君白菊組織培養(yǎng)研討

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君白菊具有疏散風(fēng)熱、平肝明目、清咽潤喉、護肝正氣等藥用價值，還是唯一不需使用任何農(nóng)藥的高品質(zhì)飲用菊花茶，含有人體保健最需要的17種氨基酸和8種礦物質(zhì)，無論在營養(yǎng)、口感還是在保健方面都超過了傳統(tǒng)茶菊，它的胎菊中維生素E含量高出一普通飲用菊花數(shù)倍，擁有很好的抗衰老功效。君白菊也是重要的林下經(jīng)濟栽植品種君白菊在種植上具有抗寒、抗旱、抗病蟲害等特點，對環(huán)境條件要求不高，可以充分利用林下空地進行合理栽植，既構(gòu)建形成了穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)、增加了生物多樣性，又為農(nóng)民創(chuàng)造了客觀的經(jīng)濟收人，實現(xiàn)了資源共享、經(jīng)濟共贏的復(fù)合經(jīng)營模式。筆者首次對君白菊微體繁殖和葉片不定芽再生體系進行了研究，建立了以此為基礎(chǔ)的兩個擴繁體系，為君白菊在經(jīng)濟、生態(tài)等方面的綜合價值開發(fā)和利用奠定了快速繁育的技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

供試材料為盆栽君自菊植株，每月用2%。的NaclO消毒液對其進行l(wèi)次消毒。實驗于2009年12月至2010年3月進行取材，選取健壯無病蟲害的莖，剪取頂端以下3一4個幼嫩的帶腋芽的莖段作為實驗材料。

1.2微體快繁體系的建立

1.2.1最佳消毒滅菌體系的建立實驗采用酒精和NaC10作為滅菌劑。對帶芽莖段進行初步滅菌，用75%酒精浸潤材料305后，迅速用無菌水沖洗4次，然后再分別用2%、3%、5%、10%的NaCIO溶液消毒smin，消毒結(jié)束后用無菌水沖洗4次。最后，將滅菌后的帶芽莖段接種在MS培養(yǎng)基上，每種處理接種外植體10個，實驗重復(fù)3次。IOd后觀察統(tǒng)計，根據(jù)外植體的污染率、死亡率、成活率等指標篩選出最佳的外植體消毒滅菌體系。成活率=外植體數(shù)一污染率一死亡率

1.2.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑對增殖的影響實驗采用MS作為基本培養(yǎng)基，以細胞分裂素6一節(jié)基嘿吟(6一BA)和細胞生長素蔡乙酸(NAA)作為植物生長調(diào)節(jié)劑，共設(shè)6種處理(見表l)。將消毒后的帶芽莖段置于增殖培養(yǎng)基中，對其進行不定芽誘導(dǎo)，每種處理接種10個外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計其增殖系數(shù)(接種后死亡莖段不計人其中)。

1.2.3不同基本培養(yǎng)基對生根的影響將增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的不定芽進行切割分離，一部分繼續(xù)留作增殖培養(yǎng)，一部分則切割成約1.5一2.ocm的帶芽莖段接種于1/2MS和Ms兩種基本生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基都各加NAAlm夢L，每處理接種10個左右的外植體，重復(fù)3次。25d后統(tǒng)計生根率。

1.2.4不同生長素種類和濃度對生根的影響外植體的切取方法同

1.2.3，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基各加不同濃度的蔡乙酸(NAA)和叫噪丁酸(IBA)，共計6種處理組合(見表2)。每處理接種10個外植體，重復(fù)3次。20d后統(tǒng)計生根率(死亡、污染外植體不計人其中)。

1.3葉片不定芽再生體系的建立

1.3.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

將微體繁殖中帶芽莖段繁殖成功的無菌苗葉片切成0.somx0.scm左右的小塊，作為葉片不定芽再生誘導(dǎo)的外植體，以MS作為基本培養(yǎng)基，將其置于添加了不同生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中。各種處理組合見表1。每處理6瓶，每瓶4個外植體。20d后統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的葉片數(shù)/接種的葉片數(shù)x100%

