人肝癌細胞凋亡影響半胱氨酸蛋白酶論文

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【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法:采用細胞培養技術，以肝癌細胞系HepG2為靶細胞，以不同濃度的藥物處理細胞48h后，利用WST-8法測定NK-104對細胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察細胞核碎片;以流式細胞儀分析細胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結果:NK-104（10μmol/L）對HepG2細胞有明顯抑制作用，可誘導HepG2細胞凋亡，并能增強caspase-3基因的活性。結論:NK-104能夠誘導HepG2細胞凋亡，其機制與caspase-3依賴性凋亡調節信號通路有關。

【關鍵詞】肝癌

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶抑制劑，統稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑，主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應用于治療高脂血癥［1］。最近研究發現，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學多效性，與降血脂無關。有報道其在體外具有抗癌作用［2］、體內與5氟尿嘧啶（fluorouracil，5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內皮細胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K-Akt）基因激活途徑對內皮細胞的保護作用已有報道［5］，但其在肝癌細胞系的抗癌作用尚未見報道。本文在肝癌細胞系HepG2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodiumsalt］，WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法，研究NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機制提供實驗依據。

1材料和方法

1.1主要材料與儀器NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產化學工業公司（日本東京）產品;熒光染料Hoechst33258、甲羥戊酸（mevalonicacid，MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/LNaCl），Sigma公司產品。流式細胞儀，2000FCA，美國BD公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養人肝癌細胞株HepG2（美國ATCC公司產品）在含10%胎牛血清的DMEM培養基、5%CO2、37℃條件下培養。實驗中，細胞種植于適當培養皿中，90%的細胞融合時，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有NK-104和MEV（1mmol/L）等藥物的培養液，37℃培養箱中培養。

1.2.2WST-8方法利用WST-8試劑盒對細胞增殖進行測定。HepG2細胞（1×104個細胞/孔）接種于含100μl培養液的96孔培養板中，NK-104（0.1～100μmol/L）治療48h后，分別加入WST-8試劑10μl（日本同仁化學研究所）培養2h后，選擇450nm波長，測定各孔的吸光度OD值。

1.2.3Hoechst33258染色細胞經藥物刺激48h后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細胞固定液4℃固定5min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點加Hoechst33258染色液，10min。用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細胞核碎片。

1.2.4流式細胞儀檢測凋亡峰在室溫下將刺激48h后的細胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當的染色緩沖液中吸取100μl的細胞（1×105）至試管中。加入200μlRNaseA，37℃水浴30min，再加800μlPI染色液混勻，4℃避光30min后，立即上機分析。

1.2.5半胱氨酸蛋白酶3比色法經藥物治療48h后收集細胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進行測定（Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，LTD，Japan）。

1.3統計學方法數據均以x±s表示，采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析，采用t檢驗。

2結果

2.1NK-104對HepG2細胞增殖的抑制作用為了確定NK-104在人肝癌細胞HepG2中的治療濃度，采用WST-8方法對細胞的增殖作用進行測定。與對照組相比，NK-104在10和100μmol/L時，對HepG2細胞生長均有明顯的抑制作用。100μmol/L時，近50%的細胞死亡（P<0.01）。見圖1。

圖1不同濃度NK-104對HepG2生長的抑制作用（略）

Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104

**P<0.01，vscontrolgroup.

2.2NK-104誘導細胞凋亡的形態變化對照組細胞界限清晰，胞漿豐富，細胞核呈彌散、均勻熒光分布，經10～100μmol/LNK-104處理后，HepG2發生細胞凋亡，細胞核或細胞質內可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態變化。見圖2。

2.3NK-104對HepG2細胞周期的影響與對照組相比，NK-104治療組可明顯誘導HepG2的細胞凋亡，出現相當比例的DNA含量小于二倍體的亞G1凋亡峰（24%），不同周期細胞的比例也發生變化，與MEV共同作用后可消除NK-104的這種誘導作用。見圖3。

2.4NK-104對caspase-3活性的影響與對照組相比，NK-104可明顯誘導caspase-3活性（P<0.01），同樣加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導作用。見圖4。

圖2NK-104處理48h后HepG2細胞核的形態變化（Hoechst33258染色，×400）（略）

Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours（Hoeschst33258staining，×400）

A:Control，normalnuclearstructure;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104100μmol/L;●:Cytoplasmicchange;■:Nuclearfragmentation.

圖3NK-104治療HepG2細胞后細胞周期分布變化（略）

Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104（PercentageofSubG1cells）

**P<0.01，vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104+MEV.

圖4NK-104對caspase-3活性的影響（略）

Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3

**P<0.01，vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104（10μmol/L）alone，orNK-104（10μmol/L）plusMEV（1mmol/L）for48hours.Thecaspase-3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay.

3討論

目前認為惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，其發生的分子基礎是原癌基因的激活或抑癌基因的突變失活或缺失，導致某些細胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成腫瘤。原發性肝癌約55%發生在中國［6］。肝癌細胞的凋亡在肝癌的發生發展、轉歸及治療等方面均有重要的意義。HMG-CoA還原酶抑制劑，是重要的脂類合成抑制劑，臨床上廣泛應用于治療高脂血癥。最近研究表明，HMG-CoA還原酶抑制劑具有抗感染、降低炎性細胞因子水平及抗癌等生物學多效性作用。Otsuki等［7］報道1～30μmol/L的西米伐他汀（simvastatin）具有預防癌癥的作用。Sutter等［8］研究認為1～10μmol/L的弗魯伐他汀（fluvastatin）通過誘導Huh7細胞凋亡而抑制肝癌細胞的增殖。Denoyelle等［9］認為25μg/L的賽里伐他汀（cerivas-tatin）對MDA-MB-231人乳腺癌細胞通過抑制細胞核因子κB活性起到重要的抗轉移作用。HepG2細胞具有典型肝癌細胞的一系列惡性特征，是研究和評價防治肝癌藥物的較理想的細胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA還原酶抑制劑，具有副作用小、高效和強力的藥代動力學特點［4］。我們的研究結果表明，NK-104對HepG2細胞增殖有明顯抑制作用，其最大抑制率可達50%左右，使HepG2細胞呈現典型的凋亡形態學特征，核質濃集，有凋亡小體。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌細胞的增殖。流式細胞術具有檢測的細胞數量大、反映群體細胞的凋亡狀態比較準確等優點［10］。NK-104作用于HepG2細胞后，通過流式細胞儀分析，與對照組相比，可見凋亡細胞出現在直方圖亞二倍體峰位置，并與細胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整個細胞群百分比。本研究結果表明，NK-104可明顯誘導HepG2細胞凋亡。細胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相對較明確的為caspase-3。caspase-3是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應分子，被稱為凋亡的“執行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相應的胞核內底物DNA修復酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP），使PARP失去對DNA的修復功能，導致細胞轉向凋亡［14］。本研究表明，10μmol/LNK-104能夠增強caspase-3的活性，加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導作用。這一研究結果表明，NK-104誘導HepG2細胞凋亡與激活caspase-3依賴性凋亡調節信號通路有關。

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