外，囊胚培養(yǎng)不可避免地延長了胚胎在體外的生長時間，無疑會導致胚胎基因組及表觀遺傳的變化。這就需要尋求一種無創(chuàng)且早期預測胚胎發(fā)育潛能的指標。在胚胎分裂早期通過觀察分裂特性，對體外培養(yǎng)的胚胎的發(fā)育做出預測，從而既可早期選擇具有發(fā)育至囊胚階段的胚胎，又避免了胚胎在體外的延長培養(yǎng)。本研究以體外成熟的卵母細胞顯微授精后的胚胎為研究對象，通過觀察早期分裂的三細胞階段胚胎與囊胚形成之間的關系，并探索最佳的觀察時間窗，為建立有效的、無創(chuàng)的早期預測胚胎發(fā)育潛能的指標奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

不成熟卵子來自在廣東省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）生殖健康與不孕癥科進行的卵胞漿內(nèi)單注射周期中剩余的MI或GV期卵母細胞。本研究獲得了我院倫理委員會批準，征得了患者的同意，并簽署了知情同意書。

1.2 耗材和試劑

細胞培養(yǎng)皿：美國Falcon公司；顯微注射針：購自美國COOK公司。試劑：受精培養(yǎng)液（G-IVF）、卵裂期胚胎培養(yǎng)液（G-1）、囊胚期培養(yǎng)液（G-2）、取卵胚胎處理液（G-MOPS）、人血清白蛋白（HSA）、石蠟油（OVOIL）、透明質(zhì)酸酶、顯微操作液，均購自瑞典Vitrolife公司；重組促卵泡生長激素（FSH，Gonal-F）、β-人絨毛膜促性腺激素（HCG，Profasi），均購自瑞士雪蘭諾公司。

1.3 儀器與設備

SZX2-1LLB體式顯微鏡：日本Olympus公司；RI顯微操作系統(tǒng)、IVF工作站L126MP，均購自丹麥K-SYSTEM公司；5804離心機：德國Ependorff公司；TE2000-U倒置顯微鏡：日本Nikon公司；三氣培養(yǎng)箱：美國Forma公司。

1.4 卵母細胞體外成熟

將凍存收集的做卵泡漿內(nèi)單注射的患者脫顆粒細胞后的未成熟卵母細胞采用卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基（IVM-培養(yǎng)基）進行體外成熟培養(yǎng)。

1.5 實驗分組與觀察記錄方法

將體外成熟的卵母細胞進行ICSI授精，選擇受精卵150個，將其分為兩組，第1組為有三細胞階段胚胎組，第2組為無三細胞階段胚胎組，于授精后33.9 h后開始，于顯微鏡下觀察記錄三細胞胚胎的形成情況，統(tǒng)計有三細胞階段胚胎的比率，之后每小時觀察記錄1次，直至授精后42.9 h，于授精后6 d統(tǒng)計觀察到和未觀察到三細胞階段的囊胚形成率，比較兩組間差異。

1.6 三細胞胚胎觀察時間窗的確立

根據(jù)文獻報道從受精卵到早期分裂為兩細胞胚胎需要25～27 h[4]，在此時間窗內(nèi)觀察到兩細胞胚胎并記錄。從第1次卵裂結(jié)束到第2次有絲分裂開始需要（11.1±2.2）h，從第2次有絲分裂開始到第3次有絲分裂開始需要（1.0±1.6）h，因此擬定的觀察三細胞胚胎的時間窗為33.9 h[（25+11.1-2.2）h]～42.9 h[（27+11.1+2.2+1.6+1）h]。將在授精后33.9～42.9 h內(nèi)9 h分為3個時間窗，即W1：33.9～36.9 h，W2：>36.9～39.9 h，W3：>39.9～42.9 h，然后分別統(tǒng)計3個時間窗內(nèi)三細胞胚胎出現(xiàn)的情況，追蹤三細胞胚胎到授精后6 d，然后于授精后6 d統(tǒng)計3個時間窗觀察到三細胞階段胚胎的囊胚形成率。

1.7囊胚評分

參照Gardner評分系統(tǒng)，采用人類囊胚分級系統(tǒng)對囊胚評分。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1經(jīng)歷三細胞階段胚胎與囊胚形成率之間的聯(lián)系

