紅細(xì)胞范文
時(shí)間：2023-03-16 07:13:56
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篇1
輸血治療是臨床治療主要手段之一，有時(shí)是不可替代的手段，便輸血不良反應(yīng)影響響應(yīng)床救治效果的主要因素之一。目前已知非溶血性發(fā)熱反熱(FNHTR)、包括血小板輸注無(wú)效在內(nèi)的同種免疫、輸血相關(guān)急性肺損傷(TA-ALI)、輸血相關(guān)移植物抗宿主病(TA-GVHD)的發(fā)生與輸人白細(xì)胞的方法有離心法去白膜法、洗滌法和白細(xì)胞濾器過(guò)濾法等，本文旨在觀察濾自細(xì)胞紅細(xì)胞和洗滌紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)，為兩種血液成分的臨床應(yīng)用提供參考。
材料與方法
1 材料與設(shè)備
一次性四聯(lián)白細(xì)胞濾除采血袋為山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股分有限公司產(chǎn)品，批號(hào)200607234：一次性五聯(lián)MAP洗滌采血袋為長(zhǎng)春泰爾茂醫(yī)療器具有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20051019z；白細(xì)胞過(guò)濾溫控設(shè)備為山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股分有限公司產(chǎn)品；GZR-ⅡA型自動(dòng)高頻熱合機(jī)為蘇州市醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品；CP80MX型大容量低溫離心機(jī)為日立集團(tuán)產(chǎn)品；LDZ5-2型離心機(jī)為北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；Thermo全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為上海熱電科技儀器有限公司產(chǎn)品；sysmex血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為日本東亞公司產(chǎn)品等。
2 試劑
0.2％鄰甲笨胺試劑為上海新亭化工試劑廠產(chǎn)品，批號(hào)20030401；1％過(guò)氣化氫溶液為上海埃彼化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)F20050228；2％冰乙酸溶液為上海埃彼化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào) F20060210，血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液廈門市綠浪醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，批號(hào)YZB0705-2005。
3 濾白紅細(xì)胞的制備
a.先將低溫操作柜控制在2～6℃，關(guān)閉過(guò)濾器下端與旁側(cè)的管道夾，將血袋倒掛在白細(xì)胞過(guò)濾溫控設(shè)備的掛鉤上，打開(kāi)采血袋下端的折通管和過(guò)濾器下端的管道夾，使血液靠自身重力，緩慢通過(guò)自細(xì)胞過(guò)濾器，流入血液轉(zhuǎn)移袋，大約10～20分鐘。b．關(guān)閉白細(xì)胞過(guò)濾器下端的管道夾，開(kāi)啟濾器旁側(cè)的管道排氣夾，輕輕擠壓血液轉(zhuǎn)移袋，將氣體排人采血袋，關(guān)排氣夾，開(kāi)管道夾，用氣體沖凈濾器中殘留血液。 c.3200轉(zhuǎn)／分離心去除血小板和血漿，向剩余物中加入紅細(xì)胞添加劑CPDA-1，即為濾白紅細(xì)胞。抽取制備好的濾白紅細(xì)胞60份，分別留取濾白前后的血液5ml左右，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)其計(jì)數(shù)，并把濾白后血液以2000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，分離上清1ml～30℃冰凍備用。
4 洗滌紅細(xì)胞的制備
a.取聯(lián)袋采集經(jīng)離心后全血母袋置于分漿夾內(nèi)，折斷母袋上的易折件，將血漿分至②空轉(zhuǎn)移袋中，并一同去除白膜(變可分次去除)，分漿畢將③空轉(zhuǎn)移袋中洗滌液全部加入母袋中并充分混勻，分別用塑料夾片將①②袋上導(dǎo)管夾好。b．將混勻后的細(xì)胞洗滌袋進(jìn)行離心。c．離心畢，取出紅細(xì)胞母袋及血漿的②袋置于分漿夾內(nèi)，打開(kāi)②袋上夾子，將血漿分至③袋(視血漿清亮程度可于本次或后兩次中熱合去除血漿，操作時(shí)只是在③④⑤袋中轉(zhuǎn)移)中，分畢用夾子夾好，再打開(kāi)紅細(xì)胞母袋上夾子，將上清液分至②袋中，分畢用夾子夾好，將④袋中洗滌液220g～230g加入母袋中并充分混勻，用夾片夾好導(dǎo)管。d．將混勻后的紅細(xì)胞洗滌聯(lián)袋進(jìn)行離心。e．離心畢，取出紅細(xì)胞母袋置于分漿夾內(nèi)，打開(kāi)紅細(xì)胞母袋上夾子，將上清液分至②袋或④袋(預(yù)先將④袋中洗滌液倒入袋⑤中)中，分畢用夾子夾好，將④或⑤袋中洗滌液220g～230g加入母袋中并充分混勻，用夾片夾好導(dǎo)管。f.重復(fù)d、e。g．最后向洗滌三遍紅細(xì)胞母袋中加入⑤袋中的紅細(xì)胞保存添加劑100克，熱合封口裝有紅細(xì)胞的袋中，即為制備的2單位MAP洗滌紅細(xì)胞。抽取制備好的MAP洗滌紅細(xì)胞60份，分別留取洗滌前后的血液5ml左右，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)其計(jì)數(shù)，并把洗滌后的血液以2000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，分離上清1ml～30℃冰凍備用。
5 游離血紅蛋白的測(cè)定
取冰凍備用的濾白紅細(xì)胞和洗滌紅細(xì)胞上清在37℃水浴箱融化，吸取20μl。于上述務(wù)管中加入1.0m10.2％鄰甲笨胺溶液，再加入1.0ml1％過(guò)氧化氫溶液，混勻放置10分鐘，各管加入10ml2％冰乙酸溶液，于酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為430mm，進(jìn)行比色并計(jì)算其濃度。
甲習(xí)笨胺法測(cè)定原理：血紅蛋白具有過(guò)氧化酶作用，使過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生新生態(tài)氧，氧化習(xí)笨胺為藍(lán)色或綠色衍生物，根據(jù)顏色的深淺與已知濃度的血紅蛋白進(jìn)行比較，求得其含量。
6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
白細(xì)胞清除率以百分比表示，計(jì)算公式白細(xì)胞清除率=1-(制備后血液制品中的白細(xì)胞濃度制備前血液制品中的白細(xì)胞濃度)×100％，游離血紅蛋白以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的白細(xì)胞清除率和紅細(xì)胞回收率的比較采用x2檢驗(yàn)，兩組間的游離血紅蛋白比較采用組間t檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)使用JMTJFX《簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)分析10．31》軟件處理。
7 結(jié)果
7.1濾白紅細(xì)胞的白細(xì)胞清除率(％)和紅細(xì)胞回收率(％)分別為99.99±2.7和92.65±3.2，洗滌紅細(xì)胞的白細(xì)胞清除率(％)和紅細(xì)胞回收率(％)分別為87.36±5.12和84.54±4.29，兩組間差別有顯著意義(P
7.2濾白紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞游離血紅蛋白的含量(mg／L)為45.23±4.16和68.13±5.28，兩組間差別有顯著意義(P
8 討論
輸血不良反應(yīng)中最常見(jiàn)的是發(fā)熱反應(yīng)，在使用一次性采血袋前血液污染和外源性熱原可能是其主要原因。而在現(xiàn)代臨床輸血中發(fā)現(xiàn)。有一種發(fā)熱反應(yīng)，不是由于血液污染或熱原存在，也不是由于血型不合或患者對(duì)獻(xiàn)血漿過(guò)敏等原因引起，而是與受血者反復(fù)輸血或妊娠致使體內(nèi)產(chǎn)生白細(xì)胞凝集素有關(guān)，這種凝信大多數(shù)獻(xiàn)血者的自細(xì)胞。一旦產(chǎn)生了這種凝集素，再次輸血時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，其程度與輸入的白細(xì)胞數(shù)的受血者體內(nèi)凝集素的效價(jià)有關(guān)。
要解決這一問(wèn)題，最理想的辦法是選擇與朦朧客觀存在血者白細(xì)胞配合的獻(xiàn)血者，但由于大多數(shù)有白細(xì)胞凝素的患者其血清對(duì)大部分獻(xiàn)血者的白細(xì)胞均有凝集現(xiàn)象，加之白細(xì)胞的配型也較復(fù)雜，因此將全血中的白細(xì)胞大部分除去后再佃給患者，則是一種簡(jiǎn)單易行的方法。
目前，少白細(xì)胞的紅細(xì)胞制品的在臨床上的應(yīng)用已引起重視，在國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用量逐年增加。洗滌紅細(xì)胞是將濃縮紅細(xì)胞用洗液洗滌三次或三次以上的紅細(xì)胞制品。洗滌后的紅細(xì)胞，自細(xì)胞去除率可達(dá)90％左右，同時(shí)可除去血細(xì)胞代謝產(chǎn)物，血小板或白細(xì)胞形成都市的微聚物、紅細(xì)胞表面的抗原等，從而避免因這些物質(zhì)輸人體內(nèi)所引起的輸血反應(yīng)。
但我們?cè)谌粘９ぷ髦杏^察到自從全面供應(yīng)濾白紅細(xì)胞成分血后，洗滌紅細(xì)胞的使用量有明顯下降趨勢(shì)，濾白紅細(xì)胞制品適應(yīng)癥大致與洗滌紅細(xì)胞相同，但濾白紅細(xì)胞操作簡(jiǎn)單易行，不需要復(fù)雜設(shè)備且保存期長(zhǎng)于洗滌紅細(xì)胞，有文獻(xiàn)報(bào)道，洗滌紅細(xì)胞制品最長(zhǎng)可以保存20天左右，而濾自紅細(xì)胞制品則可以保存更長(zhǎng)時(shí)間，且后工分離制備洗滌紅細(xì)胞時(shí)，很多因素可以影響產(chǎn)品的質(zhì)量，主要有以下三種，即：離心條件、操作技術(shù)、分離袋特殊構(gòu)造，這些全都為洗滌紅細(xì)胞的制備帶來(lái)不便。另外，濾白紅細(xì)胞的紅細(xì)胞回收率和白細(xì)胞清除率均高于洗滌紅細(xì)胞，游離血紅蛋白含量較低，且同樣可以達(dá)到降低由白細(xì)胞抗體引起的非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)的目的，甚至效果更好。
也有資料顯示，洗滌紅細(xì)胞制品更適用于以下情況的輸血：(1)自身免疫性溶血性疾病，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿患者，自身免疫性溶血性貧血患者。(2)免疫缺陷病人的輸血。如IgA缺乏病人或已產(chǎn)生了IgA抗體的病人，輸注經(jīng)過(guò)洗滌的紅細(xì)胞，可以避免休克性輸血反應(yīng)的發(fā)生。(3)對(duì)新生兒溶血癥的換血和輸血，可以避免休克性輸血反應(yīng)的發(fā)生溶血，加重病情。(4)嚴(yán)重輸血反應(yīng)，用其它措施不能克服的病人，應(yīng)輸注洗滌紅細(xì)胞。可見(jiàn)，在這些方面洗滌紅細(xì)胞起著不可替代的作用。因此，只能說(shuō)在一定臨床范圍內(nèi)濾白紅細(xì)胞要優(yōu)于洗滌紅細(xì)胞。
篇2
紅細(xì)胞直接作為載體，用于運(yùn)載小分子藥物和蛋白質(zhì)、核酸等大分子藥物的研究已廣泛展開(kāi)。此外，制備保持完整功能的紅細(xì)胞膜包封納米粒作為藥物載體的研究也取得了一定進(jìn)展。本文綜述了紅細(xì)胞作為運(yùn)載工具輸送藥物的研究情況，另外，著重介紹兩種新型的紅細(xì)胞膜載藥系統(tǒng)---紅細(xì)胞膜包裹納米粒( RBC-NP) 和紅細(xì)胞膜納米海綿的最新研究進(jìn)展。
1 紅細(xì)胞作為藥物載體的發(fā)展歷程
早在 1953 年，已有科學(xué)家嘗試用紅細(xì)胞運(yùn)載化學(xué)物質(zhì)。隨后有人成功將相對(duì)分子質(zhì)量 10 ~250 kD 的右旋糖酐類載入紅細(xì)胞。而直到 1973年，科學(xué)家們才開(kāi)始采用紅細(xì)胞做為藥物載體，并于 1979 年首次以紅細(xì)胞載體( carrier erythrocytes)來(lái)描述運(yùn)載藥物的紅細(xì)胞[4].最先應(yīng)用紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的是各種酶類，如乙醛脫氫酶[5]、谷氨酸脫氫酶[6]等。經(jīng)過(guò) 30 多年發(fā)展，紅細(xì)胞已應(yīng)用于輸送不同性質(zhì)的藥物，用于治療腫瘤、心腦血管疾病、各類炎癥等。
2 紅細(xì)胞作為藥物載體的特點(diǎn)
紅細(xì)胞作為藥物載體主要有以下優(yōu)勢(shì)： 降解不會(huì)產(chǎn)生有毒或有害物質(zhì)，紅細(xì)胞的粒徑及形狀相同，提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，各種化學(xué)物質(zhì)和酶都可包裹在紅細(xì)胞膜內(nèi)，防止內(nèi)源物質(zhì)降解運(yùn)載的藥物，可調(diào)整藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，保持血漿內(nèi)藥物濃度的穩(wěn)定，延長(zhǎng)藥物的全身作用時(shí)間，減少藥物的不良反應(yīng)等[7].
