胚胎早期發(fā)育體外共培養(yǎng)研究

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【摘要】目的探討共培養(yǎng)體系中體細(xì)胞對胚胎早期發(fā)育的影響及比較2種常用共培養(yǎng)體系的優(yōu)劣。方法實(shí)驗(yàn)分3組:同種不同類型體細(xì)胞,受精卵分別在含顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng);異種同類型體細(xì)胞,受精卵分別在含牛顆粒細(xì)胞和小鼠顆粒細(xì)胞中M199培養(yǎng)液中培養(yǎng);2種共培養(yǎng)體系比較,受精卵分別在“M199+顆粒細(xì)胞”和“B2+Vero細(xì)胞”的共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。結(jié)果顆粒細(xì)胞組較成纖維細(xì)胞組囊胚率高(P<0.05);牛顆粒細(xì)胞組和小鼠顆粒細(xì)胞組在卵裂率和囊胚率方面差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“M199+顆粒組”在卵裂率和囊胚率方面與“B2+Vero組”差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但囊胚細(xì)胞數(shù)較少(P<0.05)。結(jié)論在一定的條件下,共培養(yǎng)體系中體細(xì)胞對胚胎早期發(fā)育有一定影響;“B2+Vero細(xì)胞”的共培養(yǎng)體系優(yōu)于“M199+顆粒細(xì)胞”的共培養(yǎng)體系。

【關(guān)鍵詞】胚發(fā)育共培養(yǎng)

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectofsomaticcellcoculturesystemontheearlybovineembryodevelopmentandcomparisonoftwodifferentcoculturesystems.MethodsExperiment1:thesomaticcellswereofthesamebreedbutdifferenttypes(granulecellgroupandfibroblastgroup);experiment2:thesomaticcellswereofthesametypebutdifferentbreeds(bovinegranulecellgroupandmousegranulecellgroup);experiment3:comparetwococulturesystem(M199+granulecellgroupandB2+Verocellsgroup).ResultsInexperiment1,granulecellgroupwassimilartofibroblastgroupincleavageratebuthigherinblastocystrate;inexperiment2,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate;inexperiment3,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate,buttotalcellnumberofblastocystsinB2+VerocellsgroupwashigherthanthatofM199+granulecellgroup.ConclusionSomaticcellcoculturesystemmayhaveaneffectontheearlyembryodevelopmentsomeconditions,andthecoculturein“B2+Verocells”isbetterthanin“M199+granulecells”forbovineearlyembryodevelopment.

KEYWORDS:embryo;development;coculturesystem

目前,胚胎早期發(fā)育體外培養(yǎng)體系可以分為合成液培養(yǎng)體系和共培養(yǎng)體系。合成液培養(yǎng)體系是利用成分確定的合成培養(yǎng)液,該體系成分明確,便于研究胚胎發(fā)育過程中每一種物質(zhì)對胚胎的作用機(jī)制,但桑椹胚和囊胚發(fā)育率不高。胚胎體外共培養(yǎng)體系是指胚胎與體細(xì)胞一起在培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)以促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育。共培養(yǎng)體系可以獲得較高的囊胚發(fā)育率,而高囊胚發(fā)育率是許多科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐所追求和必需的。

為探索胚胎早期發(fā)育最佳的體外培養(yǎng)體系，特別是胚胎與體細(xì)胞共培養(yǎng)體系，人們已取得一定成果[1]，但仍有許多問題尚不明確。本研究以奶牛胚胎為受試對象，探討共培養(yǎng)體系如何提高胚胎的囊胚發(fā)育率,體細(xì)胞的效應(yīng)有無種間差異及不同類型的同種體細(xì)胞有無差異。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1胚胎

