慢性中性粒細(xì)胞白血病分子診斷探討

時(shí)間:2022-10-29 09:15:22

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慢性中性粒細(xì)胞白血病分子診斷探討

慢性中性粒細(xì)胞白血病(chronicneutrophilleukemia,CNL)是一種極為少見的BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferativeneoplasms,MPN),其特征是持續(xù)地外周血成熟中性粒細(xì)胞明顯增多、骨髓粒系增生和肝脾腫大,無髓系細(xì)胞發(fā)育異常形態(tài)改變和BCR-ABL1、PDGFRA、PDG-FRB、FGFR1重排。以往由于缺乏特定的分子標(biāo)志,本病的明確診斷很大程度上取決于仔細(xì)地鑒別反應(yīng)性粒細(xì)胞增多和表現(xiàn)相近的其他髓系腫瘤,基本屬于排除性診斷。隨著2013年發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者具有集落刺激因子3受體基因(CSF3R)突變[1],并經(jīng)嚴(yán)格定義的CNL中驗(yàn)證,確認(rèn)其為CNL發(fā)病分子基礎(chǔ),2016年WHO淋巴與造血組織腫瘤分類中納入CSF3R突變作為CNL診斷主要指標(biāo)[2],使得CNL不再是排除性的診斷,而成為一種形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)定義的髓系腫瘤。現(xiàn)就CNL分子診斷研究進(jìn)展介紹如下。

1CSFR

CSF3R基因定位于染色體1p34.3,含有17個(gè)外顯子,編碼813個(gè)氨基酸的集落刺激因子跨膜受體,為粒細(xì)胞提供增殖和生存信號(hào),并有助于其分化和功能。CSF3R是一單鏈細(xì)胞表面受體,屬于細(xì)胞因子受體Ⅰ型超家族,其胞質(zhì)部分包括有不同的功能區(qū),即近膜區(qū)域有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo),行使增殖功能;遠(yuǎn)端區(qū)域羧基末端與成熟信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān),行使分化和增殖調(diào)節(jié)功能[3]。CSF3R與其配體G-CSF結(jié)合后,通過經(jīng)典的下游途徑,包括JAK-STAT,SRC家族激酶(尤其是LYN),非受體酪氨酸激酶SYK、Ras/Raf/MAP激酶和PI3K/Akt通路發(fā)揮作用,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分化、增殖、存活,并刺激中性粒細(xì)胞功能。研究證明CSF3和CSF3R在粒細(xì)胞生成過程起著非常重要作用,小鼠缺乏CSF和CSF3R基因缺陷可表現(xiàn)嚴(yán)重的粒細(xì)胞缺乏。在嚴(yán)重先天性粒細(xì)胞缺乏患者,除了明確的遺傳性致病基因(如ELANE或HAX1)突變外,有報(bào)道40%可伴有獲得性造血干細(xì)胞CSF3R胞質(zhì)遠(yuǎn)端羧基末端過早截?cái)嗟幕驘o義突變,通過與其它癌基因共同作用延長細(xì)胞生存,增加克隆優(yōu)勢,被認(rèn)為與高急性白血病轉(zhuǎn)化相關(guān)[4-5]。另外,CSF3R基因胚系突變尚可導(dǎo)致顯性遺傳的先天性中性粒細(xì)胞增多或家族性慢性中性粒細(xì)胞白血病[6-7],偶爾在急性髓系白血病也報(bào)道檢出這種類似突變。

