兔干眼癥免疫病理學(xué)研究論文

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【摘要】目的觀察安賀拉滴眼液應(yīng)用于兔干眼癥治療的免疫病理學(xué)變化,初步探討安賀拉滴眼液治療干眼癥的可能機(jī)制。方法新西蘭白兔20只,制作堿燒傷干眼模型,隨機(jī)分為對(duì)照組和安賀拉組,分別滴生理鹽水和安賀拉滴眼液。用藥4周后應(yīng)用印跡細(xì)胞學(xué)和免疫病理學(xué)方法檢測(cè)結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度、MUC5AC陽性細(xì)胞率和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密度。結(jié)果對(duì)照組結(jié)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密度高于安賀拉組,安賀拉組杯狀細(xì)胞密度和MUC5AC陽性細(xì)胞率均大于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論安賀拉滴眼液可以降低兔眼表的炎癥反應(yīng),促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖,在干眼癥治療方面具有一定的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】安賀拉滴眼液;干眼癥;兔;免疫病理學(xué)

Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedropsinrabbitsdryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopathologicprocessafteritwasused.MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburningwithalkaliinconjunctiva,andthendividedintotwogroupsrandomly:theexperimentalgrouptreatedwithketorolactromethmineeyedropsandthecontrolgrouptreatedwithsaline.Byusingimmunopathologictechniquesandimpressioncytologytest,densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatorycellinconjunctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.ResultThedensityofgobletcell,andpositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroupandlowerinthedensityofinflammatorycell(P<0.05).ConclusionKetorolactromethmineeyedropscanreduceocularsurfaceinflammationandincreasethenumberofgobletcellsinrabbits,suggestingitisvaluabletodryeye.

Keywords:ketorolactromethmine;dryeye;rabbit;immunopathology

干眼是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量及動(dòng)力學(xué)的異常,導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表面的異常,并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。干眼的主要癥狀有眼部干燥、異物感、視疲勞、畏光及視力下降等,輕者影響工作和生活,嚴(yán)重者可導(dǎo)致眼表尤其是角膜組織干燥、融解、穿孔,嚴(yán)重危害視功能[1]。干眼作為最常見眼表疾病有日趨增多的趨勢(shì),其藥物治療方法多種[2]:淚液替代療法、黏液溶解藥、局部自家血清、抗生素等。隨著干眼發(fā)病機(jī)制的深入研究,現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到由炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與幾乎所有類型干眼的病理生理過程。本研究采用新型藥物——安賀拉滴眼液作用兔干眼模型,研究其療效及可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑LeicaMEL53型眼科手術(shù)顯微鏡(瑞士WILDLEITZ公司),YZ5CSI型裂隙燈顯微鏡(蘇州醫(yī)療儀器廠),Olympus10AK照相顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)公司),低溫恒冷切片機(jī)(美國(guó)Leica公司),安賀拉滴眼液(Acular,美國(guó)Allergan公司產(chǎn)品),16mm×6mm的濾紙條,1mol/L的NaOH(廣州化學(xué)試劑廠),1%熒光素鈉溶液,1%虎紅溶液(廣西梧州制藥股份有限公司),免疫組化試劑盒和MUC5AC抗體(美國(guó)Sigma公司)。

1.2動(dòng)物選擇與分組健康成年新西蘭白兔20只,雌雄各半,體質(zhì)量2.0~2.5kg。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只,右眼為實(shí)驗(yàn)眼。購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(粵)2003-0002,粵監(jiān)證字2006A001。

1.3實(shí)驗(yàn)方法50mg/2mL鹽酸氯丙嗪+100mg/2mL氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右眼第三眼瞼,并用2張16mm×6mm的濾紙條蘸1mol/L的NaOH溶液置于距兔角膜緣上方2mm的結(jié)膜上,90s后立即用100mL生理鹽水反復(fù)沖洗結(jié)膜囊。術(shù)后對(duì)照組局部應(yīng)用生理鹽水滴眼,每日3次;實(shí)驗(yàn)眼局部應(yīng)用安賀拉滴眼液,每日3次。用藥4周后行結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查,并取病變區(qū)結(jié)膜行組織病理學(xué)檢查和免疫組化染色檢測(cè)特異性黏蛋白MUC5AC的表達(dá)。

