PBL教學(xué)法實(shí)例講解如何發(fā)現(xiàn)引物污染

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摘要:目的驗(yàn)證以問題為基礎(chǔ)(pbl)教學(xué)法在提高學(xué)生處理聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)污染能力方面的作用。方法以PCR假陽性為實(shí)例,采用PBL教學(xué)法引導(dǎo)學(xué)員合理設(shè)立空白對(duì)照,通過重復(fù)試驗(yàn)探究污染來源。結(jié)果學(xué)員在思維引導(dǎo)幫助下逐步發(fā)現(xiàn)PCR污染來源于引物污染,并對(duì)試驗(yàn)方法及理論有了清晰的認(rèn)識(shí)。結(jié)論以實(shí)例講解為基礎(chǔ)的PBL教學(xué)法可有效提高學(xué)生認(rèn)識(shí)和處理PCR污染的能力。

關(guān)鍵詞:以問題為基礎(chǔ)教學(xué)法;實(shí)例講解;定量聚合酶鏈反應(yīng);引物污染

隨著生物科技的發(fā)展,以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為主的核酸試驗(yàn)應(yīng)用越來越廣泛[1],實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和生物安全是PCR技術(shù)初學(xué)者應(yīng)掌握的重要內(nèi)容[2]。不論是中學(xué)、大學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)生還是實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的初學(xué)者對(duì)避免核酸污染等質(zhì)量控制的意識(shí)均不強(qiáng)。由于PCR耗時(shí)較長,注意力不易集中[3],容易受核酸污染,必須設(shè)計(jì)空白對(duì)照才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果[4],但枯燥的理論講解學(xué)生不易接受,教學(xué)效果不好。以問題為基礎(chǔ)(PBL)教學(xué)法是一種基于“問題”為中心的教學(xué)模式,是目前國際上較為流行的一種教學(xué)法。案例選擇和問題設(shè)計(jì)是PBL教學(xué)法的主要切入點(diǎn),對(duì)初學(xué)者理解抽象問題非常有幫助。本文圍繞在一次PCR教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照管中有核酸污染的實(shí)例,遂把PBL教學(xué)法應(yīng)用于枯燥的對(duì)照重復(fù)試驗(yàn),理清了發(fā)現(xiàn)和判定核酸污染來源的過程,學(xué)生們反映教學(xué)效果很好,理解較為深刻。

1資料與方法

1.1學(xué)生情況及試驗(yàn)事件

小班教學(xué),學(xué)生5人,教學(xué)過程發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照管有核酸擴(kuò)增,于是采用PBL教學(xué)法[5],以實(shí)例為引導(dǎo),設(shè)計(jì)教學(xué)試驗(yàn),結(jié)合實(shí)際圖表,啟發(fā)學(xué)生分層思維,最終引導(dǎo)學(xué)生們找到污染源。

1.2一般資料

組織來源為6份液氮凍存的SD大鼠肝臟組織。大鼠來源的Yes相關(guān)蛋白(YAP)引物兩種,分別由美國Invitrogen和中國上海生工公司設(shè)計(jì)合成,均具有較好的特異性。

1.3儀器與試劑

熒光定量PCR儀為RocheLightCycle(2.0)系統(tǒng),軟件版本3.5。采用Trizol總RNA試劑提取總RNA,取材器械、凍存管及雙蒸水(ddH2O)均經(jīng)1%二乙基焦碳酸酯水處理。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR03S)及熒光定量PCR試劑盒(DRR041S)均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。

1.4方法

PBL教學(xué)法采用案例選擇、問題設(shè)計(jì)、思維導(dǎo)圖、情景教學(xué)等,以實(shí)例為線索,以學(xué)生為主導(dǎo)。

1.5試驗(yàn)技術(shù)方法

RNA提取應(yīng)用Trizol、氯仿、異丙醇提取,75%乙醇洗滌RNA沉淀。應(yīng)用凝膠電泳法(瓊脂糖)鑒定RNA未被降解,以紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品進(jìn)行純度分析和定量。反轉(zhuǎn)錄合成cD-NA按試劑盒配制反應(yīng)體系。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用LightCycler數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。直觀比較Ct值[6],Ct值越大,起始模板數(shù)越低。

2結(jié)果

2.1以實(shí)例為引導(dǎo),使學(xué)生直觀認(rèn)識(shí)什么是核酸污染

PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)“空白對(duì)照管”的反應(yīng)曲線清晰可見,說明該反應(yīng)體系內(nèi)有核酸擴(kuò)增,可推斷空白對(duì)照管反應(yīng)體系內(nèi)存在核酸污染。通過反應(yīng)曲線圖學(xué)生們對(duì)“假陽性”有了直觀認(rèn)識(shí)。

2.2問題出在哪里?