結(jié)果顯示，150個受精卵授精后至42.9 h，有30個觀察到三細胞階段胚胎，這部分胚胎所對應的囊胚形成數(shù)為23個，即囊胚形成率為76.67%。120個未觀察到三細胞階段，無三細胞階段胚胎所對應的囊胚形成率為4.17%。兩者比較，具有三細胞階段的囊胚形成率顯著高于無三細胞階段胚胎所對應的囊胚形成率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.89，P < 0.05）。見表1。

表1 有三細胞階段胚胎與無三細胞階段胚胎的囊胚形成率比較[n（%）]

2.2三細胞胚胎觀察時間的確定

結(jié)果顯示，W1、W2時間窗內(nèi)具有三細胞階段的囊胚形成率顯著高于W3，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.91，P < 0.05）。因此在授精后33.9～39.9 h內(nèi)觀察統(tǒng)計到的具有三細胞階段胚胎的囊胚形成率較高，該時間段可以作為三細胞胚胎的適宜觀察時間。見表2。

表2 三細胞胚胎觀察時間與囊胚形成率比較[n（%）]

3 討論

近年來，全世界已有近500萬的試管嬰兒借助體外受精-胚胎移植（IVF-ET）及其衍生技術誕生[5]。胚胎著床是試管嬰兒成功的關鍵和起始環(huán)節(jié)。而大規(guī)模的統(tǒng)計研究顯示，近二十年來IVF-ET的著床率始終徘徊在30%左右，這就意味著大多數(shù)胚胎無法種植在子宮內(nèi)膜上，相當一部分患者需要經(jīng)歷多次胚胎移植。目前，精確的胚胎選擇的方法有評估卵裂球的非整倍體和測試胚胎培養(yǎng)液微滴中的代謝改變等，盡管精細、科學，卻由于價格昂貴、費時費力等原因不能直接用于臨床。在沒有找到一種最有效的選擇方法之前，臨床上多采用簡便快捷的早期胚胎形態(tài)學評分法來選擇用于移植的胚胎。目前國內(nèi)外用于評價胚胎質(zhì)量的常用方法主要有原核評價法和卵裂期胚胎評價法。原核評價法主要是對原核的形態(tài)、核仁前體的數(shù)量和分布進行評價，從而預測胚胎的發(fā)育潛能。原核評分不一定能完全反映胚胎的后期發(fā)育情況[6]。卵裂期胚胎評分法其評價指標主要是根據(jù)卵裂球的數(shù)目、均勻程度以及無核碎片的比例等參數(shù)來判斷胚胎的質(zhì)量。實踐證明，僅根據(jù)授精后第3天胚胎質(zhì)量標準選擇胚胎移植，盡管考慮到目前已知的卵裂階段胚胎的所有形態(tài)參數(shù)，仍然很難預測胚胎的發(fā)育潛能，即使是優(yōu)質(zhì)胚胎，也有相當數(shù)量的移植胚胎不能著床[7]。而且，形態(tài)學無異常表現(xiàn)的胚胎有存在遺傳或表觀遺傳缺陷的可能，導致胚胎停孕及流產(chǎn)。雖可選擇胚胎植入前遺傳學診斷技術選擇染色體正常的胚胎，但該項技術本身尚存在很多問題，如活檢或診斷技術的失敗而導致誤診或不能診斷、胚胎存在嵌合現(xiàn)象等。因此，需要尋找一種新的、無創(chuàng)的評價胚胎發(fā)育潛能的方法，以提高種植率并避免多胎妊娠的發(fā)生。囊胚培養(yǎng)是目前在體外挑選最具發(fā)育潛能的胚胎的方法。囊胚形成在形態(tài)上經(jīng)歷了細胞融合、囊胚腔出現(xiàn)和囊胚腔擴張的過程，基因調(diào)控經(jīng)歷了從母體調(diào)節(jié)向胚胎調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)換[8-9]，發(fā)育潛能差及染色體異常的胚胎在未發(fā)育至囊胚時即發(fā)育停止，只有質(zhì)量好的胚胎才有發(fā)育至囊胚的潛能[10]。因此，囊胚培養(yǎng)可以有效地對胚胎進行篩選，從而提高著床率。但是，目前囊胚培養(yǎng)體系還不夠完善，通過IVF獲得的胚胎體外有50%～70%不能發(fā)育到囊胚[11]。可能因未能獲得囊胚或囊胚質(zhì)量差，導致周期取消率升高。另外囊胚培養(yǎng)延長了胚胎在體外的生長時間，可能會導致基因組及表觀遺傳的變化。這就需要尋求一種無創(chuàng)且早期預測胚胎發(fā)育潛能的指標。在胚胎分裂早期通過觀察分裂特性，對體外培養(yǎng)的胚胎做出預測，從而既可早期選擇具有發(fā)育至囊胚階段的胚胎，又避免了胚胎在體外的延遲培養(yǎng)。