2CSF3R突變與CNL診斷

為了查找潛在的分子發(fā)病原因,2013年Max-son等[1]采用原代細(xì)胞深度測序結(jié)合酪氨酸激酶特異的小干擾RNA或小分子激酶抑制劑作用的方法,對(duì)傳統(tǒng)臨床診斷的CNL和不典型慢性髓系白血病(aCML)進(jìn)行研究,27例患者中16例(59%)檢出CSF3R突變,其中9例CNL患者中8例(89%)檢出CSF3R突變,均涉及位于外顯子14的胞外近膜結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變,7例(78%)為CSF3RT618I突變,1例為CSF3RT615A突變。這些近膜結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變單獨(dú)發(fā)生更為多見,少部分與另一類導(dǎo)致CSF3R胞質(zhì)尾部過早截?cái)嗟囊拼a突變或無義突變共同存在,形成復(fù)合突變。胞外近膜結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變和胞質(zhì)尾部過早截?cái)嗤蛔儍煞N類型突變分別通過下游JAK-STAT通路和SRC酪氨酸激酶通路介導(dǎo),均具有體外轉(zhuǎn)化能力,并相應(yīng)地對(duì)激酶抑制劑蘆可替尼和達(dá)沙替尼呈現(xiàn)不同敏感性。以CSF3RT618I表達(dá)的造血細(xì)胞進(jìn)行移植,小鼠發(fā)生致死性的MPN,表現(xiàn)為突出的成熟粒細(xì)胞增多、骨髓明顯活躍和肝脾成熟粒細(xì)胞浸潤[8]。Pardanani等[9]在按照嚴(yán)格WHO標(biāo)準(zhǔn)診斷的12例CNL患者中更是100%檢出CSF3R基因突變,10例為CSF3RT618I突變;而aCML、漿細(xì)胞病相關(guān)CNL、原發(fā)性骨髓纖維化癥(PMF)和慢性粒-單細(xì)胞白血病(CMML)患者無一例檢出該突變。這些均表明CSF3R突變?cè)贑NL非常常見,是CNL一致性的生物學(xué)特征;CSF3RT618I是CNL敏感而特異的分子標(biāo)志,應(yīng)納入CNL診斷標(biāo)準(zhǔn)。2016年修訂的WHOCNL診斷標(biāo)準(zhǔn)將CSF3RT618I和其他激活突變納入診斷[2],即:①外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥25×109/L,分葉核+帶狀核中性粒細(xì)胞≥80%,前體中性粒細(xì)胞(早幼、中幼和晚幼粒細(xì)胞)<10%,原粒細(xì)胞少見,單核細(xì)胞<1×109/L,無粒系形態(tài)發(fā)育異常;②骨髓增生活躍,中性粒細(xì)胞比例及數(shù)量增多,中性粒細(xì)胞形態(tài)正常,原粒細(xì)胞占有核細(xì)胞比例<5%;③不符合WHO定義的BCR-ABL1陽性慢性粒細(xì)胞白血病(CML)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET),或原發(fā)性骨髓纖維化(PMF);④無PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因重排,無PCM1-JAK2融合基因;⑤CSF3RT618I或其他活化CSF3R基因突變,或持續(xù)性(≥3個(gè)月)的中性粒細(xì)胞增多、脾腫大,且沒有可識(shí)別原因的反應(yīng)性中性粒細(xì)胞增多,包括無漿細(xì)胞腫瘤,或者如果存在漿細(xì)胞病,須有髓系細(xì)胞細(xì)胞遺傳學(xué)或分子學(xué)研究證實(shí)的克隆性證據(jù)。

3繼發(fā)性或反應(yīng)性粒細(xì)胞增多的排除更為方便

臨床上中性粒細(xì)胞增多可見于多種良惡性疾病,精確診斷CNL需要仔細(xì)與這些具有類似表現(xiàn)的疾病進(jìn)行鑒別。CML、aCML、CMML以及MPN/MDS等各自均具有特征性分子和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,診斷也在2016年WHO髓系腫瘤分類中明確界定,與CNL鑒別并不困難。類白血病反應(yīng)與CNL均可表現(xiàn)有外周血白細(xì)胞增多、骨髓增生明顯活躍、BCR/ABL融合基因陰性和正常染色體核型,二者的鑒別極具挑戰(zhàn)性。盡管仔細(xì)地病史詢問、臨床檢查和外周血分析大多可以提供相應(yīng)診斷線索,但若能證明存在克隆性造血,包括識(shí)別出CSF3R突變或其它分子或細(xì)胞遺傳學(xué)異常,則更加支持CNL的診斷。而缺乏CSF3R基因突變雖并不能完全排除CNL診斷的可能性,但此時(shí)要診斷CNL更需格外謹(jǐn)慎。CNL經(jīng)常同時(shí)伴發(fā)漿細(xì)胞病,以多發(fā)性骨髓瘤最為常見,意義未定單克隆γ球蛋白血癥次之,文獻(xiàn)報(bào)道可高達(dá)32%[10]。鑒于腫瘤性漿細(xì)胞可合成G-CSF,CNL能自發(fā)緩解,基礎(chǔ)漿細(xì)胞病治療中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)改善,患者預(yù)期壽命更長,尤其均不能檢出特征性的CSF3R基因突變,表明伴發(fā)漿細(xì)胞病的“CNL”與單純CNL是兩種病因和機(jī)制不同的病理異常,支持前者實(shí)為漿細(xì)胞病繼發(fā)的中性粒細(xì)胞增多[11-12]。另外,某些實(shí)體瘤也可易位生成G-CSF,導(dǎo)致副瘤性白細(xì)胞增多[13-14],表現(xiàn)與CNL相似,需注意鑒別。

