腎臟纖維化動物模型研究論文

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【關鍵詞】動物模型

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：20060785)

近年來，研究了許多抑制ECM積聚的細胞因子，其中肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)作為一種抗纖維化的因子得到了越來越多的研究。它不但能加速急性腎衰中腎小管上皮細胞的再生,而且能減緩慢性腎衰的進程。在體實驗發現,加入HGF可以改善腎纖維化的程度,而加入HGF的特異性抗體則加速腎纖維化的進展，顯示出良好的治療前景。多項研究表明,急性腎衰竭(acuterenalfailure，ARF)患者血清HGF的水平呈顯著增加,并在一定程度上有助于ARF患者腎功能恢復［1-3］。本文就近年來對HGF和其受體c-met的研究，以及其在腎臟纖維化動物模型中的研究作一綜述。

1．HGF/c-met的一般生物學特性

1.1HGF的起源肝細胞生長因子(HGF)又名Scatter因子(scatterfactor，SF)，因其與血液凝固級連反應的酶具有結構同源性,而成為纖溶酶原相關生長因子(theplasminogenrelatedgrowthfactorsfamily，PRGFs)家族的成員之一。它最初是從部分肝切除的大鼠血漿中分離純化獲得的，因能刺激原代培養的肝細胞生長而得名。1987年日本的中村敏一從3000只大鼠的血小板中將HGF純化成單一的蛋白質，1989年根據HGFN末端氨基酸序列成功地克隆了HGF的cDNA并得出了其全氨基酸序列，并用基因重組的方法人工合成了HGF。

1.2HGF/c-met的結構和作用機理HGF是由由分子量69kD的重鏈(α鏈,465個氨基酸)和34kD的輕鏈(β鏈,234個氨基酸)以二硫鍵連接而成的異二聚體糖蛋白。重鏈N末端的31個氨基酸為信號序列，其后由1個發夾域和4個卷曲域組成花瓣式構造，輕鏈含有絲氨酸蛋白酶樣結構。HGF的單鏈前體無生物活性，雙鏈的成熟HGF才是其具有生物活性的分子。HGF的受體是c-met原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶［4］，是目前已知的HGF的唯一受體，在腎臟表達相當廣泛，主要分布于近曲小管、髓袢厚段、薄段以及集合管。c-met是由分子量50kD的α鏈和145kD的β鏈組成的異二聚體跨膜蛋白，α鏈在膜外，β鏈橫跨細胞膜。β鏈的胞外端富含與HGF結合有關的丙氨酸，而胞內端則富含酪氨酸激酶構域。其中c末端的MDS可與信號傳遞分子發生特異性結合。HGF與受體結合后使酪氨酸激酶活化，導致c末端酪氨酸殘基磷酸化，從而發揮HGF的多種生物學功能。HGF/c-Met信號傳導途徑對于胚胎發育過程中腎的器官發生，正常結構的維持和患病腎的修復和再生都起著重要作用。

HGF通常由間質來源的細胞產生，如腎小球系膜細胞、內皮細胞、間質成纖維細胞和巨噬細胞等。在腎小球區主要由內皮細胞及系膜細胞產生，在腎小管間質區主要由間質細胞和巨噬細胞產生。HGF與受體結合引起酪氨酸激酶活化，激活細胞內多個信號級聯反應,包括三磷酸肌醇激酶(PI-3K)，Grb/sos/Ras復合物，Gab-1，Shp-2，磷脂酶C，Ras-GTP酶活性蛋白和c-Scr等。因此HGF是一種多效性的生長因子，對多種細胞具有多種生物學活性，包括細胞生存，增殖，移動，和分化等（5，6，7，8）。炎癥介質(IL-1，INF-α，TNF-α，TGF-α等)、去甲腎上腺素均可誘導HGF的表達，值得一提的是HGF可以誘導自身及受體表達的提高。而TGF-β，糖皮質激素，1，25二羥基維生素D3和維甲酸等則抑制其表達［9］。HGF通過內分泌、自分泌及旁分泌方式發揮作用［7-10］。

2HGF與各種動物模型腎纖維化的關系

在慢性損傷后，大多數CKD動物模型中內源性HGF的表達被短暫地誘導［11-12］。兩組研究群體獨立地證明/論證了用中和性的抗體阻斷/封閉HGF信號顯著地促進了組織纖維化和腎功能異常的出現和進展［11-13］，暗示了在慢性腎臟病中誘導HGF的表達對于保護正常腎臟結構和功能是有益的。研究發現，HGF不僅阻止了慢性腎臟病（chronickidneydisease，CKD）的發生和發展也顯示了它在組織已經受損時的治療有效性。同時還發現HGF能協同其它治療物質如腎素-血管緊張素系統抑制劑來抑制腎間質纖維化。

2.1HGF與慢性腎小球腎炎在一種ICR品系衍生的腎小球腎炎的基因小鼠（ICRstrain-derivedglomerulonephritismice，ICGNmice）的早期階段，應用中和性的抗HGF抗體，中和內源性HGF加速了ECM的積聚，增加了轉化生長因子－β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)的表達，和腎小管的細胞凋亡，導致了進行性腎纖維化和腎功能不全［13］。

相反，給ICGN小鼠提供外源性HGF蛋白抑制了TGF-β1的表達并阻止了腎纖維化和慢性腎功能不全［13-14］。Mori等［15］用anti-Thy-1.1抗體制備的實驗性系膜增生性腎小球腎炎大鼠模型進行研究，于模型制備完成的第2至第9天連續給予腹腔內注射重組的人HGF0.8mg/(kg·d)，此后連續觀察8周，發現HGF干預組的大鼠腎臟腎小球的恢復加快，表現為毛細血管內皮細胞增生和毛細血管的再生。