2. 1 延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期
正常紅細(xì)胞的壽命為 120 d 左右，其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間遠(yuǎn)高于普通藥物載體。將藥物用紅細(xì)胞負(fù)載后可顯著延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期，提高藥物療效。將抗腫瘤藥物長(zhǎng)春新堿( MTX) 、甲氨蝶呤( VCR) 采用紅細(xì)胞單一負(fù)載或復(fù)合負(fù)載后，可顯著提高藥物抗腫瘤活性，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。其中 MTX + VCR 的雙載紅細(xì)胞對(duì) K562 細(xì)胞 48 h的抑制率為( 68. 63 ± 2. 76) % ,顯著高于 MTX 或VCR 單載紅細(xì)胞( P < 0. 05)[8-10].連燕舒[11]以紅細(xì)胞運(yùn)載嗎啡( M-RBC) 用于手術(shù)后鎮(zhèn)痛，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后無(wú)痛時(shí)間為( 15. 7 ± 5. 6) h,遠(yuǎn)高于對(duì)照組( 3. 2 ±2. 3) h,明顯延長(zhǎng)了嗎啡的鎮(zhèn)痛時(shí)效，且 M-RBC 半衰期為( 6. 48 ± 1. 56) h,與文獻(xiàn)報(bào)道嗎啡體內(nèi)半衰期 2. 5 ~3 h 相比顯著增加。核磁共振檢查一般采用超順磁氧化鐵顆粒( SPIO) 和超小型超順磁氧化鐵顆粒 ( USPIO) 作為對(duì)比劑。Antonelli等[12]用紅細(xì)胞運(yùn)載 SPIO 作對(duì)比劑，注射后 24 h血液內(nèi)鐵離子濃度仍接近檢測(cè)限，該對(duì)比劑血液中壽命可被延長(zhǎng)至 12 d.
2. 2 良好的生物相容性和可降解性，減少不良反應(yīng)。
天然紅細(xì)胞為機(jī)體固有成分，可通過(guò)代謝完全降解為無(wú)毒產(chǎn)物，作為運(yùn)載體在體內(nèi)不會(huì)引起其他不良反應(yīng)。聚氧乙烯蓖麻油( Cremophor) 常添加于紫杉醇注射液中作增溶劑，但易引起感染、過(guò)敏等不良反應(yīng)。Harisa 等[13]嘗試以紅細(xì)胞作為藥物載體運(yùn)載紫衫醇，替代 Cremophor 的使用。載藥的紅細(xì)胞各種生理特性并無(wú)顯著差異，可作為紫衫醇的藥物靶向輸送載體。
2. 3 增加藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，降低免疫原性。
紅細(xì)胞可形成一個(gè)隔離空間以保護(hù)運(yùn)載的物質(zhì)，使藥物不受內(nèi)源性因素的影響而過(guò)早失活和降解，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。此外，亦可減少外源性大分子( 如基因物質(zhì)、蛋白等) 引起的免疫反應(yīng)，是運(yùn)載大分子藥物的理想工具[14].
2. 4 增加藥物的靶向性
紅細(xì)胞因衰老或其他原因造成膜表面性質(zhì)變化，經(jīng)過(guò)脾和肝時(shí)可被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)( RES) 的巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬，因此紅細(xì)胞可作為天然的 RES 靶向給藥載體。已有研究將干擾素 α-2b 用紅細(xì)胞擔(dān)載后用于 RES 靶向給藥[15].為增加紅細(xì)胞被識(shí)別能力，Chiarantini 等[16]將反義肽核酸載入紅細(xì)胞后，誘導(dǎo)紅細(xì)胞表面的帶三蛋白凝集并固定化，使之成為自體免疫球蛋白 G( IgG) 的識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)，從而被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞，最終抑制了巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶( iNOS) 和環(huán)氧化酶 2( COX-2) 的表達(dá)。
除 RES 靶向外，紅細(xì)胞載體還可實(shí)現(xiàn)其他部位靶向。化療藥物在正常組織器官的分布積累是導(dǎo)致其不良反應(yīng)的重要原因，磁化紅細(xì)胞載體是解決這一問(wèn)題的新手段。有報(bào)道將氧化鐵納米粒通過(guò)生物素-親和素方法偶聯(lián)到紅細(xì)胞表面，或?qū)⑺难趸F納米粒載入紅細(xì)胞內(nèi)，制成紅細(xì)胞磁化載體來(lái)運(yùn)載多柔比星[17-18].磁化紅細(xì)胞本身生理特性并無(wú)明顯改變，但在外磁場(chǎng)的控制下可將藥物準(zhǔn)確輸送到腫瘤部位。Cinti 等[19]將超順磁納米粒載入紅細(xì)胞內(nèi)，并以病毒血凝素糖蛋白對(duì)紅細(xì)胞膜表面進(jìn)行修飾，構(gòu)建一種新型紅細(xì)胞磁化載體。該磁化載體到達(dá)靶部位后能高效地與腫瘤細(xì)胞融合并釋放藥物，用其運(yùn)載地西他濱，給藥劑量?jī)H為常規(guī)化療劑量的 10%.
2. 5 延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，保持血藥濃度穩(wěn)定
紅細(xì)胞膜是具有生物活性的半透膜，藥物被載入紅細(xì)胞后可實(shí)現(xiàn)緩慢持續(xù)釋放，與傳統(tǒng)給藥方式相比，能明顯減少血藥濃度的波動(dòng)。Alanazi 等[20]用紅細(xì)胞負(fù)載伯氨喹用于瘧疾的治療，載藥后的紅細(xì)胞可實(shí)現(xiàn) 48 h 的藥物持續(xù)釋放，但膜上谷胱甘肽( GSH) 的含量顯著降低，使載藥后的紅細(xì)胞更易被氧化。Bossa 等[21]將地塞米松的前藥地塞米松-21-磷酸鹽( DEX 21-P) 載入紅細(xì)胞內(nèi)，DEX 21-P先在酶的作用下去磷酸化生成地塞米松，再通過(guò)自由擴(kuò)散作用釋放到紅細(xì)胞外，如此給藥一次便可維持 3 ~4 周的治療濃度。
2. 6 負(fù)載各類物質(zhì)進(jìn)行遞送
紅細(xì)胞載體適用范圍廣，無(wú)論是大分子藥物還是小分子藥物，大多可被紅細(xì)胞運(yùn)載，在適當(dāng)?shù)妮d藥條件下可較大程度地保持紅細(xì)胞的活性和功能。Harisa 等[22]用紅細(xì)胞負(fù)載降血脂藥物普伐他汀，探究不同包封條件對(duì)紅細(xì)胞載藥率及其生理特性的影響，結(jié)果顯示在 0. 6% NaCl、普伐他汀質(zhì)量濃度為 10 mg/mL 下孵育60 min 可得到最大載藥率，且紅細(xì)胞的生理特性基本無(wú)變化。Favretto 等[23]則研究了用 3 種方法將不同相對(duì)分子質(zhì)量的酶載入紅細(xì)胞的情況，結(jié)果顯示，氯丙嗪浸泡法和脂質(zhì)體融合法，相較于低滲透析法，可提高載藥率減少不良反應(yīng)。Shi 等[24]利用二硬脂酸磷脂酰乙酰胺將 IgG 連接于紅細(xì)胞膜上，這種方法可顯著提高整個(gè)紅細(xì)胞載體的穩(wěn)定性，且有利于藥物的靶向運(yùn)輸。
3 紅細(xì)胞載體的制備
3. 1 紅細(xì)胞載體的來(lái)源
紅細(xì)胞及紅細(xì)胞膜的來(lái)源與提取相對(duì)簡(jiǎn)單，一般通過(guò)離心方法得到血液中的紅細(xì)胞，采用低滲溶血的方式取得紅細(xì)胞膜，也有化學(xué)合成仿生的紅細(xì)胞膜[25].