取自12只發(fā)情周期正常的青年荷斯坦奶牛(由上海滔滔v轉(zhuǎn)基因有限公司提供),年齡12～13月,體質(zhì)量和體況相似。

1.1.2試劑

TCM199（美國Gibco生物試劑公司）,其余試劑購自美國Sigma公司。

1.1.3分組

(1)同種不同類型體細(xì)胞:顆粒細(xì)胞組,受精卵培養(yǎng)全程均在M199培養(yǎng)液含牛顆粒細(xì)胞單層中培養(yǎng);成纖維細(xì)胞組,受精卵培養(yǎng)全程均在M199培養(yǎng)液含牛成纖維細(xì)胞單層中培養(yǎng)。(2)異種同類型體細(xì)胞:牛顆粒細(xì)胞組,受精卵培養(yǎng)全程均在M199培養(yǎng)液含牛顆粒細(xì)胞單層中培養(yǎng);小鼠顆粒細(xì)胞組,受精卵培養(yǎng)全程均在M199培養(yǎng)液含小鼠卵丘細(xì)胞單層中培養(yǎng)。(3)兩種共培養(yǎng)體系比較:M199+顆粒組,受精卵培養(yǎng)全程均在M199培養(yǎng)液含牛顆粒細(xì)胞單層中培養(yǎng);B2+Vero組,受精卵培養(yǎng)全程均在B2培養(yǎng)液含Vero細(xì)胞單層中培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1卵丘

卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)獲得通過活體取卵(ovumpickup,OPU)方式獲得,具體操作見文獻(xiàn)[2]。

1.2.2卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[3],COC在成熟液(TCM199+10%FBS+LH10μg/mL+E21μg/mL+FSH1μg/mL)中培養(yǎng)23～24h。培養(yǎng)條件:體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、38.5℃、飽和濕度。使用同一公牛同一批號的凍精液進(jìn)行受精,受精液為BO液,使精子的最終密度約為1×106mL-1。置CO2培養(yǎng)箱精卵共孵育6～8h。將受精卵按每50μL10～20個(gè)移入體外培養(yǎng)滴。每隔48h半量更換培養(yǎng)液。受精48h后計(jì)算卵裂率,第8天計(jì)算囊胚率。

1.2.3共培養(yǎng)體系中體細(xì)胞單層制備

牛顆粒細(xì)胞單層:從OPU收集到的檢卵液中挑選光澤度好、細(xì)胞致密的顆粒細(xì)胞碎片,加入0.25%胰酶吹打1min,離心洗滌2次,體外培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,細(xì)胞長滿約80％加入受精卵。

小鼠顆粒細(xì)胞單層:雌性昆明白小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素PMSG(10IU),48h后注射人絨毛膜促性腺激素HCG(10IU/),13～15h后輸卵管壺腹部取卵,用透明質(zhì)酸酶消化COC,收集消化下來的卵丘細(xì)胞,體外培養(yǎng)液離心洗滌2次,懸浮細(xì)胞,細(xì)胞長滿約80％時(shí),加入受精卵。

Vero細(xì)胞單層:用0.25%胰酶消化長至70％～80％的Vero細(xì)胞,離心洗滌2次,B2培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,細(xì)胞長滿約80％時(shí),加入受精卵。

牛成纖維細(xì)胞單層:選用2～5代的牛成纖維細(xì)胞,M199體外培養(yǎng)液離心洗滌2次,懸浮細(xì)胞,細(xì)胞長滿約80％時(shí),加入受精卵。

1.2.4囊胚期細(xì)胞計(jì)數(shù)

培養(yǎng)第8天的囊胚用5μg/mLHoechst33342溶液染色5min,用蓋玻片壓破胚胎,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù),每個(gè)囊胚統(tǒng)計(jì)3次,計(jì)算均值[4]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和方差分析,P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在同種不同類型體細(xì)胞研究中,以顆粒細(xì)胞為單層的顆粒細(xì)胞組比以成纖維細(xì)胞為單層的成纖維細(xì)胞組囊胚率較高(P＜0.05),但卵裂率兩者相似(表1)。表1同種但不同類型體細(xì)胞的共培養(yǎng)效果（略）

在異種同類型體細(xì)胞研究中,牛顆粒細(xì)胞組和小鼠顆粒細(xì)胞組在卵裂率和囊胚率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。表2異種同類型體細(xì)胞的共培養(yǎng)效果（略）

在兩種共培養(yǎng)體系的研究中,M199+顆粒組雖然在卵裂率和囊胚率與B2+Vero組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但囊胚中的總細(xì)胞數(shù)較少(P<0.05,表3)。表3兩種不同的共培養(yǎng)體系的共培養(yǎng)效果（略）