1.3.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽分化的影響將養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)，其中分化培養(yǎng)基以表1中1一4號6一BA和NAA處理組合為依據(jù)，每處理6瓶，每瓶4個外植體，20d后統(tǒng)計其分化率和分化系數(shù)(褐化，死亡的愈傷組織不計人其內(nèi))。分化率二分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)x100%分化系數(shù)=分化的不定芽數(shù)/分化的愈傷組織數(shù)xroo%培養(yǎng)基均添加7留L瓊脂，25歲L蔗糖，PH為5.8一6.0，高壓滅菌121℃20min，組培室的培養(yǎng)條件為室溫(25土2)℃，空氣相對濕度60%左右，每個培養(yǎng)架的光照由2根40W的直管型熒光燈管提供，強度為2000~3O00h左右，采用每日光培養(yǎng)16h和暗培養(yǎng)sh的光周期(6:ooam一10:oopm)。LS數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用MierosoftExee一和sPss軟件處理，多重比較采用LSD檢驗法。

2結(jié)果與分析

2.1離體快繁體系的建立

2.1.1帶芽莖段最佳滅菌體系的建立用75%酒精對外植體進行滅菌不僅是對材料的初步消毒，而且酒精還可以浸潤外植體的表面，這樣就能夠使NaCIO消毒劑更容易均勻地滲透到外植體表面上，殺死細菌和真菌。其中，合適的NaCIO的濃度是最佳滅菌體系建立的關(guān)鍵。在經(jīng)過不同濃度的NaClo消毒smin后，分別進行l(wèi)od的啟動培養(yǎng)，即可統(tǒng)計污染率、死亡率和成活率。如圖1所示，2%NaCIO消毒液處理后的外植體污染率較高，可達到40%以上，而其他3種濃度的消毒液污染率都維持在較低水平，不高于5%。另外，10%NaCIO的消毒液處理后外植體的死亡率較高，為60%左右，其次為2%的NaCIO消毒液。綜合來看，不同濃度的NaC10消毒液外植體的成活率為3%>5%>lO%>2%。其中，3%和5%的成活率都較高，都大于90%且相差不大，是君白菊帶芽莖段外植體較好的NaCIO消毒滅菌濃度。

2.1.2不同生長調(diào)節(jié)劑對帶芽莖段增殖的影響將帶芽莖段接種于增殖培養(yǎng)基后1一2d，腋芽迅速膨大萌發(fā)成幼嫩小葉片，95%以上的外植體都可以完成啟動生長，3od左右完成增殖培養(yǎng)的過程。1個月以后，外植體隨著培養(yǎng)時間的進一步增加和培養(yǎng)基營養(yǎng)的流失，長勢開始出現(xiàn)衰退，葉片有枯黃、枯萎的現(xiàn)象。因此，應(yīng)在1個月左右及時進行下一代的轉(zhuǎn)接和增殖。在增殖生長過程中，細胞分裂素是細胞增殖中一種重要的調(diào)節(jié)激素，它與植物生長素共同配合影響增殖的進程和增殖系數(shù)。如表3所示，在6一BA和NAA不同激素處理組合中，帶芽莖段的增殖系數(shù)達到3.5一5.5，其中最大的增殖系數(shù)為5.5，出現(xiàn)在處理3中，說明MS+3.Om夢L6一BA+0.sm留LNAA是君白菊帶芽莖段最佳的增殖培養(yǎng)基。此外，通過對不同種植物生長調(diào)節(jié)劑的顯著性比較可知，6一BA濃度為1.0、2.0、3.om夢L和4.0、5.0、6.Om夢L時，它們組內(nèi)間的差異不顯著，但兩者之間差異顯著，結(jié)合增殖系數(shù)可知，6一BA為1.0一3.0m妙濃度時對帶芽莖段的增殖效果較好。同理可知，NAA濃度為0.5、一。、1.sm留L之間和0.1、0.2、o.sm留L之間時，它們組內(nèi)間差異不顯著，兩者之間差異顯著，0.1一0.5m夢L對帶芽莖段增殖系數(shù)影響較大，最佳的NAA濃度水平為0.sm留L。2.2葉片不定芽再生體系的建立