3. 2 紅細(xì)胞載體的載藥方式
3. 2. 1 將藥物連接在紅細(xì)胞膜上 若藥物( 酶或其他藥物) 必須同紅細(xì)胞膜外不能穿膜的底物直接作用才能產(chǎn)生治療效果，則常用不同的連接方法將藥物連接于紅細(xì)胞膜上。其中親和素-生物素方法是膜與藥物( 特別是生物藥物) 結(jié)合的最常用技術(shù)[30].哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞膜生物素酰化可通過(guò)生物素 N-溴代琥珀酰亞胺酯( NHS-biotin) 引入氨基，也可生物氧化紅細(xì)胞膜的醛基。Magnani 等[31]比較了這些方法，發(fā)現(xiàn)通過(guò) NHS-biotin 生物素酰化的細(xì)胞活性最好，每 1 個(gè)紅細(xì)胞膜連接約 1 000 個(gè)生物素，在體內(nèi) 24 h 的活性不受影響。
3. 2. 2 將藥物包載入紅細(xì)胞內(nèi) 目前，人們運(yùn)用一系列技術(shù)將治療成分包裹入紅細(xì)胞內(nèi)，常用的有低滲法、化學(xué)法、電穿孔、胞吞法和脂質(zhì)融合法等[26-28].對(duì)于可自由擴(kuò)散的小分子藥物，常將其前藥或其藥物結(jié)合蛋白包載入紅細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)前藥的代謝或結(jié)合蛋白對(duì)小分子藥物的親和力實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢釋放。大分子蛋白例如一些酶類( 其作用底物可穿過(guò)紅細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)的) 可直接包載入紅細(xì)胞內(nèi)，如此既可保持藥物本身的穩(wěn)定性，亦可實(shí)現(xiàn)緩慢催化作用[29].
4 基于紅細(xì)胞載藥系統(tǒng)的最新進(jìn)展
紅細(xì)胞載藥的優(yōu)勢(shì)主要依靠紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能實(shí)現(xiàn)，且紅細(xì)胞膜提取分離較簡(jiǎn)單，因此許多研究者提取單純紅細(xì)胞膜來(lái)考察其藥物輸送作用。例如 Gupta 等[32]提取純凈紅細(xì)胞膜經(jīng)擠壓制成直徑為 100 ~200 nm 的納米紅細(xì)胞小體，運(yùn)載法舒地爾治療肺動(dòng)脈高血壓。紅細(xì)胞膜包裹納米粒( RBC-NP) 以及紅細(xì)胞膜納米海綿這兩種新型紅細(xì)胞膜載體的研究進(jìn)展介紹如下。
4. 1 紅細(xì)胞膜包裹納米粒( RBC-NP)
RBC-NP 藥物載體是將納米粒內(nèi)核和紅細(xì)胞膜結(jié)合，既能彌補(bǔ)納米粒體內(nèi)清除速度快及紅細(xì)胞載體釋藥缺乏可控性的缺點(diǎn)，又能發(fā)揮這兩類藥物載體的各自優(yōu)勢(shì)，是一種十分具有發(fā)展前景的新型藥物載體。
4. 1. 1 RBC-NP 的制備、載藥和釋藥方式 制備RBC-NP 一般采用低滲透析擠壓法。制備基本原理如圖 1 所示，在低滲環(huán)境下紅細(xì)胞膜孔打開(kāi)將內(nèi)容物釋出，得到的紅細(xì)胞膜經(jīng)納米膜擠壓形成納米紅細(xì)胞小體，再將納米紅細(xì)胞小體和納米粒經(jīng)反復(fù)擠壓形成 RBC-NP( 直徑約80 nm) .通過(guò)透射電鏡( TEM) 觀察以及蛋白酶消化等試驗(yàn)證明，合成的RBC-NP 能夠穩(wěn)定存在，且膜包裹的方向?yàn)榧t細(xì)胞膜的外側(cè)朝外，膜內(nèi)側(cè)鄰納米粒內(nèi)核。Luk 等[33]探究了納米粒內(nèi)核的表面電性、曲率半徑等因素對(duì)紅細(xì)胞膜包裹納米粒的影響。結(jié)果顯示，紅細(xì)胞膜可包封粒徑為 65 ~ 340 nm 納米粒，負(fù)電性內(nèi)核與負(fù)電性紅細(xì)胞膜間的靜電作用是能包裹并保持穩(wěn)定的主要原因。
RBC-NP 主要是通過(guò)納米粒內(nèi)核載藥，目前常使用 PLGA,載藥方式分為物理包封和化學(xué)鍵接。有研究通過(guò)這兩種方式將多柔比星載入 RBC-NP,得到的 RBC-NP 在 PBS 緩沖液中具有近似的高穩(wěn)定性，且藥效均高于單純多柔比星給藥，但化學(xué)鍵接載藥的 RBC-NP 藥物釋放更加持久[34].
RBC-NP 的釋藥方式主要有被細(xì)胞吞噬后膜破裂釋藥和通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散或特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)體系釋藥[35].Gao 等[36]研 究 發(fā) 現(xiàn)，將 脂 質(zhì) 體 中 裝 載NH4HCO3,溫度上升至 42 ℃時(shí)產(chǎn)生二氧化碳?xì)馀萜茐闹|(zhì)體膜，可釋放出藥物。如此實(shí)現(xiàn)溫度敏感性釋藥，且無(wú)有害化學(xué)成分殘留。除了內(nèi)部作用，也可通過(guò)外界觸發(fā)釋藥。Delcea 等[37]發(fā)現(xiàn)，金納米粒附于紅細(xì)胞膜上，用激光照射后金納米粒聚集處的膜性質(zhì)改變，可形成孔道釋放膜內(nèi)的藥物，這些成果為日后進(jìn)一步發(fā)展 RBC-NP 釋藥技術(shù)提供了新思路。
4. 1. 2 RBC-NP 作為藥物載體的特點(diǎn)及應(yīng)用RBC-NP 與普通藥物載體相比，可顯著延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。Hu 等[38]將 RBC-NP( PLGA 為內(nèi)核) 、PEG 修飾的 PLGA 納米粒( PEG-PLGA NP) 以及 PLGA 納米粒( PLGA NP) 3 種藥物載體進(jìn)行熒光染色后，尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，按一定時(shí)間眼眶取血進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在 24 和 48 h 后，RBC-NP 在血液中的殘留量分別為 29% 和 16% ,顯著高于 PEG-PLGA NP 組( 11% 和 2%) 和 PLGANP 組( 2 min 后基本不存在) .
RBC-NP 可穩(wěn)定持續(xù)釋放藥物，增加給藥靶向性。Aryal 等[34]將多柔比星載入 RBC-NP 進(jìn)行體外藥物釋放研究，發(fā)現(xiàn) 72 h 內(nèi)藥物釋放率僅為20% ,約為對(duì)照組 ( PEG 修飾的 PLGA 納米粒) 釋放速率的二分之一。為使 RBC-NP 具有更好的功能性和靶向性，F(xiàn)ang 等[39]將兩種配體即葉酸( 相對(duì)分子質(zhì)量約 441) 和核仁素配體 AS1411( Mr約9 000) 以磷脂分子為連接劑對(duì)紅細(xì)胞膜進(jìn)行修飾。
結(jié)果顯示葉酸修飾的 RBC-NP 在 KB 細(xì)胞中攝取量提高了 8 倍，AS1411 修飾的 RBC-NP 在 MCF-7細(xì)胞中攝取量提高了 2 倍。此外，采用這種脂質(zhì)植入的修飾方式避免了普通化學(xué)修飾造成的膜蛋白變性、功能損害等問(wèn)題。受到 RBC-NP 啟發(fā)，F(xiàn)ang等[40]采用腫瘤細(xì)胞膜包裹納米粒制成新型腫瘤靶向載體( CC-NP) ,通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用，CC-NP 在腫瘤細(xì)胞的攝取量可達(dá) PLGA 納米粒的20 倍。
本課題組目前基于 RBC-NP 展開(kāi)小干擾 RNA( siRNA) 的主動(dòng)靶向輸送研究。siRNA 類藥物存在快速降解的風(fēng)險(xiǎn)[41],在前期篩選獲得高效、低毒氨酯類聚乙烯亞胺衍生物( PEI-Et) 材料的工作基礎(chǔ)上，將 PEI-Et 復(fù)合 siRNA,得到穩(wěn)定的載體核心納米粒( PEP)[42-43]; 將半乳糖修飾的紅細(xì)胞膜包裹 PEP 作為新型輸送系統(tǒng)( Gal-RBC-PEP NPs) ,實(shí)現(xiàn) siRNA 的穩(wěn)定包封。本課題組將考察該系統(tǒng)輸送 siRNA 的長(zhǎng)效、靶向、安全性，以此探索構(gòu)建具有長(zhǎng)效、主動(dòng)靶向功能的新型紅細(xì)胞膜類 siRNA輸送載體。
4. 2 紅細(xì)胞膜納米海綿
RBC-NP 的紅細(xì)胞膜可捕獲體內(nèi)毒素并使其被清除掉，從而對(duì)抗細(xì)菌感染，這種本身可吸收細(xì)菌毒素的特性 RBC-NP 被稱作紅細(xì)胞膜納米海綿。
4. 2. 1 作為解毒劑 Hu 等[44]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，PL-GA 為內(nèi)核的納米海綿，可特定吸收成孔毒素類( PFTs) ,顯著降低其毒性。在注射納米海綿的情況下再給予小鼠致死劑量的 α-毒素，小鼠存活率可達(dá) 80% ( 存活時(shí)間超過(guò) 360 h) .通過(guò)與 PEG-PLGA NP、PEG-Lipid NP、納米紅細(xì)胞小體的試驗(yàn)對(duì)比，證實(shí) PLGA 納米粒內(nèi)核與紅細(xì)胞膜對(duì)于吸收PFTs 缺一不可。PFTs 普遍具有細(xì)胞膜穿孔能力，納米海綿的紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)可作為該毒素作用底物吸引 PFTs 嵌入膜內(nèi)，但在納米粒的穩(wěn)定作用下不發(fā)生溶血，且能在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)繼續(xù)吸收毒素，如此納米海綿可將絕大部分毒素帶離其靶細(xì)胞。當(dāng)被巨噬細(xì)胞吞噬后，納米海綿也可增強(qiáng)溶酶體對(duì)毒素蛋白的消化作用，最終可通過(guò)肝臟安全代謝。
研究者緊接著進(jìn)行了鏈球菌及蜂毒肽等其他 PFTs解毒試驗(yàn)，結(jié)果均可顯著減輕毒素對(duì)動(dòng)物的傷害，說(shuō)明紅細(xì)胞膜納米海綿的抗菌解毒作用具有普適性，可應(yīng)用于各種 PFTs 的解毒治療，克服了普通解毒治療中不同的病毒必須采用不同解毒藥物的缺點(diǎn)。
4. 2. 2 治療免疫系統(tǒng)疾病 納米海綿在治療Ⅱ型超敏反應(yīng)類疾病方面也有了新的研究進(jìn)展。抗體誘導(dǎo)型貧血癥的致病機(jī)制是患者體內(nèi)產(chǎn)生了可與自體紅細(xì)胞膜表面抗原結(jié)合的病理性抗體，正常的紅細(xì)胞與之結(jié)合后被吞噬細(xì)胞吞噬而導(dǎo)致貧血。