1.3.1印跡細(xì)胞學(xué)檢查及PAS染色將孔徑為0.2μm的醋酸纖維膜剪成3mm×3mm大小,浸入蒸餾水3~4h,以消除濾紙表面活性,取出晾干高壓消毒備用。檢查前結(jié)膜囊先滴1%愛爾卡因1滴,5min后,濾紙吸去穹隆部淚液,將醋酸纖維膜的粗糙面貼于距上方角膜緣2mm的球結(jié)膜表面,輕輕加壓,3~5s之后撕下,然后于其左右相鄰的區(qū)域再各貼一張,φ=95%乙醇固定10~30min,然后依次用0.5%高碘酸氧化,過碘酸希夫染色劑(periodicacidSchiffstaining,PAS)染色,偏重亞硫酸漂洗,蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,中性樹脂封片,置于雙目光學(xué)顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞的連接,胞核胞漿的顏色,核漿比例(N/C),上皮細(xì)胞角化以及杯狀細(xì)胞密度。

1.3.2組織病理學(xué)檢查用藥4周取病變部位球結(jié)膜,生理鹽水沖洗干凈后放入10%甲醛固定液固定。流水沖洗固定組織過夜。依次進(jìn)行乙醇梯度脫水,φ=70%乙醇15s,80%、90%、95%、100%乙醇各3h。二甲苯透明3次,每次10min。從低熔點(diǎn)石蠟到高熔點(diǎn)石蠟浸蠟共3次,每次1h。將浸蠟后的組織放入包埋盒內(nèi),倒入熔化的高效切片石蠟,待凝固后取出石蠟塊。將石蠟塊安裝在切片機(jī)的組織固定架上用,調(diào)節(jié)切片厚度在4~6μm每個(gè)石蠟塊切2~3張切片。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色將組織片放入20℃溫水中展開,貼于玻片上,放入烘箱內(nèi)烘干5min,依次放入二甲苯脫蠟和95%乙醇各2次,每次1min。PBS(0.01mol/L,PH7.4)漂洗3min×3;4℃1%TrisTriton100通透5min,用PBS漂洗3min×3;加20μL即用型過氧化物酶阻斷劑于室溫下孵育10min,用PBS漂洗3min×3,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;加20μL非免疫動(dòng)物血清于室溫孵育5min,以減少非特異性背景染色;傾去血清吸去多余液體,滴加一抗(MUC5AC)于4℃孵育12h,用PBS漂洗3min×3;加20μL生物素標(biāo)記的二抗,于室溫下孵育10min,用PBS漂洗3min×3;加20μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素于室溫下孵育10min,用PBS漂洗3min×3;加新鮮配制的DAB顯色液顯色,顯微鏡下觀察結(jié)果,1~2min水洗終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染核15~30min,染色過深者用鹽酸酒精漂洗;每一批實(shí)驗(yàn)均設(shè)有陽性及空白對(duì)照,陽性對(duì)照:采用已知陽性的胃癌切片(由試劑公司提供);空白對(duì)照:以PBS代替一抗。

1.4結(jié)果判定

1.4.1印跡結(jié)膜杯狀細(xì)胞觀測(cè)分級(jí)根據(jù)NELSON’s分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)[3]:0級(jí):結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常,層次大小一致,胞漿藍(lán)綠色,N/C為1∶2,杯狀細(xì)胞密集分布;1級(jí):結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度擴(kuò)大,胞漿藍(lán)綠色,N/C為1∶3,杯狀細(xì)胞開始減少密度下降;2級(jí):所有結(jié)膜上皮細(xì)胞均擴(kuò)大,變扁平,胞漿藍(lán)綠色或粉紅色,N/C為1∶4或1∶5,輕度角化。杯狀細(xì)胞明顯減少;3級(jí):結(jié)膜上皮細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì),核固縮崩解,上皮細(xì)胞胞漿呈粉紅色,N/C為1∶6或1∶8,出現(xiàn)不同程度的角化,杯狀細(xì)胞完全喪失,視野下不見杯狀細(xì)胞。結(jié)膜杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:計(jì)算每個(gè)動(dòng)物所取3張標(biāo)本中共10個(gè)高倍鏡(400×)下杯狀細(xì)胞數(shù)目總數(shù)的平均值。

1.4.2MUC5AC陽性細(xì)胞檢測(cè)MUC5AC陽性細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒,隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100個(gè)結(jié)膜上皮細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4.3結(jié)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度判定蘇木素復(fù)染核顯示炎性細(xì)胞胞核,以每高倍視野下炎性細(xì)胞數(shù)目來判定結(jié)膜結(jié)締組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)密度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析(onewayANOVA)及均數(shù)多重比較檢驗(yàn)分析觀察期各指標(biāo)的變化及組間各指標(biāo)平均值的差異,以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