2.2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑對誘導(dǎo)愈傷組織的影響葉片接種于表6的各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基后15d，在葉片與培養(yǎng)基接觸的地方開始有少量的愈傷組織生長，靠近葉柄的地方愈傷生長量較大。前期愈傷組織生長迅速，呈現(xiàn)黃綠色或淡綠色的顆粒狀突起，愈傷組織很緊實，生長較好。經(jīng)過1個月左右，愈傷組織生長緩慢，逐漸有部分愈傷呈現(xiàn)褐化的趨勢，并趨于死亡。6一BA和NAA的各種組合均能較好的誘導(dǎo)出葉片的愈傷組織，其中處理2、4、5、6的愈傷誘導(dǎo)率可達到90%以上，不同種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷量有所不同，隨著處理卜6細胞分裂素的增加，愈傷量逐漸增加。因此，通過對表6分析可知，誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為處理4、5和6。

2.2.2不同生長調(diào)節(jié)劑對不定芽分化的影響將誘導(dǎo)的淺綠色、緊實、生長較好的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基10d后，部分愈傷組織開始進行不定芽分化。由表7可知，君白菊整體誘導(dǎo)分化率較低，大部分的愈傷組織都不能繼續(xù)分化，最高分化誘導(dǎo)率的處理為3，即MS+3.06一BA+0.SNAA，誘導(dǎo)率為28.6%。此外，在實驗中，愈傷組織分化率也較低，每塊愈傷組織僅能誘導(dǎo)分化出1一2個不定芽，最高的分化系數(shù)為處理2，即MS+2.06一BA+0.2NAA，分化系數(shù)為2.3。3結(jié)論與討論在植物離體培養(yǎng)中，誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生主要受培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑以及植物基因型等因素影響l’一s]o王麗華、王永清等人在對菊花的組織培養(yǎng)進行研究時發(fā)現(xiàn)13一71，MS培養(yǎng)基是適宜菊類植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，因此本實驗以MS作為君白菊的基本培養(yǎng)基，通過添加不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)植物形態(tài)發(fā)生，建立了君白菊的微體繁殖再生體系。實驗選擇幼嫩的帶芽莖段作為外植體，建立了最佳滅菌體系:75%酒精305、無菌水沖洗4次、3%一5%NaCIO溶液浸潤振蕩smin，無菌水沖洗4次。通過對不同種植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和配比比例的調(diào)節(jié)，篩選出了君白菊帶芽莖段的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+3.om彭L6一BA+0.5m留LNAA，最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0m叭IBA。

實驗中通過IBA誘導(dǎo)出的根粗壯，生根率也較高，但有部分根是從愈傷組織中誘導(dǎo)出來，這樣的根與試管苗聯(lián)結(jié)性較差，不利于移栽成活，因此在后續(xù)的實驗中應(yīng)注重這一方面的研究。筆者在對君白菊葉片誘導(dǎo)分化再生體系進行初步的探索中，誘導(dǎo)出了生長良好的愈傷組織，誘導(dǎo)率可達90%以上，但將其繼續(xù)誘導(dǎo)分化不定芽時，分化率和分化系數(shù)都較低，這一方面可能由于實驗中處理組合不夠全面和充分，未能找到合適的君自菊葉片誘導(dǎo)分化最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合，另一方面也可能由于植物自身的基因型所限陣”分化困難，其原因還有待進一步的實驗和探討。