抗菌肽的研究論文

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青霉素的發現使人們對由病原微生物感染而引發的各類疾病不再束手無策,并由此發展了大量的β-內酰胺類抗生素,對保護人類健康作出了巨大貢獻。但隨著上述“傳統抗生素”的廣泛使用,不斷產生出諸多新問題。如β-內酰胺類抗生素的過敏反應以及長期使用導致抗藥菌株的產生。于是人們開始尋找新一代抗菌劑。近期的研究發現,某些陽離子型多肽具有廣譜的抗菌活性,同時具有“傳統抗生素”無法比擬的優越性:不會誘導抗藥菌株的產生,有希望成為新一代抗菌劑[1]。

抗菌肽(antimicrobialpeptides)是具有抗菌活性短肽的總稱。1975年瑞典科學家G.Boman等人[2]等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到一種殺菌肽,并將其命名為cecropin。此后,許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級結構和基因序列得到確定。80年代,有關抗菌肽的研究主要集中在大型的經濟昆蟲。90年代以來,在繼續對大型經濟昆蟲進行研究的同時,又擴展到一些小型昆蟲和其它無脊椎及脊椎動物,抗菌肽已成為免疫學和分子生物學研究的熱點。研究的內容包括:抗菌肽的分離與純化,氨基酸序列的分析,蛋白質構型與功能的關系,抗菌肽的作用機理[3,4],應用基因工程克隆與表達抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及動植物的轉抗菌肽基因工程等,其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視[5,6]。目前已發現抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界,包括細菌、動植物和人類。這種內源性的抗菌肽經誘導而合成,在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用,更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有廣譜殺菌作用,大多數對革蘭氏陽性菌有較強的殺滅作用,有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。對某些真菌、原生動物,尤其對耐藥性細菌有殺滅作用,并能選擇殺傷腫瘤細胞,抑制乙型肝炎病毒的復制。

1.抗菌肽的分類

迄今為止從不同生物體內誘導的抗菌肽已不下200種,僅從昆蟲體內分離獲得的就多達170余種。根據抗菌肽的結構,可將其分為5類:(1)單鏈無半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由無規則卷曲連接的兩段а-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins,Magainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發現的,它是爪蟾的皮膚在一定的環境壓力下分泌出的抗感染和促進傷口愈合的成分,由兩個緊密相連的肽鏈組成,每一個肽鏈有23個氨基酸,低濃度便可抑制許多細菌和真菌生長[7]。(2)富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一個二硫鍵的抗菌肽,該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細胞中產生的Brevinins[9]。(4)有兩個或兩個以上二硫鍵,具有β折疊結構的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內有6個Cys形成3個分子內二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬β轉角的反向平行的β片層[10]。實驗證明,分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關重要。(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽。

2.抗菌肽的作用及機理

2.1抗菌肽的抗菌作用及其機理抗菌肽分子可以在細菌細胞質膜上穿孔而形成離子孔道,造成細菌細胞膜結構破壞,引起胞內水溶性物質大量滲出,而最終導致細菌死亡?？咕姆肿邮紫冉Y合在質膜上,接著其分子中的疏水段和兩親性α-螺旋也插入到質膜中,最終通過膜內分子間的相互位移,抗菌肽分子聚集形成離子性通道,使細菌失去了膜勢而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出的實驗結果表明,抗菌肽只是結合到了單位膜的表面上,并未插入膜中,更未形成通道。然而,抗菌肽的作用靶部位是細菌細胞質膜,以及抗菌肽的作用結果是導致細菌細胞質膜通透性增大等基本內容是確切無疑的,這也正是抗菌肽與青霉素等傳統抗生素對細菌作用機制不同的本質所在。

2.2抗菌肽的抗病毒作用及其機理研究發現煙芽夜蛾幼蝦的血淋巴對6種DNA、RNA病毒有明顯的抑制作用,使病毒感染力迅速降低,而且這種抗病毒活性具有廣譜性。Mariam[16]試驗表明來源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins類抗菌肽具有抗皰疹病毒-HSV的作用,還發現人的嗜中性粒細胞防御素(HNP-1)對一種皰疹病毒有抑制作用。此外,蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表達,從而抑制減少HIV-1的增殖。這表明抗菌肽對于當今人類的頑癥———艾滋病也有抑制作用。

2.3抗菌肽的抗寄生蟲作用及其機理抗菌肽可以有效地殺滅產生人類及動物寄生蟲病的寄生蟲,如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發現一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對萊什曼原鞭毛蟲有損傷作用,起作用的靶目標是細胞質膜,它可以快速降低H-OH+的通透性,破壞膜電勢,質膜形態也受到損壞。Shahabuddin[17]研究發現昆蟲抗菌肽對感染蚊子的瘧原蟲發育的不同時期有不同的作用,主要對瘧原蟲的卵囊期和子孢子期造成明顯的損傷。