用藥4周后,對(duì)照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞為2級(jí),安賀拉組為1級(jí);對(duì)照組結(jié)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密度高于安賀拉組,杯狀細(xì)胞密度、MUC5AC陽性細(xì)胞率均小于安賀拉組(見表1,圖1,圖2)。

表1兩組結(jié)膜病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)比較(略)

Tab.1Comparisonofpathologicchangesinconjunctivabetweentwogroups

與對(duì)照組比較:*P<0.05;**P<0.01

圖1安賀拉組結(jié)膜杯狀細(xì)胞MUC5AC免疫組織化學(xué)染色(×200)(略)

Fig.1MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthegrouptreatedwithketorolactromethmine(×200)

圖2對(duì)照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞MUC5AC免疫組織化學(xué)染色(×200)(略)

Fig.2MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthecontrolgroup(×200)

3討論

干眼癥患者因杯狀細(xì)胞減少,不能不斷地產(chǎn)生和分泌黏液,使結(jié)膜囊保持的潤(rùn)滑度下降,眼瞼與眼球間活動(dòng)的摩擦力升高,淚膜的更新和穩(wěn)定下降,無法維持結(jié)膜和角膜的生理性潮濕和潤(rùn)澤,從而出現(xiàn)一系列眼部不適的癥狀和體征。長(zhǎng)期在空調(diào)開放、空氣不流通的環(huán)境里工作或經(jīng)常從事注意力集中的工作或活動(dòng),如長(zhǎng)時(shí)間使用電腦,在熒光屏前工作、閱讀的人容易引起干眼癥。

研究表明,所有類型的干眼均與炎癥有關(guān)[4]。干眼所促發(fā)的是一類非感染性、免疫相關(guān)性的炎癥反應(yīng),是在各種致炎因素的刺激下,眼局部出現(xiàn)的防疫性反應(yīng)[5]。安賀拉是一種新型非甾體抗炎藥,其通過抑制環(huán)氧化酶而阻斷花生四烯酸來抑制前列腺素的合成;穩(wěn)定肥大細(xì)胞,抑制組織胺、前列腺素等化學(xué)介質(zhì)的釋放;阻斷炎性介質(zhì)對(duì)眼部的刺激和損害,發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用。本研究應(yīng)用安賀拉滴眼液治療兔干眼模型,研究其療效及可能的作用機(jī)制。

淚膜由外至內(nèi)分為3層:脂質(zhì)層、水液層和黏蛋白層。黏蛋白層對(duì)于淚膜的形成起著至關(guān)重要的作用。黏蛋白有極強(qiáng)的親水性,它主要的功能是覆蓋角膜上皮,從而賦予了角膜的可濕潤(rùn)性。眼表的黏蛋白包括角結(jié)膜上皮分泌的跨膜蛋白MUC1、2、4,杯狀細(xì)胞上皮分泌的分泌型蛋白質(zhì)MUC5,以及由淚腺分泌的水溶型分泌性蛋白MUC7。MUC5AC是構(gòu)成淚膜黏蛋白層的最主要成份。這些黏蛋白,尤其是MUC5AC,被認(rèn)為對(duì)于促進(jìn)淚膜在眼表的分布、維持淚膜的穩(wěn)定性至關(guān)重要[6]。本研究結(jié)果顯示,用藥4周后,安賀拉組MUC5AC陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組,且其炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組。

印跡細(xì)胞學(xué)檢查是一種簡(jiǎn)便易行、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性好的眼表細(xì)胞學(xué)檢查方法,間接反映杯狀細(xì)胞的分布和數(shù)量。通過印跡細(xì)胞學(xué)檢查,用藥4周后,安賀拉組結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度擴(kuò)大,N/C為1∶3,杯狀細(xì)胞為1級(jí);而對(duì)照組結(jié)膜上皮細(xì)胞擴(kuò)大變扁平,N/C為1∶4或1∶5,輕度角化,杯狀細(xì)胞為2級(jí);安賀拉組杯狀細(xì)胞密度也大于對(duì)照組。

綜上所述,安賀拉滴眼液可減輕眼表的炎癥反應(yīng),在干眼的治療方面具有一定的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果提示安賀拉滴眼液可能對(duì)杯狀細(xì)胞有作用。但這種作用是安賀拉滴眼液本身促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖,還是因?yàn)檠劬植垦装Y反應(yīng)減輕,改善細(xì)胞外環(huán)境而使杯狀細(xì)胞增殖,有待于進(jìn)一步研究探索。

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