真菌種群分布及抗菌性研究論文

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【摘要】目的分析小連翹(HyperioumssampsoniiHance)內生真菌的分布特征和抗菌活性。方法采用內生菌分離法分離菌株,雙培養法對峙試驗測定其抗菌性。結果從小連翹的根、莖、葉等不同的器官中分離得到81株內生真菌,經形態學分類鑒定分屬于4個目,5個科,26個屬,其中頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)和絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)為優勢菌群。不同部位內生真菌的類型、數量和分布存在差異,根部有31株,分屬于12屬;莖部有12株,分屬于10屬;葉部有38株,分屬于13屬。通過平板對峙實驗發現,從小連翹所分離的內生真菌中54.32%對某些植物病原真菌有拮抗活性。結論小連翹內生真菌及其代謝產物中具有潛在活性物質,值得深入研究。

【關鍵詞】內生真菌;小連翹;拮抗活性

StudiesoncommunitiesofendophyticfungifromHyperioumssampsoniiHanceandtheirantipathogenicactivitiesinvitro

Abstract:Theendophyticfungiwereisolatedandidentifiedmorphologicallyfromtheroots,stemsandleavesofHyperioumsSampsoniiHance.Eightyonestrainsofendophyticfungiwereisolatedandbelongedto26genera,5familiesand4orders.Cephalosporiumsp.andRhizoctoniasp.werethedominantgenera.Among81strains,31strainsof12generawereisolatedinroots,12strainsof10generainstems,and38strainsof13generainleaves.Theresultsshowedthatthequantity,population,anddistributionoftheendophyticfungivariedindifferentpositionsofHyperioumsSampsoniiHance.Inthedualculturetests,53.48%ofalltheisolatedEndophyticfungishowedantagonistictosomeplantpathogens.Theseendophyticfungiinsidetheplantshaveintimatecorrelationwiththeirhosts.Theseendophyticfungiandtheirmetabolitesmightplayanimportantroleintheplantsagainstthepathogens.

Keywords:endophyticfungi;HyperioumsSampsoniiHance;antipathogenicactivities

小連翹(HyperioumssampsoniiHance),別名小翹、七層蘭、瑞香草、元寶草等,為多年生雙子葉植物藥藤黃科植物,味苦、性辛、平[1]。全草含鞣質,有光致敏作用,動物食后可產生皮炎;含小連翹堿(hypecorine)和小連翹次堿(hypecorinine);花含金絲桃素(hepericin)[2],有活血、止痛、調經、止血、消腫之效;小連翹或其提取物作為有效藥物成分用于制備治療睡眠障礙、老年癡呆、記憶力減退等病癥的藥物[3];同屬植物貫葉連翹,在西方國家稱圣約翰草,用于治療憂郁癥等疾病已有幾百年的歷史[4]。近年來的研究表明小連翹也具有抗憂郁作用[5]。文獻報道,小連翹中含有聚(異)戊二烯二苯甲酮類衍生物、萘駢雙蒽酮類和黃酮類等多種化學成分,這些成分是小連翹藥理作用的主要有效成分,但是要提取和分離這些藥物成分還有很多困難[6]。近來研究表明,某些藥用植物中個別內生真菌能夠產生與宿主相同或者相似藥理活性的成分[7],由此對藥用植物內生真菌的研究引起人們的廣泛關注。如果在小連翹內生真菌中能夠發現類似的活性物質,無疑找到了一種可替代小連翹植物的新型生物資源。但是至今未見從小連翹中分離及其內生真菌的種群多樣性的研究報道。本文對小連翹內生真菌進行了分離和分類鑒定,并對其種群多樣性及內生真菌拮抗病原菌的活性的研究報道如下。