4. 2. 3 作為抗毒疫苗 除了用納米海綿直接進(jìn)行解毒治療外，也可將抗原蛋白嵌入納米海綿的紅細(xì)胞膜中制成抗毒素疫苗。Hu 等[45]將 PFTs 嵌入納米海綿的膜上，PFTs 在納米海綿的限制下不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，且仍能保持原有結(jié)構(gòu)形態(tài)，通過(guò)皮下注射后隨淋巴循環(huán)可被有效運(yùn)輸?shù)矫庖呦到y(tǒng)。
被漿細(xì)胞吞噬后，能產(chǎn)生大量與毒素特異性結(jié)合的IgG.與通過(guò)加熱或化學(xué)手段滅活的疫苗相比，這種疫苗產(chǎn)生的抗體數(shù)量更多，親和力更強(qiáng)，且不會(huì)引發(fā)其他針對(duì)輸藥載體的免疫并發(fā)癥。在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中，對(duì)正常細(xì)胞亦沒(méi)有危害。
Copp 等[46]的最新研究發(fā)現(xiàn)，納米海綿膜上的相應(yīng)抗原能夠保持裸露并與該病理性抗體特異性結(jié)合，可作為誘餌大量中和病理性抗體，然后經(jīng)吞噬細(xì)胞作用將其清除，最終使病理性抗體不能與正常紅細(xì)胞結(jié)合，從而大大緩解自身免疫性溶血反應(yīng)或藥物誘導(dǎo)的貧血癥。納米海綿可吸收各型病理性抗體，這為解決免疫疾病治療中藥物不能普遍適用的問(wèn)題[47]提供了思路。
5 展 望
紅細(xì)胞載藥體系具有極高的生物相容性和可降解性，在延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、提高靶向性和穩(wěn)定性、提高藥物效果等方面也具有其他傳統(tǒng)藥物載體不可比擬的優(yōu)勢(shì) [48-49].相比于單純的紅細(xì)胞載藥，復(fù)合型紅細(xì)胞膜載藥體系可實(shí)現(xiàn)更多的功能( 靶向性等)[39].目前，已有紅細(xì)胞載體進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[29].其中，地塞米松紅細(xì)胞載體治療潰瘍性結(jié)腸炎已完成臨床Ⅱ期試驗(yàn); L-天門冬酰胺酶紅細(xì)胞載體治療急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)正在進(jìn)行臨床Ⅲ期試驗(yàn)。
但對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)和使用，紅細(xì)胞藥物載體的來(lái)源和儲(chǔ)存仍是阻礙其應(yīng)用的主要問(wèn)題。與其他藥物載體相比，紅細(xì)胞源于生物體，不同來(lái)源的載體本身就具有較大的差異性，且制備過(guò)程缺少統(tǒng)一控制標(biāo)準(zhǔn)。在紅細(xì)胞的提取和載藥過(guò)程中如何減少污染、降低對(duì)膜功能的損害，如何儲(chǔ)存紅細(xì)胞載體并保持其生物活性等，都是亟待解決的問(wèn)題。對(duì)于新型 RBC-NP 的研究才剛起步，接下來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探明紅細(xì)胞膜與不同納米粒內(nèi)核的作用機(jī)制和原理，研究如何將較大粒徑的納米粒包裹入紅細(xì)胞膜內(nèi)且盡量減少對(duì)紅細(xì)胞膜的損害。紅細(xì)胞膜納米海綿在抗菌解毒治療上將有著極為廣闊的發(fā)展前景，在其他臨床應(yīng)用方面也存在一定潛力，值得深入研究。最后，基于紅細(xì)胞的載藥體系還需通過(guò)各種科學(xué)優(yōu)化，進(jìn)一步提高藥物的包封率、靶向性和控釋性。隨著相關(guān)研究不斷深入，相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)就會(huì)掀起一場(chǎng)臨床藥物載體的新變革。
參 考 文 獻(xiàn)
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[3] Yoo JW,Irvine DJ,Discher DE,et al. Bio-inspired,bioengineeredand biomimetic drug delivery carriers[J]. Nat Rev Drug Discov,2011,710( 7) : 521 - 535.
篇3
貧血可發(fā)生在慢性腎臟疾病的各個(gè)階段，尤其是慢性腎功能衰竭時(shí)更常見(jiàn)。由腎臟疾病引起的貧血稱為“腎性貧血”，貧血的程度常與腎功能減退的程度相關(guān)。慢性腎臟病患者一旦并發(fā)腎性貧血，常表現(xiàn)為皮膚黏膜蒼白、疲倦乏力、頭暈耳鳴等癥狀。
那么腎臟疾病怎么會(huì)引起貧血呢？其最主要的原因是腎臟疾病患者體內(nèi)有一種叫“促紅細(xì)胞生成素”的物質(zhì)生成不足。促紅細(xì)胞生成素是一種激素樣物質(zhì)，它在紅細(xì)胞形成過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。腎臟除了人們熟知的可以排出體內(nèi)的代謝廢物和毒素外，還是一個(gè)內(nèi)分泌器官，它同時(shí)也分泌一些激素，包括促紅細(xì)胞生成素。人體內(nèi)90%的促紅細(xì)胞生成素都是由腎臟產(chǎn)生的。隨著腎臟疾病的發(fā)展，腎組織不斷被破壞，促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生逐漸減少，從而引起貧血。
當(dāng)然，除了促紅細(xì)胞生成素缺乏引起腎性貧血外，還有不少其他因素也可導(dǎo)致慢性腎臟病患者發(fā)生貧血并發(fā)癥，如：
慢性腎衰竭患者大量毒素蓄積體內(nèi)，可抑制骨髓造血功能，加速紅細(xì)胞破壞，使紅細(xì)胞壽命縮短而致貧血；
慢性腎衰竭患者還常常因?yàn)槲改c道吸收障礙引起鐵和/或葉酸等“造血原料”攝入不足，從而引起貧血；
同時(shí)，慢性腎臟病患者，尤其是慢性腎功能不全患者長(zhǎng)期控制蛋白質(zhì)的攝入，加之尿液排出蛋白的量增加，血漿蛋白濃度降低，導(dǎo)致“造血原料”蛋白質(zhì)不足而引起貧血；
慢性腎臟病患者常容易并發(fā)各種急慢性感染，也是導(dǎo)致貧血的原因之一。
此外，慢性腎功能衰竭晚期患者常有出血傾向，如鼻衄，月經(jīng)過(guò)多，牙齦及胃腸道出血等等會(huì)使原有貧血加重。
因此，大家應(yīng)警惕貧血背后可能隱藏著腎病。對(duì)于貧血患者，即使是那些無(wú)明顯的腎臟病表現(xiàn)及病史的患者，尤其是伴有高血壓者，千萬(wàn)別忘了到醫(yī)院腎臟專科門診做尿常規(guī)、腎功能、腎臟B超等常規(guī)檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能隱藏的“幕后真兇”。
篇4
1、哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞不存在任何細(xì)胞器，也沒(méi)有細(xì)胞核。
2、哺乳動(dòng)物幼年的紅細(xì)胞是存在細(xì)胞器和細(xì)胞核的。因?yàn)橛啄甑募t細(xì)胞需要合成各種蛋白質(zhì)（包括酶類）。到了紅細(xì)胞成熟后，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體破裂，水解酶被釋放出來(lái)，把紅細(xì)胞內(nèi)的所有細(xì)胞器和細(xì)胞核都水解沒(méi)了，所以成熟的紅細(xì)胞是沒(méi)有細(xì)胞器的。
3、成熟紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞器，是為了運(yùn)輸盡可能多的氧氣。
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篇5
【關(guān)鍵詞】 紅細(xì)胞
Progress in the Study of Lyophilization of Human Red Blood Cells —— Review
Abstract Now the clinical preservation methods of human red blood cells mainly include hypothermic storage (4℃) and cryopreservation (-80℃ or -196℃). The preservation time of hypothermic storage of red blood cells is relatively short and it is easy to be contaminated by microbes. Cryopreservation greatly prolongs the storage time，but it needs heavy storage equipments. Because the protective solutions in cryopreservation contain glycerol，red blood cells need complicated washing in order to remove glycerol. These shortage methods limit their application to some special conditions，such as war or natural disasters. Compared with conventional preservation methods of red blood cells，lyophilization has many advantages such as less weight，convenient transportation，room temperature preservation，prone to be rehydrated. In this review，the progress and challenge in the development of lyophilization of red blood cells，especially application of trehalose and its mechanism in the lyophilization of red blood cells were systematically discussed. This review can provide some theoretic guidance for developing a safe，simple and efficient preservation approach of red blood cells by lyophilization.