3討論

3.1共培養(yǎng)體系的機(jī)制

共培養(yǎng)體系是利用體細(xì)胞在體外與受精卵共同培養(yǎng),促進(jìn)胚胎發(fā)育。目前,已有一些實(shí)驗(yàn)證明共培養(yǎng)體系確實(shí)能夠顯著提高胚胎體外早期發(fā)育的囊胚率。其主要機(jī)制可能有:(1)體細(xì)胞分泌一些促進(jìn)胚胎早期發(fā)育的物質(zhì)。最有可能的物質(zhì)為一些生長因子,如轉(zhuǎn)化生長因子α及β(TGFα和TGFβ)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子（IGF）等。Wastond等用反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法證明,在培養(yǎng)的體細(xì)胞中有IGF、FGF、TGFα和TGFβ的mRNA的轉(zhuǎn)錄。另一方面在早期發(fā)育胚胎中有生長因子受體的表達(dá)。(2)共培養(yǎng)細(xì)胞在降低氧壓,清除氧自由基等方面發(fā)揮重要作用。共培養(yǎng)體系培養(yǎng)箱中通常用的氧濃度為空氣中的20％左右,但在正常生理狀況下,輸卵管和子宮中氧濃度為3.5%～8.5%。研究表明，共培養(yǎng)能降低培養(yǎng)體系中的氧壓和氧自由基使胚胎克服發(fā)育阻斷[58]。

3.2共培養(yǎng)體系中同種但不同類型體細(xì)胞的研究

Goto等將牛的受精卵分別與顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞和子宮細(xì)胞在M199液中共培養(yǎng),囊胚率差異不顯著[9],但本實(shí)驗(yàn)分別用顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同在M199共培養(yǎng)卻得出囊胚率差異顯著的結(jié)論。分析其原因可能為顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞和子宮細(xì)胞都屬生殖系統(tǒng)細(xì)胞,在共培養(yǎng)時(shí)分泌的促發(fā)育物質(zhì)相似,物質(zhì)代謝的途徑相似。而本實(shí)驗(yàn)中的顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分屬不同的系統(tǒng),差異較大,卵丘細(xì)胞與胚胎關(guān)系密切,其分泌的物質(zhì)和代謝途徑更適合胚胎的早期發(fā)育,因此囊胚率較高。另外,可能與共培養(yǎng)細(xì)胞傳代的次數(shù)也有關(guān)聯(lián)。隨著傳代次數(shù)的增多,培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和功能將發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)中的成纖維細(xì)胞為2～5代的細(xì)胞,可能在一定程度上影響成纖維細(xì)胞對胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用。

3.3共培養(yǎng)體系中異種同類型體細(xì)胞的研究

Eiiington等用同種或異種輸卵管上皮細(xì)胞體系共培養(yǎng)都得到較好的結(jié)果[10],本實(shí)驗(yàn)用牛卵丘細(xì)胞和小鼠卵丘細(xì)胞培養(yǎng)牛胚胎也都得到較好的囊胚發(fā)育率,說明卵丘細(xì)胞的種間差異對牛胚胎早期發(fā)育的體外培養(yǎng)影響不大。但相比較而言,小鼠的卵丘細(xì)胞在生物安全性上將更有保證。因?yàn)樵谂Ｅ咛ンw外生產(chǎn)中,制備共培養(yǎng)單層的顆粒細(xì)胞常常是來源于屠宰場的卵巢,可能出現(xiàn)未知病原菌如病毒或蛋白侵染子的感染,影響胚胎的發(fā)育及附植。因此,小鼠卵丘細(xì)胞促進(jìn)牛胚胎的早期發(fā)育具有一定的理論意義和實(shí)踐意義。

3.4兩種較常用的共培養(yǎng)體系

Desal等檢測到了胚胎與Vero細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)Vero細(xì)胞釋放的生長因子和細(xì)胞因子,包括血小板生長因子、白細(xì)胞介素6、EGF、TGFα和TGFβ等。本實(shí)驗(yàn)用B2+Vero細(xì)胞的共培養(yǎng)體系同樣獲得較好的囊胚發(fā)育率,并且與M199+顆粒細(xì)胞相比,囊胚細(xì)胞數(shù)較多,質(zhì)量較高。此外B2+Vero共培養(yǎng)體系還有其獨(dú)特的優(yōu)勢。由于B2培養(yǎng)液和Vero細(xì)胞都是商品化的,在來源和制備上較為容易,結(jié)果也更加穩(wěn)定,更重要的是在生物安全性上也更有保證[11],因此,B2+Vero共培養(yǎng)體系是一種較好的胚胎早期發(fā)育體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。

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