2.4抗菌肽對腫瘤細胞作用及其機理國內外已對抗菌肽殺傷腫瘤細胞的作用進行了廣泛研究,發現抗菌肽對體外培養的癌細胞的作用主要是使癌細胞膜上形成孔洞,內容物外泄,線粒體出現空泡化,嵴脫落。核膜界限模糊不清,有的核膜破損,核染色體DNA斷裂,并抑制染色體DNA的合成,細胞骨架也受到一定程度的損傷[18,19]。通過對荷瘤小鼠的研究證明,抗菌肽能顯著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的積累;對S180肉瘤和U14宮頸癌的抑瘤率亦達30%-50%[20]。抗菌肽還可以調動機體的免疫機能,從體液免疫方面來抵抗癌瘤的入侵。

3.抗菌肽基因的融合表達

抗菌肽的天然產量低,合成或從機體中提取步驟復雜、產率低、價格相當昂貴,利用基因工程技術生產抗菌肽具有重要意義?？咕乃鶖y帶的堿性氨基酸使其對蛋白酶非常敏感,必須采用融合表達策略以抵消其堿性并降低其對宿主細胞的毒性。

謝維等合成了家蠶抗菌肽CMIV基因,并將其克隆到金黃色葡萄球菌A蛋白和IgG親合的結構域ZZ的融合表達載體中,得到Pezz318-CMIVV質粒,以此質粒轉化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表達的蛋白,用CBr切割后,得到CMIV肽。李秀蘭等[21]對天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動,根據E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片斷,重組到測序載體,再將此片斷重組到表達載體Pet28上進行表達,融合蛋白經CNBr裂解后,具有與天然抗菌肽相同的生物活性。吳映雅等將柞蠶抗菌肽D基因連接在牛成纖維細胞生長因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表達,表達產物具有抗菌活性和牛成纖維細胞生長因子的抗原性。Kevin等[22]HNP(humanneutrophilpeptide1)和CEME(syntheticcecropin/melittinhybrid)分別與GST(glutathione-S-transferase)、ORRF、IgG結合序列及SPA(staphylococcalproteinA)在E.coli或S.aureus中融合表達,結果在S.aureus中雖實現了與SPA的融合分泌表達,但表達產量較低;Zhang等[23]選擇RepA蛋白的序列作為抗菌肽的融合表達伴侶,并插入Histag等序列作為純化親和位點,實現了在E.coli中的融合表達。ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個供體抗菌肽的活性都高。

4.抗菌肽轉基因研究

王志興等把大麥α-淀粉酶的信號肽序列和抗菌肽CecropinB基因或HhivaA基因構成嵌合基因,并把此基因導入馬鈴薯,結果加信號肽序列的CecropinB轉基因植株發青枯病延遲,病情指數降低。Yarus等[24]用顯微注射法將牛氣管抗菌肽基因轉入小鼠,轉基因鼠在牛氣管抗菌肽基因控制序列的驅動下成功的表達了牛氣管抗菌肽,在鼠乳中的牛氣管抗菌肽對大腸桿菌具有抗菌活性。Reed等研究了以IL-2啟動子/增強子控制轉基因鼠中抗菌肽的合成及隨后對布氏桿菌的抑制作用。Reed[25]構建了這樣一個DN斷:Shivala片斷,SV40多腺苷酸化/剪切信號肽基因片斷,此片斷加到鼠IL-2基因5’側-593─+110區域。在受精卵精前核時將此融合基因注入受精卵(微注射法),得到26系小鼠。RT-PCR檢測:有兩系轉基因鼠,當其脾淋巴細胞置于3.25mg/kg的conA(刀豆蛋白,一種抗原誘導物)時,可以誘導產生成熟的ShivalamRNA。用一定量的布氏桿菌接種時,有兩系小鼠遭到攻擊。四星期后,在轉基因鼠脾臟組織布氏桿菌比非轉基因鼠少得多(P<0.05)。DavidWinder等[26]把編碼Ceropin或Melittin的基因放置在MLV(鼠白血病病毒)的啟動子下,轉染到EJ細胞(人膀胱癌細胞),然后把這些細胞注入到裸鼠內,發現這些腫瘤細胞停止生長或生長減弱DavidWinder等用PCR擴增,Prepromelittin(PPM前蜂毒素原),Premelittin(PM前蜂毒素)和Prececroppin(PC前抗菌肽)三種核酸片斷,均置于MLV啟動子下構建融合基因轉染進EJ細胞。三種類型的EJ細胞分別注入裸鼠后,測定50d后的腫瘤生長情況,無抗菌肽基因片斷的EJ細胞(對照組)致瘤率為70%,帶Cecropin基因片斷的EJ細胞致瘤率只有39%,PPM為50%,PM為65%,其抑制腫瘤的效果明顯。