Key words red blood cell；lyophilization；trehalose；biomembrane
紅細(xì)胞是血液中含量最多的細(xì)胞，它通過(guò)其中的血紅蛋白從肺部攜帶氧氣運(yùn)送到周邊器官，在維持人體正常機(jī)能起著重要的作用。紅細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，它沒(méi)有細(xì)胞核、線粒體等復(fù)雜的細(xì)胞器，只有一層質(zhì)膜包裹著血紅蛋白。紅細(xì)胞對(duì)于維持生命具有重要意義，人們由于創(chuàng)傷或其他原因造成大量失血而引起紅細(xì)胞的丟失時(shí)，全身器官會(huì)氧氣供應(yīng)不足，從而危及生命。及時(shí)輸注紅細(xì)胞是治療這類病例的有效手段。但是，目前在臨床上使用的紅細(xì)胞保存的主要方法有4℃低溫和-80℃深低溫保存。這些保存技術(shù)都有很好的效果，但又存在明顯不足：4℃保存時(shí)間短，最長(zhǎng)不過(guò)42天，而且紅細(xì)胞容易受到污染，從而造成浪費(fèi)；-80℃保存可以將保存時(shí)間延長(zhǎng)至10-20年以上，但需要笨重的超低溫冰箱等專門設(shè)備，運(yùn)輸不方便，能源消耗大。這些缺陷嚴(yán)重限制了常規(guī)保存方法在惡劣自然條件或戰(zhàn)時(shí)條件下的應(yīng)用［1］。對(duì)比之下，冰凍干燥保存的紅細(xì)胞具有很多優(yōu)勢(shì)：便于長(zhǎng)期保存，設(shè)備重量大大減輕，方便運(yùn)輸，易于消毒，而且在運(yùn)輸過(guò)程中不存在振蕩性溶血等問(wèn)題。因此，一旦紅細(xì)胞冰凍干燥研制成功，必將開(kāi)創(chuàng)血液供應(yīng)的新局面。
冰凍干燥對(duì)于紅細(xì)胞而言是一個(gè)不利的綜合影響過(guò)程，細(xì)胞在此過(guò)程中不但要經(jīng)受冷凍的打擊，而且也要受到干燥的損傷。我們的研究結(jié)果表明，在冰凍干燥過(guò)程中，干燥對(duì)于紅細(xì)胞的損傷占有主要地位［2］。通常，由于干燥而引起的細(xì)胞內(nèi)水分的蒸發(fā)使分子間和分子內(nèi)的聯(lián)系發(fā)生劇烈變化。在一些生物中，當(dāng)細(xì)胞燥時(shí)，由于水分的缺失，細(xì)胞內(nèi)的蛋白和膜可能通過(guò)氫鍵結(jié)合其他分子來(lái)取代它們對(duì)水分子的結(jié)合，這是生物在不利環(huán)境的一種保護(hù)適應(yīng)機(jī)制。但是如果沒(méi)有相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制，則水分的缺失而導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水分子的結(jié)合將被蛋白與蛋白之間的相互作用所取代，從而可能造成蛋白不可逆聚集或者發(fā)生變性，這會(huì)直接導(dǎo)致干燥后細(xì)胞死亡［3］。
研究歷史
紅細(xì)胞冰凍干燥保存研究經(jīng)歷三個(gè)主要發(fā)展階段。這三個(gè)主要發(fā)展階段為：
第一階段：1960年Meryman等［4］首次進(jìn)行人紅細(xì)胞的冰凍干燥保存研究。由于甘油的粘度過(guò)高，所以他沒(méi)有添加任何保護(hù)劑而直接對(duì)血液進(jìn)行冰凍干燥。Meryman宣稱再水化后的細(xì)胞回收率為30％-50％。但于1977年在一次關(guān)于冰凍干燥保存研究的研討會(huì)上，與會(huì)者承認(rèn)紅細(xì)胞質(zhì)膜在冰凍干燥過(guò)程中受到嚴(yán)重?fù)p傷［5］。通常認(rèn)為，在20世紀(jì)80年代以前的研究中，從未獲得過(guò)一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的冰凍干燥紅細(xì)胞。
第二階段：從1989年開(kāi)始冰凍干燥保存紅細(xì)胞研究進(jìn)入真正具有臨床意義的科學(xué)研究階段。Goodrich等［6，7］在此期間進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，先后篩選保護(hù)液和再水化液的成分組合，并對(duì)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探索。此后10年，在國(guó)外紅細(xì)胞冰凍干燥保存?zhèn)涫苤匾暎缑绹?guó)，政府投入大量科研基金，1997-1999年度受美國(guó)政府資助的相關(guān)研究報(bào)告就有20篇之多［8］。但這期間，冰凍干燥保存紅細(xì)胞研究主要是篩選保護(hù)劑及溫度等物理參數(shù)，而沒(méi)有深入研究冰凍干燥對(duì)紅細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。Goodrich［6］認(rèn)為，葡萄糖可以保護(hù)紅細(xì)胞和血紅蛋白，而大分子聚合物使保護(hù)液呈玻璃化，從而可以有效地保護(hù)紅細(xì)胞。然而，這些研究仍然沒(méi)有實(shí)現(xiàn)冰凍干燥后紅細(xì)胞可以在室溫下長(zhǎng)期保存的目標(biāo)，究其原因主要是大分子聚合物不能進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，而只使細(xì)胞外液保持玻璃化，所以無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的有效保護(hù)［9］；另外在室溫下樣品的氧化問(wèn)題仍然值得商榷。在此期間冰凍干燥保存的紅細(xì)胞存活率僅有20％-30％［9］。Rindler等［10］采用麥芽糖和羥乙基淀粉作為主要保護(hù)劑進(jìn)行擱板溫度對(duì)冰凍干燥保存紅細(xì)胞影響的研究，結(jié)果表明，隨著凍干機(jī)擱板溫度的下降，冰凍干燥后紅細(xì)胞溶血率也呈下降趨勢(shì)，當(dāng)擱板溫度為-35℃時(shí)，溶血率最低，但當(dāng)進(jìn)一步降低溫度時(shí)，溶血率反而上升。盡管Rindler的試驗(yàn)結(jié)果表明，在冰凍干燥過(guò)程中當(dāng)凍干機(jī)擱板溫度為-35℃時(shí)的效果最好，但其溶血率仍然達(dá)到85％，最后幾乎到無(wú)可用的紅細(xì)胞。我們的研究表明，冰凍干燥的問(wèn)題主要是質(zhì)膜受損而造成血紅蛋白泄漏。當(dāng)保護(hù)液由大分子聚合物、蛋白和低濃度的滲透性保護(hù)劑組成時(shí)，冰凍干燥保存紅細(xì)胞后的上清中游離血紅蛋白濃度低于1 g/L，而且細(xì)胞回收率達(dá)到80％左右，但當(dāng)將再水化后的紅細(xì)胞置于4℃下保存不同時(shí)間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶血率呈上升趨勢(shì)［11］。這說(shuō)明冰凍干燥對(duì)紅細(xì)胞膜造成損傷。從超微結(jié)構(gòu)來(lái)看，采用大分子物質(zhì)作為主要保護(hù)劑進(jìn)行紅細(xì)胞冰凍干燥保存后的細(xì)胞形態(tài)分為3類：結(jié)構(gòu)完整（A）、部分完整(B)和血紅蛋白完全泄漏(C)，具體見(jiàn)圖1。
第三階段：進(jìn)入21世紀(jì)，研究人員對(duì)冷凍和干燥對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的影響進(jìn)行深入的研究［12-14］。在此期間海藻糖和蔗糖等二糖在細(xì)胞膜保護(hù)方面的作用引起人們廣泛興趣。Wolkers等［14］發(fā)現(xiàn)，血小板可以通過(guò)隨溫度變化的液相內(nèi)吞作用吸收海藻糖，吸收效率可以達(dá)到50％以上。吸收海藻糖后的血小板冰凍干燥后的存活率為85％，而且對(duì)凝血酶、膠原、ADP和瑞斯托菌素的反應(yīng)與新鮮血小板相似。受到這項(xiàng)研究的啟發(fā)，Satpathy等［1］對(duì)紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的吸收情況進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著保護(hù)液中海藻糖濃度和孵育溫度的變化，紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的吸收率也相應(yīng)的發(fā)生變化，當(dāng)溫度為37℃時(shí)的吸收率最高，但溶血率也隨之上升。這些研究為進(jìn)一步開(kāi)展紅細(xì)胞冰凍干燥保存研究提供了理論依據(jù)。
研究的熱點(diǎn)——海藻糖
由于紅細(xì)胞在冰凍干燥保存過(guò)程中要經(jīng)受冷凍和干燥的雙重傷害，所以此項(xiàng)研究面臨著巨大的困難。海藻糖可能為冰凍干燥保存紅細(xì)胞開(kāi)辟新途徑。研究人員在一些耐干燥的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境極端干燥時(shí)其體內(nèi)海藻糖的濃度可達(dá)干重的20％以上。這些生物包括：酵母、一些植物、許多細(xì)菌以及一些無(wú)脊椎動(dòng)物（例如水熊等）。在干燥的環(huán)境下，海藻糖或其他的二糖形成一種高度粘稠的玻璃化狀態(tài)，這有利于這些生物在干燥環(huán)境中存活［15］。
海藻糖的性質(zhì)及其作用機(jī)制
海藻糖是一種非還原性二糖［16］，由兩個(gè)葡萄糖殘基通過(guò)半縮醛羥基相結(jié)合，結(jié)構(gòu)為α-D-Glcp-(11)- α-D-Glcp。海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于蔗糖和麥芽糖，常溫下性質(zhì)穩(wěn)定。對(duì)于海藻糖保護(hù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的作用機(jī)制，目前有以下幾種觀點(diǎn)：
Clegg［17］提出一種水分替代假說(shuō)，他認(rèn)為甘油、海藻糖以及其他的碳水化合物和氨基酸等保護(hù)成分是作為水分替代分子與氫鍵結(jié)合，從而使細(xì)胞免受干燥的傷害。根據(jù)這個(gè)假說(shuō)，一些耐干燥生物為了避免干燥損傷而在體內(nèi)積聚海藻糖或蔗糖等碳水化合物，從而替代水分子和氫鍵結(jié)合，當(dāng)環(huán)境中水分充足時(shí)，水分子又重新與氫鍵結(jié)合，而此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的二糖又可以作為能源代謝物質(zhì)。20世紀(jì)80年代，Crowe等［18］認(rèn)為，在海藻糖存在的條件下生物分子或分子集合體例如細(xì)胞膜和蛋白在干燥的環(huán)境下可以保持穩(wěn)定，而且海藻糖的作用效果明顯好于其他的糖類。從那時(shí)起，海藻糖開(kāi)始應(yīng)用于疫苗、脂質(zhì)體以及人體器官的低溫保存，并且取得較好的保護(hù)效果。Leslie等［19］報(bào)道，在海藻糖存在的條件下冰凍干燥保存細(xì)菌可以獲得較高的存活率。相反蔗糖對(duì)細(xì)菌的冰凍干燥保存效果很差。這些工作證明了海藻糖是一種特殊的二糖，其對(duì)生物細(xì)胞的保護(hù)作用明顯優(yōu)于其他糖類。
Branca等［20］認(rèn)為，對(duì)海藻糖的溶液性質(zhì)進(jìn)行研究可能有助于解釋海藻糖對(duì)生物材料的穩(wěn)定作用。但是這些性質(zhì)必須在大量水分存在的條件下才和生物穩(wěn)定有關(guān)聯(lián)。而在干燥情況下，由于水分幾乎全部缺失，所以這個(gè)假說(shuō)無(wú)法解釋干燥環(huán)境下海藻糖對(duì)細(xì)胞材料的穩(wěn)定作用。
另外，在干燥條件下可降解糖類和蛋白質(zhì)的所發(fā)生的美拉德反應(yīng)已經(jīng)被認(rèn)為是干燥損傷的一個(gè)重要原因。海藻糖和蔗糖都是非降解性二糖，這至少可以部分解釋為什么在干燥環(huán)境中海藻糖和蔗糖可以在一些生物體內(nèi)積聚，而麥芽糖由于是可降解性二糖，易于發(fā)生美拉德反應(yīng)，因此可能不適合細(xì)胞的干燥保存。O′Brien等［21］在海藻糖、蔗糖和葡萄糖存在的條件下建立一個(gè)冰凍干燥模型系統(tǒng)，水的活度為0.33，pH值為2.5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖的美拉德反應(yīng)速度和葡萄糖的一樣快，而且二者比海藻糖的反應(yīng)速度大約快2 000倍以上。這個(gè)試驗(yàn)充分證明海藻糖在干燥環(huán)境中的穩(wěn)定性優(yōu)于蔗糖或其他糖類。
相對(duì)于其他糖類而言，海藻糖具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，這有利于在常溫條件下干燥樣品性質(zhì)的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)耐干燥生物處于干燥脫水或高滲透壓環(huán)境時(shí)，海藻糖可以在細(xì)胞膜外面形成一種玻璃狀的保護(hù)層，從而提高了細(xì)胞的滲透壓耐受性和耐干燥性。這種保護(hù)方式使得一些耐干燥生物即使在極端環(huán)境中脫水達(dá)99％時(shí)仍能存活［15］。