4CSF3R突變類型與CNL臨床表現(xiàn)及預(yù)后

CNL有兩種不同的CSF3R突變類型,一是常見的近膜端突變,主要包括T618I和T615A點(diǎn)突變。膜近端突變阻止CSF3R的O-糖基化,導(dǎo)致活性二聚體構(gòu)型增加,配體非依賴的受體激活,以及經(jīng)由JAK2的構(gòu)成性下游信號(hào)傳導(dǎo)[15]。已經(jīng)證明最常見的CSF3RT618I突變經(jīng)由JAK-STAT途徑發(fā)揮作用,對(duì)JAK抑制劑蘆可替尼治療敏感。另一種是移碼突變或無義突變,導(dǎo)致CSF3R的胞質(zhì)尾端過早截?cái)啵―771fs、S783fs、Y752X和W791Z)[1,5]。受體的截?cái)嘀率关?fù)調(diào)控基序喪失,包括與受體內(nèi)化有關(guān)的雙亮氨酸分選基序,以及靶向并進(jìn)而降解受體的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)3(SOCS3)的抑制劑結(jié)合位點(diǎn)[16-17],破壞受體轉(zhuǎn)運(yùn),延遲受體內(nèi)化和(或)降解,導(dǎo)致細(xì)胞表面CSF3R表達(dá)增加,STAT5持續(xù)活化,細(xì)胞增殖加強(qiáng)[18]。單獨(dú)的CSF3R的胞質(zhì)尾端截?cái)嗤蛔兛赡懿蛔阋则?qū)動(dòng)白血病發(fā)生,在CNL也極為罕見,對(duì)SRC激酶抑制劑達(dá)沙替尼治療敏感[19]。絕大多數(shù)CNL呈CSF3R基因近膜端突變,最高約30%的患者同時(shí)表達(dá)近膜端突變和胞質(zhì)尾端截?cái)嗤蛔兊膹?fù)合突變。CSF3R基因復(fù)合突變可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生侵襲性致死性白血病,并在體外顯示對(duì)JAK和SRC抑制劑均耐藥,而對(duì)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑trametinib更為敏感[20]。最近,Szuber等[21]將19例CSF3R基因突變CNL患者按照突變類型分組為14例T618I突變和5例其它CSF3R基因突變(包括M696T突變2例,T640N突變,c.2215C>T截?cái)嗤蛔兒虸598ISYN突變各1例),比較2組患者的臨床特征。結(jié)果顯示,CSF3RT618I突變患者具有更多的不良臨床和實(shí)驗(yàn)室特征,傾向于診斷時(shí)年齡更大,白細(xì)胞計(jì)數(shù)更高、血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)值更低,以及異常核型發(fā)生率更高。這些不良特征最終轉(zhuǎn)化為較其它CSF3R突變類型患者顯著降低的整體生存(OS)。

5CNL其它突變基因

除了CSF3R基因突變外,在CNL患者中尚可檢測到不同發(fā)生頻率的其它基因突變,包括ASXL1(47%~77%),SETBP1(0~75%),SRSF2(44%),TET2(20.5%~50%),CALR(5%~12.5%),以及JAK2(8%)等[22-26]。另外,10%左右的CNL患者缺乏CSF3RT618I及其它近膜端基因突變,提示應(yīng)該尚有另外的基因異常參與其白血病發(fā)生。與潛能未定的克隆性造血(CHIP)一致的多種基因突變的檢出,促使考慮在CHIP背景下晚發(fā)CSF3R突變并最終導(dǎo)致CNL表型的可能性。而Zhang等[27]二代基因測序研究結(jié)果顯示,超過半數(shù)的CNL、aCML、CMML、MPN-U或MDS/MPN-U患者表現(xiàn)出3種不同的途徑共同發(fā)生突變,涉及染色質(zhì)修飾、表觀遺傳調(diào)節(jié)、剪切復(fù)合物和信號(hào)傳導(dǎo)基因。CNL這種多通路基因突變共同發(fā)生的模式與aCML、MDS/MPN-U和CMML非常相似,作者提出該病歸類為MDS/MPN較MPN更為合適。CNL是一少見的MPN,臨床表現(xiàn)異質(zhì)性非常高,在缺乏疾病特異性標(biāo)志時(shí)代其精確診斷具有極大挑戰(zhàn)性。2013年CSF3R突變與CNL發(fā)病因果關(guān)系的闡明導(dǎo)致CSF3R突變納入修訂的WHOCNL診斷標(biāo)準(zhǔn),并隨之發(fā)現(xiàn)其它相關(guān)基因。這些CNL致病基因突變的識(shí)別不僅豐富了分子診斷方法,也為基于此的靶向藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

作者:張鳳奎 宋琳