引導(dǎo)學(xué)生自問自答空白對(duì)照管中含有3種成分:ddH2O、引物及PCR試劑,其中ddH2O的配制、分裝、加樣過程操作較多,比較容易污染,而且ddH2O較引物和PCR試劑更容易獲取,應(yīng)作為首先排除對(duì)象。

2.3與學(xué)生一道設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn)

選用新的ddH2O作為對(duì)照,重復(fù)試驗(yàn),同時(shí)原ddH2O同步參與重復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)反應(yīng)條件不變,引物不變,挑選擴(kuò)增曲線較好的7號(hào)樣品作為cDNA模板,觀察在含新ddH2O的反應(yīng)體系中是否有核酸擴(kuò)增,結(jié)果見表1。通過比較PCR結(jié)束后的Ct值可比較反應(yīng)體系的起始模板核酸量,Ct值越大,核酸量越小。

2.4ddH2O污染的可能性很小

學(xué)生們一致認(rèn)為,B管和D管均無模板,但均有核酸擴(kuò)增,Ct值差別不大(即起始模板數(shù)差別不大),所以2個(gè)反應(yīng)體系均有核酸污染,且污染程度相近。因B、D這2管分別為不同的ddH2O,2次配制的ddH2O均有污染的可能性較小。特別是B、D這2管的Ct值相近,污染程度相同,故暫不考慮污染源是ddH2O。另外,學(xué)生們認(rèn)為,A管和C管有相等數(shù)量模板,ddH2O不同,因Ct值差別不大,說明起始模板數(shù)差別不大,同樣說明2次配制的ddH2O無明顯差別。因此,前、后2次ddH2O均被污染的可能性均很小,綜合分析后考慮為ddH2O以外的試劑有污染。

2.5教員思維引導(dǎo),學(xué)生制訂方案

教員提示:試驗(yàn)所用引物一般來自2家公司,每次所用引物是經(jīng)過分裝的。學(xué)生們思考后認(rèn)為,分裝引物過程存在污染的可能,如需驗(yàn)證引物污染,可以選取未開封、未分裝的原引物。另外,可選用另一家公司的引物同時(shí)做對(duì)照,發(fā)現(xiàn)原引物出廠時(shí)已被污染。進(jìn)一步重復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)條件不變,目的是驗(yàn)證原分裝引物中是否有核酸污染。見表2。Ct值很大說明起始模板的核酸量很小,Ct值為0.00,說明反應(yīng)體系內(nèi)不含核酸模板。

2.6引物

1(首次試驗(yàn)分裝后的引物)為污染源學(xué)生們逐條分析:H管含標(biāo)準(zhǔn)模板,擴(kuò)增同前,提示引物2可用。F管、G管無擴(kuò)增,說明ddH2O、PCR試劑、引物1'(新開封的引物1原裝液)及引物2(另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物)均無核酸污染。E管反應(yīng)體系未加入cDNA模板但仍有核酸擴(kuò)增,考慮引物1有污染,結(jié)合E管擴(kuò)增曲線Ct值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增的H管,說明起始模板數(shù)很小,這符合試驗(yàn)中引物加樣量較小的實(shí)際情況。全體學(xué)生一致認(rèn)為,分裝引物1內(nèi)的核酸污染是污染源,推測(cè)是引物分裝或加樣過程中污染。