5.抗菌肽的應用前景

目前,大部分植物抗菌肽是從植物種子中分離獲得的,它們可以保護植物組織和種子不受真菌病原菌的侵害,但是植物抗菌肽對大部分細菌無抑制活性。因此,依靠基因工程的方法用其它真核生物的抗菌肽基因來轉化農作物,培育抗病新品種是當前國內外研究的一個熱點。

動物抗菌肽和干擾素、補體一樣是機體非特異性天然防御系統的重要組成部分。機體受損傷或病原微生物入侵時,能迅速產生抗菌肽來殺傷入侵者,它對正常真核細胞幾乎沒有作用。另外,因為抗菌肽的合成速度非?？?假定核糖體上肽鍵合成速率不變,抗菌肽的產生比IgM要快100多倍),［27］而且小肽的擴散比大的蛋白質和免疫細胞更加迅速,作用更顯靈活,所以Boman曾指出,抗菌肽是機體的一種理想的一線防御物。與普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌譜”更廣,除了抗細菌外,有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、有包膜的病毒及癌細胞(對癌細胞的選擇性作用可能與其細胞骨架的改變有關),同時能加速免疫和傷口愈合過程。這預示抗菌肽在治療及預防癌癥和抗病毒、抗感染等方面具有良好的應用前景。更為重要的是,由于抗生素的濫用導致菌株產生了抗性,人們需要尋找新的抗菌藥劑。抗菌肽這種從生物體中獲得的物質恰巧具有獨特的抗菌機理,不是像一般的抗生素那樣通過阻斷生物大分子的生物合成來發揮作用,因而極有希望開發成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。

隨著研究工作的進一步深入,可以預見,抗菌肽及其基因工程在醫藥、衛生、食品工業及農業等方面將會發揮更為重要的作用。另外,有些抗菌肽分子中含有D-氨基酸,這也為研究D-氨基酸如何在核糖體上合成多肽提供了一個理想的模式體系。

6.研究展望及存在問題

抗菌肽是哺乳動物防御系統的一個重要組成部分,具有熱穩定、水溶性好、廣譜殺菌甚至有的能殺真菌、原蟲等優點,而且許多抗菌肽在100℃加熱10min條件下仍能保持一定活力,且對較大的離子強度和較低或較高的pH都有較強的抗性,而對真核細胞幾乎無作用,僅作用于原核細胞和發生病變的真核細胞,并且與抗生素通過阻斷大分子生物合成的作用機制完全不同,病源菌不易對其產生耐藥性,由此顯示了它具有獨特的研究和應用價值。近20年來,人們對昆蟲抗菌肽已進行了比較系統的理論和應用研究,但有關畜禽抗菌肽基因工程應用研究方面的報道較少。從哺乳動物抗菌肽特有的性質,顯示了它具有以下幾個方面在畜牧生產上的研究和應用前景。研究展望及存在問題

6.1藥用前景隨著傳統抗生素的廣泛及長期的應用,許多病源菌對它們產生了耐藥性,而具有廣譜抗菌且有獨特的抗菌機制的抗菌肽顯然在這方面的應用研究中具明顯優勢。隨著對抗菌肽結構與活性的關系、抗菌肽作用機制及其基因表達調控機制認識的不斷深化,設計一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

6.2轉基因研究及應用仔豬腹瀉、奶牛乳房炎及各種病毒性疾病如豬瘟、雞新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧業的發展。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉基因工程,如轉基因蚊子、轉基因馬鈴薯、轉基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉入畜禽特定細胞讓其表達,從而產生抗病新品種,不失為一條發展畜牧生產的新思路,前景深遠。

6.3抗菌肽基因表達調控及抗菌肽添加劑研究研究表明,［28］抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生物平衡,并易在動物體內殘留,嚴重影響了畜產品的品質和人類的健康。用基因工程方法生產環保型抗菌肽添加劑,或者,通過日糧因素調控抗菌肽基因的表達而達到畜產品無抗素化值得進一步研究。

然而,由于抗菌肽分子小,分離提純存在一定的困難,故天然資源有限?；瘜W合成和基因工程法獲得抗菌肽是主要手段,但化學合成抗菌肽成本高,而通過基因工程在微生物中直接表達抗菌肽基因,則可能對宿主有害而不能獲取表達產物。所以,對抗菌肽的結構、構效關系及作用機理還需進一步研究。

7.結束語

抗菌肽是生物體對外界病原物質侵染而產生的一系列免疫應答反應產物,它的出現為人們尋找理想的抗菌藥物提供新的領域,尤其是當今許多抗生素產生了耐藥性,因此抗菌肽具有巨大的應用潛力。基因工程技術的發展,極大的促進了抗菌肽的研究和開發,通過抗菌肽基因的克隆與表達而大量生產成為可能。雖然抗菌肽目前還不能直接應用于養殖業,但抗菌肽獨特的作用機理不易產生耐藥性的特性將吸引科研工作的不斷深入,可以相信抗菌肽將在動物養殖和提高畜產品品質方面發揮重要作用。