2010年10月Nature biotechnology報道了通過實時成像顯微鏡觀察100個IVF受精卵到四細胞胚胎的發(fā)育過程，根據(jù)胚胎發(fā)育動力學，從眾多的參數(shù)中最終確定了3個發(fā)育階段的時間窗作為預測胚胎是否具有發(fā)育到囊胚潛能的指標：①第1次有絲分裂時程為（14.3±6）min；②第1次有絲分裂完成至第2次有絲分裂開始的時間間隔為（11.1±2.2）h；③第2次有絲分裂開始至第3次有絲分裂開始的時間間隔為（1.0±1.6）h。上述胚胎發(fā)育時間窗對預測囊胚形成的敏感性和特異性為93%以上[12]。另外該研究結(jié)果還表明胚胎發(fā)育過程中卵裂球的分化是不同步的，在上述時間窗內(nèi)受精卵經(jīng)過前兩次有絲分裂形成三細胞胚胎而不是經(jīng)過兩次卵裂形成四細胞胚胎。這表明三細胞胚胎是在早期胚胎發(fā)育過程特定時間內(nèi)一個不可逾越的階段，具有效預測胚胎發(fā)育的潛在價值。

本研究的結(jié)果也表明在體外成熟卵母細胞中觀察到經(jīng)歷三細胞階段的胚胎也有很高的囊胚形成率，但是低于文獻報道的數(shù)值，推測可能與所選的卵母細胞為體外成熟的有關。

[參考文獻]

[1] Blake DA，F(xiàn)arquhar CM. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception [J]. Cochrane Database Syst Rev，2007，17（4）：CD002118.

[2] Kim S， Kim JH， Lee E， et al. Establishment and characterization of embryonic stem-like cells from porcine somatic cell nuclear transfer blastocysts [J]. Zygote，2010，18（2）：93-101.

[3] 郝桂琴，李蓉，耿嵐，等.囊胚培養(yǎng)及囊胚移植[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（31）：5801-5804.

[4] 孫貽娟，張愛軍，陸小激，等.胚胎早裂聯(lián)合胚胎發(fā)育速度及形態(tài)評分在胚胎選擇中的應用[J].上海交通大學學報：醫(yī)學版，2009，29（6）：719-721.

[5] 洪玉珍，褚曉靜，沙愛國.關于人類輔助生殖技術相關倫理問題的思考[J].中國醫(yī)藥導報，2012，9（31）：163-165.

[6] De Placido G，Wilding M， Strina I， et al. High outcome predictability after IVF using a combined score for zygote and embryo morphology and growth rate [J]. Hum Repred，2002，17（9）：2402-2409.

[7] James MS，Taerhan BS，Richard P， et al. Day 3 morphology is a poor predictor of blastocyst quality in extended culture [J]. Fertil Stefil，2000，74（3）：495-497.

[8] Sharara FI， Abdo G. Incidence of monozygotic twins in blastocyst and cleavage stage assisted reproductive technology cycles [J]. Fertil Steril，2010，93（2）：642-645.

[9] Dominguez F， Gadea B，Mercader A， et al. Embryologic outcome and secretome profile of implanted blastocysts obtained after coculture in human endometrial epithelial cells versus the sequential system[J]. Fertil Steril，2010， 93（3）：774-782.

[10] Shu JH， Zhang B， Feng GX. Progress of Blastocyst Culture and Blastocyst Transfer [J]. Zhongguo Bijiao Yixue Zazhi，2009，19（9）：69-72.

[11] French DB， Sabanegh ES Jr， Goldfarb J，et al. Does severe teratozoospermia affect blastocyst formation， live birth rate， and other clinical outcome parameters in ICSI cycles？[J]. Fertil Steril，2010，93（4）：1097-1103.