3討論

在分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐中,有關(guān)PCR中核酸污染的內(nèi)容是一個(gè)難點(diǎn)。在理論層面,學(xué)生們基本掌握核酸污染方式中最重要的是氣溶膠污染[7],因此,包括PCR在內(nèi)的核酸試驗(yàn)被要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。在污染源分型上亦不難理解,常見污染類型包括:(1)標(biāo)本污染,包括收集標(biāo)本的容器污染,標(biāo)本密封不嚴(yán)造成交叉污染及核酸提取過程中吸樣槍污染。(2)PCR試劑污染[8],包括加樣槍、容器、ddH2O等溶液被PCR核酸模板污染。(3)PCR產(chǎn)物污染,有報(bào)道PCR產(chǎn)物污染離心機(jī),導(dǎo)致氣溶膠顆粒在離心機(jī)氣流作用下進(jìn)入到未蓋嚴(yán)的離心管中[9-10]。本文通過激發(fā)學(xué)生的逆向思維分析,主動(dòng)了解污染類型及污染可能來源,使孤立的試驗(yàn)方法變得系統(tǒng),使試驗(yàn)教學(xué)更生動(dòng)、高效,增強(qiáng)了學(xué)生的主動(dòng)性,提高了學(xué)習(xí)效率。教學(xué)中常常強(qiáng)調(diào)PCR污染的監(jiān)測(cè)可通過對(duì)照試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn),陰性對(duì)照尤為重要,每次PCR務(wù)必做陰性對(duì)照,包括不加模板的空白對(duì)照、不加引物的空白對(duì)照及模板和引物均不加僅有試驗(yàn)試劑的空白對(duì)照等。但學(xué)生們沒有切身感受,常有僥幸心理,為了減少試驗(yàn)步驟、節(jié)省時(shí)間會(huì)省略部分甚至全部陰性對(duì)照的配制。本研究就是沒有設(shè)置無引物的對(duì)照,所以導(dǎo)致無法在發(fā)現(xiàn)假陽性的第一時(shí)間判斷污染的來源。本教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照有DNA擴(kuò)增,污染來源不明,當(dāng)無法準(zhǔn)確判斷污染源時(shí)需進(jìn)一步設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn),以找出污染源。進(jìn)一步的試驗(yàn)仍需要設(shè)立空白對(duì)照,根據(jù)下一步試驗(yàn)結(jié)果確定或排除某類污染源,最后通過試驗(yàn)驗(yàn)證污染源。引物污染較隱蔽,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響容易被忽視,只有設(shè)立良好的空白對(duì)照,才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性和判定假陽性的來源。引物污染具有不易被發(fā)現(xiàn)的特殊性[11-12],由于擔(dān)心原裝引物內(nèi)有污染,試驗(yàn)中學(xué)生們拓展思維,應(yīng)用了2個(gè)不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,一個(gè)是新開封的引物原裝液,另一個(gè)是另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物,從2個(gè)層級(jí)搜尋污染源,最終發(fā)現(xiàn)是分裝的引物內(nèi)有核酸污染,可能是在分裝過程或使用過程中被污染。這期間,學(xué)生參與了試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,對(duì)設(shè)計(jì)過程及試驗(yàn)過程均透徹理解。教學(xué)中教員進(jìn)一步強(qiáng)調(diào),鑒于核酸污染的發(fā)生率較高,并且所導(dǎo)致的后果嚴(yán)重,PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)采取相應(yīng)的措施防范污染。一些單位參照美國PDCA[P策劃(P)、實(shí)施(D)、檢查(C)、處置(A)]質(zhì)量管理循環(huán)體系,在控制實(shí)驗(yàn)室污染方面已經(jīng)取得明顯效果[13]。另外,通過加強(qiáng)PCR分析前的質(zhì)量控制[14]、對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè),均有利于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。以上諸多措施均是避免PCR污染的有效方法,但如果不設(shè)空白對(duì)照卻無法發(fā)現(xiàn)污染源,如果空白對(duì)照不夠全面,亦無法判定污染來源?？瞻讓?duì)照的設(shè)立是PCR發(fā)現(xiàn)和判定假陽性的關(guān)鍵,是避免試驗(yàn)結(jié)果受核酸污染影響的重要手段。PBL教學(xué)法的目的是提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力,因此,設(shè)計(jì)問題要緊密結(jié)合PCR的實(shí)際,由淺入深、層層推進(jìn),讓學(xué)生能夠思路清晰、邏輯清楚地完成實(shí)驗(yàn)流程,從而解決試驗(yàn)中的問題。本文應(yīng)用PBL教學(xué)法加實(shí)例教學(xué),把復(fù)雜的PCR污染問題逐步轉(zhuǎn)化為層次分明、邏輯清楚的科學(xué)問題,突破傳統(tǒng)教學(xué)模式。在試驗(yàn)教學(xué)過程中,教師由知識(shí)的傳授者轉(zhuǎn)變?yōu)檫壿嫹治龅囊龑?dǎo)者,通過學(xué)生自主學(xué)習(xí)和理解解決疑難問題。

作者：王成 趙剛 孔亞林 蒲猛 戴競(jìng)耀 劉承利 單位：空軍特色醫(yī)學(xué)中心 肝膽外科 外科學(xué)教研室