Sun等［22］發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體用蔗糖干燥時(shí)，在潮濕環(huán)境發(fā)生嚴(yán)重的溶解，而用海藻糖保存時(shí)則沒(méi)有溶解發(fā)生。海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度遠(yuǎn)高于蔗糖，因此可以預(yù)測(cè)在蔗糖中加入少量的水可以使其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降至保存溫度以下，而在海藻糖中加入相同量的水，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度仍然在保存溫度以上，因此仍保持穩(wěn)定。當(dāng)用海藻糖干燥保存的樣品保存于20℃時(shí)，這個(gè)溫度比海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低100℃左右，而當(dāng)用蔗糖干燥并于20℃下保存時(shí)，這個(gè)溫度僅比蔗糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低45℃左右。這說(shuō)明在相同的室溫保存條件下，海藻糖的干燥保存效果更優(yōu)于蔗糖。Aldous等［23］認(rèn)為，既然海藻糖的晶體結(jié)構(gòu)是二水合物，在吸收水分的過(guò)程中，一些海藻糖轉(zhuǎn)變成晶體態(tài)的二水合物，因此使余下的海藻糖和水分子脫離接觸，這也提高了體系的玻璃化程度。Crowe的試驗(yàn)結(jié)果表明，在海藻糖干燥保存樣品中添加少量水分，結(jié)果結(jié)晶態(tài)的二水合物迅速出現(xiàn)，剩下的海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度卻仍然保持很高［24］。Buera等［25］提供的證據(jù)表明，當(dāng)用海藻糖干燥保存的蛋白酶樣品被升溫到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以上，其仍保持穩(wěn)定。因此他們得出結(jié)論：玻璃化狀態(tài)自身不是必要的，而樣品保持一種分子間的無(wú)序狀態(tài)而非結(jié)晶態(tài)是非常重要的。Crowe等［26］認(rèn)為，玻璃化使干燥樣品的成分相互靜止，從而避免了在干燥條件下各種成分的過(guò)分接觸；另外玻璃化自身不能完全實(shí)現(xiàn)對(duì)生物膜的干燥保護(hù)作用。
以上的各種假說(shuō)均證明海藻糖的冰凍干燥保存效果要優(yōu)于其他糖類，因此用海藻糖作為一種冰凍干燥保護(hù)劑來(lái)保存哺乳動(dòng)物細(xì)胞可能是一個(gè)非常有前途的方法。紅細(xì)胞膜是典型的液態(tài)鑲嵌模型結(jié)構(gòu)，雙層磷脂中分布著一些功能蛋白。Wolkers等［12］發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞膜存在兩個(gè)相變點(diǎn)，分別在14℃和34℃左右。在發(fā)生相變時(shí)，膜內(nèi)外磷脂分布發(fā)生變化，細(xì)胞臨時(shí)通透性增加，這可能造成血紅蛋白的泄漏，但同時(shí)也可能引起外源分子進(jìn)入紅細(xì)胞。Hays等［27］在冰凍干燥脂質(zhì)體的再水化過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)類似膜相變現(xiàn)象。以脂質(zhì)體作為細(xì)胞模型進(jìn)行冰凍干燥，再水化后脂質(zhì)體的形態(tài)完整率為100％，但同時(shí)他發(fā)現(xiàn)，在溶液狀態(tài)時(shí)脂質(zhì)體的液晶相到凝膠相的轉(zhuǎn)變溫度（Tm）為-1℃。如果不添加海藻糖，當(dāng)完全干燥時(shí)脂質(zhì)體的Tm升至＋70℃；而如果在保護(hù)液中添加海藻糖，則Tm降至-20℃左右，這說(shuō)明在完全干燥的情況下脂質(zhì)體仍然保持液晶相，而且再水化時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相變。但是，在海藻糖存在下，磷脂的Tm降低的機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議，迄今仍然沒(méi)有一個(gè)完美的解釋。
總之，目前還沒(méi)有一種理論可以很好的解釋海藻糖的保護(hù)機(jī)制，我們的觀點(diǎn)是，海藻糖之所以具有提高細(xì)胞耐干燥能力的效果，可能是以上幾種理論共同作用的結(jié)果。
海藻糖進(jìn)入細(xì)胞膜的途徑
采用海藻糖等二糖作為冰凍干燥保護(hù)劑的主要挑戰(zhàn)是如何使海藻糖進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)使其在細(xì)胞質(zhì)中達(dá)到較高的濃度。目前主要有以下幾種方法：Oliver等［28］和Wolkers等［14］采用細(xì)胞內(nèi)吞作用將海藻糖導(dǎo)入人干細(xì)胞和血小板中；Beattie等［29］利用胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的質(zhì)膜在磷脂相變過(guò)程中的暫時(shí)性通透增加將海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)二甲亞砜能明顯提高胰島細(xì)胞對(duì)海藻糖的吸收率。他們認(rèn)為二甲亞砜在此過(guò)程中的作用可能是作為一種較弱的表面活性劑。Eroglu等［30］和Chen等［31］利用基因工程合成了一種金黃色葡萄球菌а-溶血素的突變體，這種蛋白可以在細(xì)胞膜上打孔，從而可以增加細(xì)胞膜的通透性。采用這種方法，他們發(fā)現(xiàn)，將海藻糖導(dǎo)入幾種人細(xì)胞中可以提高其耐干燥性。Guo等［32］和Puhlev等［33］在人上皮纖維原細(xì)胞中成功表達(dá)了編碼6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因，將此基因片斷導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中，可以合成海藻糖，從而提高了這些細(xì)胞的耐干燥性。在采用此基因工程技術(shù)處理的細(xì)胞系中，細(xì)胞內(nèi)積聚的海藻糖濃度可以達(dá)到80 mmol/L，極大提高了這些細(xì)胞的滲透壓耐受性。在其他的試驗(yàn)中，電子打孔技術(shù)也被應(yīng)用于將海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞膜［34］。盡管這種方法可以使海藻糖進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，但同時(shí)也使細(xì)胞的滲透壓耐受性降低，可能不適合于紅細(xì)胞的冰凍干燥。另外，Eroglu等［35］采用顯微操作技術(shù)將海藻糖注射到人卵母細(xì)胞內(nèi)，然后在低溫下保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻糖可以提高卵母細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性。
對(duì)于紅細(xì)胞的冰凍干燥保存而言，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，基因工程技術(shù)、顯微注射、增加膜通透性等技術(shù)不適合于將海藻糖導(dǎo)入紅細(xì)胞。而利用細(xì)胞膜隨溫度發(fā)生的磷脂相變來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)海藻糖的吸收可能是一個(gè)比較好的途徑。
海藻糖在紅細(xì)胞冰凍干燥保存中的
應(yīng)用前景分析如何使海藻糖進(jìn)入紅細(xì)胞基質(zhì)中是冰凍干燥保存紅細(xì)胞能否成功的第一步。紅細(xì)胞并不具備血小板的內(nèi)吞作用，由于沒(méi)有細(xì)胞核，也無(wú)法通過(guò)基因工程技術(shù)將編碼6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核并且表達(dá)。但是Satpathy等［1］根據(jù)紅細(xì)胞膜質(zhì)膜隨溫度變化而發(fā)生相變的特性，將紅細(xì)胞在37℃的高濃度的海藻糖緩沖液中保存液中孵育7小時(shí)，這種方法可以使細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度達(dá)到50 mmol/L。研究表明，紅細(xì)胞的這種吸收方式不同于血小板的內(nèi)吞作用，它是利用滲透壓不平衡和膜磷脂相變相結(jié)合的辦法使外源性海藻糖進(jìn)入基質(zhì)中，因此這種方法是一種被動(dòng)吸收的方法，必須借助于滲透壓差和內(nèi)外源海藻糖的濃度差。
在血小板吸收海藻糖的試驗(yàn)中，外源性海藻糖的濃度只有35 mmol/L［14］，而在紅細(xì)胞吸收海藻糖的試驗(yàn)中，外源性海藻糖的濃度可以達(dá)到1 000 mmol/L左右，是血小板實(shí)驗(yàn)中海藻糖濃度的30倍［1］。只有在如此高的濃度下，海藻糖才能高效地進(jìn)入紅細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)，而且高滲對(duì)紅細(xì)胞膜的影響也值得商榷。
另外，紅細(xì)胞是通過(guò)其內(nèi)在的血紅蛋白來(lái)攜帶氧氣運(yùn)輸?shù)饺砀髌鞴佟oodrich［6］認(rèn)為，單糖主要是葡萄糖對(duì)血紅蛋白有很好的保護(hù)作用，而二糖是否對(duì)血紅蛋白有保護(hù)作用尚需要研究。
冰凍干燥保存紅細(xì)胞面臨的挑戰(zhàn)
盡管紅細(xì)胞冰凍干燥保存具有重要意義，但在實(shí)際研究中仍然面臨著巨大的困難，甚至有人對(duì)此項(xiàng)研究能否成功持有懷疑態(tài)度［36］。
紅細(xì)胞對(duì)高滲和干燥環(huán)境極為敏感，盡管人們對(duì)紅細(xì)胞冰凍干燥保存進(jìn)行了幾十年的研究，但目前的結(jié)果仍然不能令人滿意，盡管目前有許多試驗(yàn)證明海藻糖等二糖可以提高一些細(xì)胞的耐干燥性，但仍然存在一些爭(zhēng)議，一些人認(rèn)為海藻糖僅僅可以提高細(xì)胞的滲透壓耐受性，而無(wú)法提高細(xì)胞耐干燥性［37］，另外海藻糖是否適合于紅細(xì)胞的冰凍干燥保存仍是一個(gè)未知數(shù)。Tunnacliffe等［37］采用海藻糖作為主要保護(hù)劑干燥保存小鼠細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠細(xì)胞中的內(nèi)源性海藻糖濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)，其細(xì)胞的滲透壓耐受性有所提高，但即使細(xì)胞膜內(nèi)外都存在高濃度海藻糖時(shí)，細(xì)胞的耐干燥性也得不到有效提高，這說(shuō)明在提高細(xì)胞耐干燥性方面，只有海藻糖是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。為什么？因?yàn)橄鄬?duì)于紅細(xì)胞和血小板而言，有核細(xì)胞結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，含有一些復(fù)雜的細(xì)胞器，例如細(xì)胞核、線粒體等，因此有核細(xì)胞的冰凍干燥具有更大的挑戰(zhàn)性，海藻糖等保護(hù)劑能否進(jìn)入細(xì)胞核，從而有效保護(hù)細(xì)胞的基因組結(jié)構(gòu)仍然沒(méi)有答案。紅細(xì)胞和血小板的結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，沒(méi)有復(fù)雜的細(xì)胞器，因此只有紅細(xì)胞的冰凍干燥取得成功，才能為進(jìn)一步開(kāi)展有核細(xì)胞的冰凍干燥保存打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
概括地說(shuō)，紅細(xì)胞冰凍干燥保存主要是保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和血紅蛋白的正常功能。Goodrich等［6］認(rèn)為，葡萄糖可以自由進(jìn)出紅細(xì)胞膜，而且可以保護(hù)血紅蛋白，還可以為紅細(xì)胞提供代謝能量的來(lái)源。所以他在保護(hù)液中采用的是單糖。由于單糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度很低，而且容易發(fā)生美拉德反應(yīng)，這些都可能對(duì)紅細(xì)胞膜造成損傷而導(dǎo)致血紅蛋白泄漏，因此，Goodrich又在保護(hù)液中添加大分子物質(zhì)以提高保護(hù)液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，但是由于大分子物質(zhì)無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，所以其對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用是有限的。另外，盡管大分子物質(zhì)提高保護(hù)液的玻璃化程度，但同時(shí)也提高了其滲透壓，而高滲透壓對(duì)細(xì)胞也有很大的影響。所以我們認(rèn)為，冰凍干燥保存紅細(xì)胞的方法首先要滿足兩個(gè)條件：保護(hù)劑可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和保護(hù)體系要等滲或接近等滲。
