氨氯地平對高血壓大鼠心肌重構的影響

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摘要:目的研究氨氯地平對腎性高血壓大鼠心肌重構及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/激活蛋白－1(AP－1)信號通路的影響。方法將40只腎性高血壓大鼠隨機分為模型組(n=20)與實驗組(n=20)，另選20只大鼠僅分離左腎動脈作為假手術組。實驗組大鼠灌胃10mg·kg－1·d－1氨氯地平，每天1次，模型組與假手術組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續干預10周。用超聲診斷儀檢測左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期后壁厚度(LVPWD)、舒張末期室間隔厚度(IVSD)，并計算左心室射血分數(LVEF)與短軸縮短率(LVFS);用蘇木精－伊紅(HE)染色觀察大鼠心肌組織病理學變化;用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測心肌組織血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)與心鈉素(ANP)含量;用蛋白質印跡(WB)法檢測心肌組織磷酸化p38MAPK(p－p38MAPK)、AP－1蛋白的表達水平。結果假手術組、模型組與實驗組大鼠LVEDD分別為(0.56±0.08)，(0.89±0.06)，(0.63±0.03)mm;LVESD分別為(2.01±0.09)，(3.92±0.13)，(3.06±0.11)mm;LVPWD分別為(0.13±0.01)，(0.39±0.05)，(0.22±0.04)cm;IVSD分別為(0.15±0.01)，(0.34±0.03)，(0.23±0.02)cm;LVEF分別為(74.21±2.17)%，(56.83±1.84)%，(63.43±2.39)%;LVFS分別為(47.32±2.36)%，(24.11±1.61)%，(41.06±1.18)%。與假手術組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、IVSD與心肌組織AngⅡ、ALD、ANP含量及心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白相對表達量均升高，且與模型組比較，實驗組降低;而模型組LVEF與LVFS較假手術組降低，且與模型組比較，實驗組升高(均P＜0.05)。結論氨氯地平可有效改善腎性高血壓大鼠心肌重構，進而改善心臟功能，其作用機制可能與抑制心肌組織p38MAPK/AP－1通路的信號轉導相關。

關鍵詞:腎性高血壓;氨氯地平;心肌重構;p38絲裂原活化蛋白激酶;激活

蛋白－1高血壓是慢性腎病的危險因素，其中，左心室肥厚已被公認為是心血管疾病發生的獨立危險因素［1］。目前高血壓心臟病降壓達標后持續存在的左心室重構仍是心力衰竭(HF)的高危因素［2］。氨氯地平是第3代鈣離子拮抗藥，其降壓效果及對靶器官的保護作用已得到肯定，左旋氨氯地平可有效降壓、減輕腎纖維化，對抗大鼠長期高鹽飲食介導的腎毒性損害［3］。本研究探討氨氯地平對腎性高血壓大鼠心肌重構及P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)/激活蛋白－1(AP－1)信號通路的影響。

材料與方法

1材料

動物SPF級SD雄性大鼠，體重200～220g，購自河南省實驗動物中心。動物生產許可證號:SCXK(豫)2017－0001。藥品與試劑苯磺酸氨氯地平片，規格:每片5mg，批號:ck3049，批準文號:國藥準字H10950224，杭州民生藥業集團有限公司生產。蘇木精－伊紅(HE)染色液，北京中杉金橋生物技術公司生產;兔抗鼠P38MAPK抗體，美國SantaCruz公司生產;兔抗鼠AP－1抗體，美國CellSignalingTechnology公司生產。儀器vivid7超聲診斷儀，美國GE公司產品;MutiskanGo酶標儀，美國ThermoFisher公司產品;DMLB2光學顯微鏡，德國Leica公司產品;ImageJ圖像處理系統，美國NIH公司產品。

2實驗方法

2.1模型建立［4］

3%戊巴比妥鈉(30mg·kg－1)麻醉大鼠，分離左腎動脈后放置銀夾(內徑為0.2mm)并打結;假手術組同上，但不放置銀夾。術后4周，若大鼠收縮壓≥160mmHg，提示造模成功。

2.2動物分組與給藥方法

將40只腎性高血壓大鼠隨機分為模型組(n=20)與實驗組(n=20)，另選20只大鼠僅分離左腎動脈作為假手術組。實驗組大鼠灌胃10mg·kg－1·d－1氨氯地平，每天1次，模型組與假手術組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續干預10周。