2.2HGF與殘余腎Liu和Rajur等［11］應用5/6腎切除的大鼠殘余腎模型，在給予了中和性的HGF抗體后，擁有殘余腎的大鼠經歷了腎小球濾過率的迅速下降和血漿肌酐水平的上升，伴隨腎纖維化損傷的加重，從而證明了內源性的HGF保護了殘余腎進行性發展的腎纖維化和慢性腎功能不全。Dworkin等在5/6腎切除大鼠模型中加入HGF蛋白或它的基因也可以抑制殘余腎的腎纖維化損傷并減輕腎功能不全。

2.3HGF與梗阻性腎病一些實驗證實了給予外源性HGF減弱了通過單側輸尿管接扎造成的小鼠和大鼠梗阻性腎病模型的腎間質纖維化。Gao等制備了單側輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）的大鼠模型，將外源性HGF基因導入大鼠骨骼肌細胞后，病腎的內源性HGF和c-met上調。在術后第14天與第28天，基因治療后病腎的纖維形成，巨噬細胞浸潤和小管萎縮的現象明顯弱于對照組。Mizuno等分別給予UUO小鼠HGF的中和性抗體和外源性的重組人HGF，發現前者加速了病腎小管間質纖維化的進程并伴有TGF-β表達的增高，而后者則作用完全相反。Yang和Liu證實了在UUO小鼠模型中，術后3天，梗阻側的腎臟呈現出典型間質纖維化損傷，以肌成纖維細胞活化，纖維粘連蛋白過渡表達，間質基質沉積和TGF-β1上調為表現。從這一時間點開始，連續11天給予小鼠外源性HGF，發現治療組α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）水平較對照組減少大于70%，ECM和TGF-β1以及其I型受體顯著的減少，抑制了腎間質纖維化的進展。

一種聯合應用HGF基因和腎素-血管緊張素系統抑制劑的治療方法已經證實能產生協同效應而減弱腎小管間質纖維化。此項聯合治療法應用了人HGF基因和一種血管緊張素II的I型受體抑制劑氯沙坦，保護了UUO大鼠梗阻側腎臟的總體形態和結構，幾乎完全消除了α-SMA，抑制了ECM的積聚和腎臟的TGF-β1及其I型受體的表達，減輕了腎間質纖維化。

2.4HGF與糖尿病腎病一些實驗已經證實了外源性HGF可以顯著改善小鼠和大鼠的糖尿病腎病。Dai等在鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的單腎切除后的糖尿病小鼠體內注入外源性的HGF基因，發現治療組小鼠腎臟TGF-β1的表達被抑制，纖維粘連蛋白和I型膠原沉積減少，間質肌成纖維細胞活性被抑制，改善了糖尿病腎病的腎臟病理改變。Mizuno和Nakamura［12］應用STZ制備的糖尿病小鼠進行研究，在小鼠出現高血糖癥后的第4至第6周給予抗HGF的IgG抗體，發現腎小球的病變顯著的加重了。而在STZ誘導后的第6至第10周期間給予重組的HGF后，發現盡管高血糖的水平沒有改變，但腎小球系膜細胞內TGF-β1的含量減少了，進行性發展的腎小球肥大和硬化也幾乎完全被抑制了。Kagawa等應用一種遺傳性糖尿病小鼠模型-db/db小鼠進行研究，在實驗小鼠出生后12周齡時，在它們后肢肌肉處注射腺病毒編碼的人HGF基因，到達24周齡時進行糖尿病腎病的評估。結果發現基因治療組小鼠腎小球和腎小管的纖維化明顯少于對照組，腎小球內皮細胞和小管上皮細胞的凋亡也顯著降低，并且腎臟的TGF-β1的表達也顯著減少，db/db小鼠的生存期也明顯延長。Cruzado等在STZ誘導的糖尿病大鼠的早期和進展期糖尿病腎病階段分別應用人HGF基因治療，發現進展期糖尿病腎病大鼠的腎臟TGF-β1和系膜結締組織生長因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）的上調被抑制，同時也抑制了腎臟的金屬蛋白酶組織抑制劑-I（tissueinhibitoeofmetalloproteinase-I，TIMP-1）的表達，減少了腎臟間質肌成纖維細胞的數量，減輕了腎纖維化。

2.5HGF在其它腎病模型中的作用Azuma等發現每天注射外源性HGF4周能夠阻止大鼠慢性同種異體移植物腎病的進展。

Kuroiwa等在（C57BL/6×DBA/2）F1（BDF1）小鼠體內注射DBA/2小鼠的脾細胞后誘導了小鼠慢性移植物抗宿主病，并出現系統性紅斑狼瘡的組織病理學改變。在造模后12周內，每兩周重復轉染HGF基因一次，發現通過HGF基因轉染有效的減少了治療組小鼠狼瘡腎炎的蛋白尿量和組織病理學改變。

另外，HGF與碘麝香草酚酸腎病和環孢霉素A腎病的動物模型中的有效性也已經被報道［15］。

3結論

研究表明，HGF作為一種內源性因子，它可以減輕慢性損傷后腎臟組織的纖維化損傷。它的抗纖維化效應主要是通過它抵抗TGF-β1的促纖維化活性來介導的。由于TGF-β1已經被廣泛的認同是在各種類型的損傷后腎纖維化的發病原因，越來越多的實驗證據顯示，HGF是主要的抗纖維化因子可以對抗TGF-β1的活性。根據本文，我們可以發現給與外源性HGF或誘導內源性HGF的表達很可能提供一種有效的方法來治療慢性腎臟纖維化。但是離臨床應用還有一定的距離，比如給藥的途徑，劑量，頻率等，盡管目前有較多的動物試驗的證據支持，但尚需要大量的臨床的試驗來進一步證明。

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