紅細(xì)胞的攜氧功能來(lái)自于其中的血紅蛋白，因此在冰凍干燥過(guò)程中如何保護(hù)血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)具有重要意義。Goodrich等［6］在保護(hù)液中添加葡萄糖來(lái)保護(hù)血紅蛋白。二糖是否對(duì)血紅蛋白有保護(hù)作用尚需研究。正常的血紅蛋白是四亞級(jí)聚合體，如果血紅蛋白解聚，其將喪失攜氧功能。另外冰凍干燥保存紅細(xì)胞的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是可以室溫保存，在保存過(guò)程中如何防止血紅蛋白氧化甚至變性也是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。
小 結(jié)
在紅細(xì)胞冰凍干燥保存過(guò)程中，高濃度的大分子物質(zhì)盡管可以使細(xì)胞外液達(dá)到玻璃化，但由于大分子物質(zhì)無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以其對(duì)膜的保護(hù)作用很有限，因此尋求一種可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且對(duì)質(zhì)膜有非常好的保護(hù)效果的保護(hù)劑非常重要。海藻糖在保護(hù)生物材料的穩(wěn)定性方面具有非常好的效果。將海藻糖用于紅細(xì)胞冰凍干燥的想法來(lái)源于海藻糖在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞或脂質(zhì)體的應(yīng)用，所以目前的研究也僅僅是嘗試而已，海藻糖是否真正有利于紅細(xì)胞的冰凍干燥保存還需要實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)。
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篇6
【摘要】 目的 進(jìn)一步研究抗體封閉紅細(xì)胞血型的鑒別和血型鑒定的方法。方法 選取了鐵嶺市婦嬰醫(yī)院2011年1月至2012年1月間檢測(cè)的血型正反定型不符、后經(jīng)鑒定為抗體封閉標(biāo)本22例，以此為研究對(duì)象，利用洗滌放散紅細(xì)胞、家族和病情調(diào)查鑒定等方法來(lái)判斷血型。結(jié)果 全部22例標(biāo)本的直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+)。結(jié)論 在進(jìn)行特殊病例血型鑒定的過(guò)程中，我們要特別注意直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果，這一結(jié)果對(duì)于準(zhǔn)確判斷封閉抗體具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】 抗體封閉；紅細(xì)胞血型；檢測(cè) 作者單位: 112000 鐵嶺市中心血站 相關(guān)的研究結(jié)果表明：抗體封閉紅細(xì)胞血型的檢測(cè)具有重要的意義［1］。本文基于此，為了進(jìn)一步研究抗體封閉紅細(xì)胞血型的鑒別和血型鑒定的方法，選取了鐵嶺市婦嬰醫(yī)院2011年1月至2012年1月間檢測(cè)的血型正反定型不符、后經(jīng)鑒定為抗體封閉標(biāo)本22例，以此為研究對(duì)象，針對(duì)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。1 資料與方法11 一般資料 以鐵嶺市婦嬰醫(yī)院2011年1月至2012年1月間檢測(cè)的血型正反定型不符、后經(jīng)鑒定為抗體封閉標(biāo)本22例為研究對(duì)象。這22例標(biāo)本中，都屬于正定型不凝集。在22例標(biāo)本中有6例屬于自身免疫溶血性貧血的患者，4例屬于錯(cuò)誤輸血漿，還有12例屬于HDN患兒標(biāo)本。12 檢測(cè)方法121 家族及病情調(diào)查 針對(duì)患者的父母進(jìn)行相關(guān)的血型調(diào)查分析，根據(jù)患者父母的血型調(diào)查結(jié)果可以對(duì)患者的血型進(jìn)行初步的判斷。通過(guò)這種家族及病情的調(diào)查，來(lái)確定病情是否對(duì)紅細(xì)胞抗原的產(chǎn)生了不同程度的影響。122 直接抗人球蛋白試驗(yàn) 首先要求對(duì)患者的紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌，洗滌的次數(shù)為3次。洗滌3次以后，按照一定的濃度要求配制懸液，一般濃度控制為05%。然后，取50 μL分別加入抗球蛋白卡中，1000 r/min離心10 min觀察結(jié)果。123 放散試驗(yàn) 首先要求對(duì)患者的紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌，洗滌的次數(shù)為3次。洗滌3次以后，壓積紅細(xì)胞放入等量生理鹽水。然后將其放置在溫度為56℃的水浴箱中，使其孵育10 min。在整個(gè)過(guò)程中要進(jìn)行適當(dāng)?shù)妮p微振蕩。振蕩以后，使用溫度為56℃的溫鹽水再次進(jìn)行洗滌，洗滌的次數(shù)為3次。洗滌以后的紅細(xì)胞按照上述的直接抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則重復(fù)本操作，直至直接抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示為陰性。124 血型鑒定 按照一定的濃度要求將放散后的紅細(xì)胞配制懸液，一般濃度控制為05%。然后，取50 μL分別加入血型微柱凝膠卡正定型孔及ctl孔中，1000 r/min離心10 min觀察結(jié)果。2 結(jié)果
本文研究的結(jié)果為，全部22例標(biāo)本的直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+)。3 討論
在血型鑒定的正定型試驗(yàn)中,只有紅細(xì)胞抗原的充分暴露才能與鑒定血清發(fā)生結(jié)合從而出現(xiàn)凝集。但在臨床上,有少數(shù)患者在病理狀態(tài)下,如存在自身抗體、新生兒溶血(HDN)、輸注不配合血液后,紅細(xì)胞上結(jié)合了大量的抗體,導(dǎo)致紅細(xì)胞抗原被抗體封閉,不能與檢測(cè)血清中的抗體結(jié)合,從而出現(xiàn)正反定型不符［2］。抗體封閉血型檢測(cè)的關(guān)鍵是如何判斷紅細(xì)胞抗原被封閉，因?yàn)樵谟行┎±校貏e是新生兒抗體還未產(chǎn)生時(shí)，病理狀態(tài)、標(biāo)本本身的特殊情況與抗體封閉難以區(qū)分。以上病例中，自身免疫溶血性貧血患者檢測(cè)時(shí)，正反定型結(jié)果不一致，那么結(jié)合患者家族和病情調(diào)查，很容易判斷出抗體封閉［3］。但錯(cuò)誤輸血時(shí)，如果患者血清中存在游離的抗A抗體，如以上患者，如果輸注的抗B抗體在血清中存在，則正反定型都可能是O型，從而導(dǎo)致血型鑒定的錯(cuò)誤。同樣，新生兒紅細(xì)胞如果被抗體封閉，反定型又沒(méi)有抗體產(chǎn)生的時(shí)候，也很容易導(dǎo)致血型錯(cuò)判。所以，在血型鑒定中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)和病情的了解也是非常重要的，通過(guò)放散、洗滌患者紅細(xì)胞，結(jié)合病情等方法，全面、仔細(xì)、準(zhǔn)確鑒定患者血型。
參 考 文 獻(xiàn)［1］ Liu Fengmin, Li Chunfang, von Shuangli Anti E cause hemolytic disease of the newborn E antigen blocking phenomenon: report of 1 cases. China Journal, 2009, 22 (9): 759760.［2］ 王藍(lán)鴿,周金安抗體封閉紅細(xì)胞血型的檢測(cè) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2011,8(4):458459.［3］ 邱艷, 章?lián)P培紅細(xì)胞血型抗原化學(xué)修飾的研究進(jìn)展軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2010,12(3):238239.
篇7
【關(guān)鍵詞】發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)(NHFTR)；去白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液；紅細(xì)胞懸液
【Abstract】 Objective To investigate the long-term blood transfusion needs — less leukocyte infusion in patients with aplastic anemia and red blood cell red blood cell suspension and the suspension of therapy-induced febrile non-hemolytic transfusion reaction (NHFTR) comparison. Methods 61 cases of aplastic anemia in hospital patients with fewer white blood cells red blood cells and 58 AA patients compared with red blood cells transfusion. Results The infusion of patients with aplastic anemia less white than red cells and red blood cells， no significant changes in efficacy， but the non-hemolytic febrile transfusion reactions (NHFTR) decreased significantly. Conclusions Long-term blood transfusion blood transfusion — aplastic anemia patients need， you should choose a small infusion of white blood cell red blood cell suspension infusion.
【Keywords】 febrile non-hemolytic transfusion reaction (NHFTR); to white blood cells red blood cells; red blood cell
隨著臨床對(duì)成分輸血的認(rèn)識(shí)不斷提高，成分輸血已被廣泛應(yīng)用到臨床，特別對(duì)一些需要長(zhǎng)期輸血的患者，發(fā)生非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)(NHFTR)的機(jī)會(huì)增多。針對(duì)此類病人輸注少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液越來(lái)越被受到重視。本文就我院幾年來(lái)再障患者輸注少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液與紅細(xì)胞懸液的比較分析，報(bào)道如下。
1材料和方法
1.1供者的選擇
1.1一般資料： 61例用少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液輸注的再障患者均為2009年度入住我院和門診的病歷。58例用紅細(xì)胞懸液輸注的再障患者均為2007年度入住我院和門診的病歷。設(shè)61例患者為觀察組，58例患者為對(duì)照組。
1.2患者輸血中或輸血后體溫升高1℃以上，并以發(fā)熱和寒戰(zhàn)為臨床主要表現(xiàn)，且排除溶血；細(xì)菌污染；過(guò)敏引起的發(fā)熱并無(wú)其他原因可以解釋的發(fā)熱，判定為非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)（NHFTR）
1.3輸注患者的去白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液和紅細(xì)胞懸液均由徐州市中心血站提供。
1.2結(jié)果
1.2.1輸注結(jié)果：觀察組發(fā)生非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)(NFHTR)3例次，發(fā)生率為3.2%(3/95); 對(duì)照組發(fā)生率為17.4%(15/86)。而血紅蛋白的提高率沒(méi)明顯差異。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組數(shù)據(jù)差異有非常顯著性，且做兩兩比較，P＜0.05為判斷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.(200全血制備的紅細(xì)胞為一個(gè)單位.)