2.3用超聲診斷儀檢測心功能指標

［5］末次干預后，測量左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期后壁厚度(LVPWD)、舒張末期室間隔厚度(IVSD)，用超聲診斷儀對其行超聲心動圖檢查，并計算左心室射血分數(LVEF)和短軸縮短率(LVFS)。LVEF=［左心室舒張末容積(EDV)－左心室收縮末容積(ES)］/EDV×100%;LVFS=(LVEDD－LVESD)/LVEDD×100%。

2.4用蘇木精－伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理學變化

［6］超聲心動圖檢測后，過量麻醉法處死大鼠，解剖、采集各組大鼠心臟組織，固定后經脫水、包埋、切片(4μm)等制作心肌組織病理切片，進行HE染色，用光學顯微鏡觀察心肌組織病理學變化。

2.5用蛋白質印跡(Wb)法檢測心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白的表達水平

［7］取液氮中保存的心肌組織100mg，加入裂解液研磨均勻并充分裂解，4℃下以1.4×104r·min－1離心10min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，按常規方法進行凝膠電泳分離，轉膜、封閉;分別加入一抗，4℃孵育過夜;加入二抗。顯影后，用ImageJ圖像處理系統分析蛋白條帶灰度值，以β－actin為內參，并進行半定量分析。2.6用ELISA法檢測心肌組織血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)與心鈉素(ANP)含量［8］心肌組織采集同2.4，取心肌組織100mg研磨制備勻漿，以3000r·min－1離心15min，取上清液，用ELISA法檢測心肌組織AngⅡ，ALD和ANP含量。

3統計學處理

用SPSS21.0軟件進行統計分析。計量資料用x珋±s表示，符合正態分布且方差齊時，2組間比較Dunnett’st檢驗;反之用秩和檢驗，多組間比較用單因素方差分析。

結果

1各組大鼠心功能指標比較

與假手術組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD與IVSD均明顯升高，且實驗組低于模型組;而模型組LVEF與LVFS低于假手術組，與模型組比較，實驗組升高(均P＜0.05)，見表1。

2各組大鼠心肌組織病理學變化

假手術組大鼠心肌組織結構正常，心肌細胞形態規則;模型組大鼠心肌細胞核深染、排列紊亂，且部分心肌細胞水腫、肥大，且伴有大量炎性細胞浸潤;實驗組大鼠心肌細胞形態趨于正常，心肌組織病變較模型組明顯改善，見圖1。

3各組大鼠心肌組織AngⅡ、ALD與ANP含量比較

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織AngⅡ、ALD與ANP含量均顯著升高，而實驗組低于模型組(均P＜0.05)，見表2。

4各組大鼠心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白的表達水平

p－p38MAPK蛋白在假手術組、模型組與實驗組大鼠心肌組織中的相對表達量分別為0.20±0.07，0.94±0.06，0.36±0.10;AP－1蛋白相對表達量分別為0.31±0.12，0.98±0.02，0.42±0.11。模型組大鼠心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白相對表達量均高于假手術組，而與模型組比較，實驗組降低(均P＜0.05)，見圖2.本研究中，實驗組大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD與IVSD及心肌組織AngⅡ，ALD、ANP含量均明顯低于模型組，而LVEF與LVFS高于模型組，提示氨氯地平可有效改善腎性高血壓大鼠心肌重構，進而改善心臟功能。氨氯地平可改善糖尿病大鼠缺血誘導的骨髓EPC動員障礙、缺血區血管新生及心肌梗死后心功能［9－10］。馬香芹等［11］研究發現，替米沙坦和氨氯地平均能有效改善高血壓左心室重構，其機制可能與降低血漿和心肌組織ANP、ALD含量相關。p38－MAPK信號通路在誘導心肌細胞凋亡與心肌功能障礙過程中均發揮重要作用［12］。AP－1是調節炎性細胞因子表達的重要轉錄因子，與AP－1位點結合后可增強炎癥因子的轉錄水平，因此，其參與調控炎癥反應的發生過程［13］。本研究中，與模型組比，實驗組大鼠心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白相對表達量降低，提示氨氯地平可能通過下調心肌組織p－p38MAPK、AP－1蛋白表達，抑制p38MAPK/AP－1通路的信號轉導，從而有效改善腎性高血壓大鼠心肌重構。

作者：夏哲林 周彬 葉鑫 章欣