表格輸注少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液和紅細(xì)胞懸液的相關(guān)數(shù)據(jù)表
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2討論
隨著國(guó)內(nèi)輸血醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)一步深入，人們逐步發(fā)現(xiàn)異體血液中NHFTR與白細(xì)胞和血小板抗體有關(guān)。白細(xì)胞抗體包括HLA-抗體和血小板抗體，通常以前者多見(jiàn)。作為免疫原輸入而在患者體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，導(dǎo)致發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生.其發(fā)生與輸血次數(shù)密切相關(guān)，輸血次數(shù)越多，產(chǎn)生抗體的機(jī)會(huì)越多。引起發(fā)熱反應(yīng)的機(jī)率也越大［1］。非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)發(fā)生主要原因是一次或多次輸入血液或血液成分中的白細(xì)胞與受血者發(fā)生了同種免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了白細(xì)胞抗體而導(dǎo)致發(fā)熱等癥狀［2］。紅細(xì)胞懸液未去除白細(xì)胞、血小板及少量血漿，所以引起輸血反應(yīng)者多，而去白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液已去除95%左右的白細(xì)胞，90%以上血漿和血小板，故避免或減少了由血漿、白細(xì)胞、血小板及白細(xì)胞源性細(xì)胞因子引起的發(fā)熱、過(guò)敏等輸血反應(yīng)，所以發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)及過(guò)敏反應(yīng)者較紅細(xì)胞懸液顯著減少。而且研究證明，輸血前使用抗組胺和激素均不能預(yù)防其發(fā)生［2］。
由于臨床輸血一般不作HLA配型，因此絕大多數(shù)供受者之間HLA不合，產(chǎn)生HLA抗體的幾率較大。本組資料表明：輸紅細(xì)胞懸液者不良反應(yīng)發(fā)生率為17.4%，而輸注少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液為3.2%，輸紅細(xì)胞懸液引起的非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)明顯高于輸注少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液組，我們認(rèn)為少白細(xì)胞紅細(xì)胞輸注是預(yù)防發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)發(fā)生的一條有效的途徑。此外，受血者體內(nèi)血液中存在白細(xì)胞抗體時(shí)，應(yīng)于獻(xiàn)血者做白細(xì)胞交叉配血實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找合適的血液［3］但我們通常只做紅細(xì)胞血型交叉配血。因此采取用少白細(xì)胞紅細(xì)胞懸液來(lái)預(yù)防非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)（NHFTR）是最好的選擇。
因此，臨床應(yīng)大力開(kāi)展少白細(xì)胞紅細(xì)胞輸注，以保證輸血安全，提高輸血質(zhì)量，減少輸血并發(fā)癥，能有效的減少非溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。參考文獻(xiàn)
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篇8
尿紅細(xì)胞鏡檢異常指數(shù)：200~400這個(gè)范圍就應(yīng)該及時(shí)得到醫(yī)院進(jìn)行治療，一般都確定為腎炎。
腎臟的生理功能主要是排泄代謝產(chǎn)物及調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)和酸堿平衡，分泌多種活性物質(zhì)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以保證機(jī)體的正常生理功能。腎炎是由免疫介導(dǎo)的、炎癥介質(zhì)（如補(bǔ)體、細(xì)胞因子、活性氧等）參與的，最后導(dǎo)致腎固有組織發(fā)生炎性改變，引起不同程度腎功能減退的一組腎臟疾病，可由多種病因引起。在慢性過(guò)程中也有非免疫、非炎癥機(jī)制參與。
（來(lái)源：文章屋網(wǎng) ）
篇9
【關(guān)鍵詞】紅細(xì)胞 尿沉渣分析 顯微鏡檢測(cè)
中圖分類號(hào)：R446.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1005-0515（2011）1-336-02
尿沉渣紅細(xì)胞檢測(cè)能有效的診斷出泌尿系統(tǒng)疾病，可以作為檢測(cè)泌尿系統(tǒng)疾病的一項(xiàng)指標(biāo)，特別對(duì)于腎臟疾病可以作為重要的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[1]。尿液中的紅細(xì)胞檢測(cè)可以對(duì)各種腎、泌尿系統(tǒng)疾病做出有效的診斷，而對(duì)于各種原發(fā)性或繼發(fā)性急性或慢性的腎小球腎炎都能檢測(cè)，這對(duì)于腎炎或腎病的診斷和鑒別診斷有非常大的診斷價(jià)值。尿沉渣定量分析檢測(cè)法具有效率高、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)紅細(xì)胞時(shí)，由于尿液中的某些形成的成分會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，使得結(jié)果有所差異。現(xiàn)將收集整理的我院298例住院患者的晨尿標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)和尿沉渣定量檢測(cè)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如下：
1 材料與方法
1.1 收集標(biāo)本 收集整理2009年2月～2009月12月住院患者298例的晨尿標(biāo)本，采集整理后在2h內(nèi)完成尿沉渣檢測(cè)和顯微鏡檢測(cè)。
1.2 儀器與試劑 尿沉渣檢測(cè)采用國(guó)產(chǎn)的UF-100全自動(dòng)尿沉渣分析儀及配套試劑，質(zhì)控物；顯微鏡檢測(cè)采用Olympus光學(xué)顯微鏡。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)操作必須嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，在開(kāi)機(jī)檢測(cè)前必須用配套的質(zhì)控物質(zhì)(液)進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)。
留尿：必須采用干凈的一次性試管采集患者的新鮮晨尿液，此時(shí)尿液濃縮、偏酸性、尿中保留有較多、較完整的成分，可為理想標(biāo)本。
檢測(cè)：通常采集中段尿10ml，充分混勻后分成兩管，每管5ml，一管用于尿沉淀檢測(cè)，一管用于顯微鏡檢測(cè)。尿沉淀檢測(cè)嚴(yán)格按照UF-100分析儀上操作說(shuō)明進(jìn)行，以1800r/min離心5min，丟棄上層清液，留0.25ml，記錄試驗(yàn)結(jié)果，待沉渣混勻后用一次性滴管直接將尿液滴入切片進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，觀察20個(gè)視野，將試驗(yàn)結(jié)果傳入電腦記錄。留取尿量、離心速度和時(shí)間、剩余的尿沉渣量均直接影響紅細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得的數(shù)據(jù)均采用x2檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 正常參考范圍UF-100全自動(dòng)尿沉渣分析儀的紅細(xì)胞數(shù)量的正常參考范圍男性0～12/μl，女性在0～24/μl；顯微鏡檢測(cè)在高倍鏡下計(jì)數(shù)l0個(gè)大方格以內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)，以每微升紅細(xì)胞平均數(shù)為基準(zhǔn)，紅細(xì)胞正常參考范圍0～5/HP，，每高倍視野小于3個(gè)[2]，超出此范圍視為陽(yáng)性。
2.2 檢驗(yàn) 如果尿沉渣檢測(cè)的結(jié)果越顯微鏡檢測(cè)的結(jié)果兩者都為陽(yáng)性那么結(jié)果就為真陽(yáng)性a；如果尿沉渣檢測(cè)為陰性，而顯微鏡檢測(cè)為陽(yáng)性為假陰性b；如果尿沉渣檢測(cè)為陽(yáng)性，顯微鏡檢測(cè)為陰性為假陽(yáng)性c；如果兩者檢測(cè)的結(jié)果都為陰性那么結(jié)果就為真陰性d。以次方法按照下面的公式可以計(jì)算出假陰性率和假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率=c/(a+c)×100％，假陰性率=b/(b+d)×100％。
2.3 結(jié)果 顯微鏡檢查的陽(yáng)性率為31.8％；UF-100的陽(yáng)性率為35.9％，假陽(yáng)性率為11.2％，假陰性率為3％。兩種檢測(cè)方法的的陽(yáng)性符合率為69％，陰性符合率率為90％。所得的結(jié)果用x2進(jìn)行檢驗(yàn)分析，見(jiàn)表1。
表1 UF-100尿沉渣檢測(cè)和顯微鏡檢測(cè)的結(jié)果比較
3 討論
目前臨床上常見(jiàn)的檢測(cè)尿沉渣的方法是顯微鏡檢查和尿沉渣定量分析檢測(cè)這兩種，但是在確認(rèn)尿液的成分與性質(zhì)時(shí)，顯微鏡檢測(cè)一直是個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)[3]。UF-100尿沉渣全分析儀在尿液檢測(cè)中的使用可以很大程度上的減輕使用普通顯微鏡鏡檢的工作量，可以降低手工復(fù)檢率，降低人為的誤差率，借助于儀器的自動(dòng)化、高精度可以提高了檢測(cè)的結(jié)果，使其標(biāo)準(zhǔn)化，雖然UF-100全自動(dòng)尿沉渣分析喜用可以有效的對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、管型、結(jié)晶、上皮細(xì)胞等有形成分提供定量分析報(bào)告及散點(diǎn)圖，但對(duì)于一些成分的變化對(duì)其影響還是存在的。與顯微鏡檢測(cè)的方法相比，尿沉渣定量分析檢測(cè)系統(tǒng)具有同一性，即每個(gè)一標(biāo)本的檢測(cè)步驟模式完全一致，而且不受主觀因素影響，簡(jiǎn)便操作，準(zhǔn)確穩(wěn)定，但是會(huì)受尿液中的某些成分影響，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。
檢測(cè)紅細(xì)胞可以作為腎小球增殖性病變或炎癥損害的重要指標(biāo)，而紅細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)可以直接或間接地反映出腎臟病變的部位及性質(zhì)，通過(guò)在顯微鏡下對(duì)尿液中的紅細(xì)胞形態(tài)的觀察，能夠明確腎臟病變的部位。此外，紅細(xì)胞的數(shù)目對(duì)診斷亦有較大幫助。如果尿液中出現(xiàn)大量的多形型紅細(xì)胞往往聯(lián)想到腎小球的炎癥反應(yīng)已經(jīng)較重，及時(shí)考慮到可能為系膜病變或涉及系膜的血管炎病變等。
本組資料中出現(xiàn)的紅細(xì)胞呈假陽(yáng)性的有33例，通過(guò)顯微鏡的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中有21例都是因?yàn)闃?biāo)本渾濁，含有大量的非結(jié)晶體，有15例標(biāo)本的紅細(xì)胞發(fā)現(xiàn)時(shí)混合性紅細(xì)胞，還有4例是與紅細(xì)胞形態(tài)、體積相似的草酸鈣結(jié)晶體，還有2例是未完全分化的上皮細(xì)胞。非結(jié)晶體會(huì)對(duì)測(cè)定紅細(xì)胞產(chǎn)生影響，而且會(huì)使紅細(xì)胞的形態(tài)異常。而且在采尿、離心的過(guò)程中，離心對(duì)于尿液中有形成分有著非常大的影響，可以使尿液中紅細(xì)胞數(shù)量減少50％～60％[4]。綜上所述，尿沉渣檢測(cè)系統(tǒng)雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)時(shí)會(huì)受到一定尿液成分變化的影響，所以在臨床中可以結(jié)合顯微鏡檢測(cè)，提高檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，作為一種治療檢測(cè)手段，可以在臨床中推廣。
參考文獻(xiàn)
[1]巨川，張日恒，夏蔚珉．UF-50尿沉渣分析儀測(cè)定尿液紅細(xì)胞影響因素探討[J]．中華臨床醫(yī)藥，2003，4(21)：48．
[2]叢玉隆，馬駿龍，秦曉玲．當(dāng)代體液分析技術(shù)與臨床[M]．北京．中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1999：11．
篇10
原因一：平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量偏高可能是得了貧血了，如果是確診大細(xì)胞貧血的話主要就是補(bǔ)充一下維生素B12或者是維生素B12和葉酸聯(lián)合應(yīng)用，再加服維生素C，可提高療效。
原因二：出現(xiàn)這種情況也有可能是得了高血脂了， 建議患者查一下血脂，血流變，看看有沒(méi)有高血脂。
原因三：如果只有平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量偏高，其他指標(biāo)正常的話，那么一般沒(méi)有什么臨床意義，多與免疫力下降，輻射，污染，飲食，遺傳有關(guān)系。
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