1材料與方法

1.1材料分離所用材料為小連翹的根、莖、葉,采自中國科學院華南植物園(廣州)。采集其健康的組織,無其它病蟲害,根、莖與葉分開采集,放于密封袋中,于4℃存放,盡快進行內生真菌的分離。碘伏:威的牌消毒液,主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘(即碘伏),液體劑型,有效碘含量為0.5%,是一種新型的PVP-I消毒劑,深圳市新華鵬消毒劑有限公司生產。NS液:0.9%NaCl;ST液:0.9%NaCl,0.5%吐溫80;中和劑:0.9%NaCl,0.5%吐溫80,0.5%硫代硫酸鈉。

PDA培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL,pH7.0。在進行內生真菌的分離時,向培養基中分別加入青霉素、鏈霉素至50μg/mL。

1.2供試菌株紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)、惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)由中山大學生命科學院微生物和生化教研室提供。

1.2方法

1.2.1植物材料的處理樣品采于2005年10月。樣品用自來水沖洗干凈后,取不同部位的莖或葉若干,剪成小塊,分別放于三角瓶中;加入碘伏消毒液(使用時有效碘濃度為2500mg·L-1),不斷搖動,消毒5min。吸去消毒液,加入無菌ST液,蕩洗1min,吸去液體。重復一次。經表面消毒后的樣品可用于接種。

1.2.2內生真菌的分離、純化莖內內生真菌的接種:用無菌刀片削去莖的皮及已裸露的切面,然后切取約2~5mm的切片若干,先置于無菌平皿中。再將樣品置于無菌研缽中,加入石英砂和1mLST液,將樣品研成漿。取適量的漿液涂布于PDA平板。為了保證樣品有足夠的代表性,每個樣品要用若干段莖,一段莖僅涂一個平板,共需涂5~10個平板。根葉樣品的處理基本同莖。將涂布好的平板置于28℃培養,每隔12h觀察真菌菌落形成情況。培養基中一出現菌落,立即將此處的小塊瓊脂挖出,將平板再放回28℃培養10d,計數各平板上的菌落總數。挖出的含真菌的小塊PDA立即置于含PDA的小試管中培養,待真菌長出后,再在PDA平板上采用菌絲頂端純化法逐步純化。待菌落出現后,根據菌落形態、顏色的差異以及長出時間的不同,分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進行分離培養。在培養數日后,觀察菌落的形態及其菌落邊緣的整齊情況,并做相應的記錄,包括影象記錄,對菌株編號后,轉至PDA斜面培養基上,于28℃培養箱中培養5~7d,然后放入4℃冰箱保存。

1.2.3表面消毒效果檢測表面消毒后的樣品于5mL無菌水中振蕩1min,取0.3mL懸液涂布于PDA平板上,在28℃培養,記錄是否有真菌生長。另外,采用存活試驗觀察表面消毒效果,即將分離的內生真菌菌苔經過各自表面消毒程序處理后,再接種到PDA平板28℃培養后,觀察是否生長。

1.2.4菌種鑒定從純化培養數日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成玻片,置于光學顯微鏡下觀察菌絲形態、孢子梗形態、孢子形態以及孢子與營養體之間的著生關系,對照有關資料確定真菌的分類學地位[8]。

1.2.5對峙試驗將4種植物病原菌(紋枯病菌、稻瘟病菌、白葉枯病菌、惡苗病菌)接種于平板中央,內生真菌接種于平板邊緣,28℃培養,觀察病原菌菌落周圍的變化。

2結果

2.1表面消毒效果表面消毒后的樣品振蕩液0.3mL分別涂布于PDA平板培養基上,28℃培養2周后無菌落長出,同時10株分離的代表性真菌菌苔分別經過消毒過程處理后接種到PDA平板上,28℃培養2周后,沒有觀察到菌落生長。表明經過樣品消毒處理過程,樣品表面附生菌的影響已消除,分離的菌株來自于樣品內部,與植物組織結合緊密。

2.2小連翹內生真菌種群組成從植物小連翹分離獲得內生真菌共81株。經顯微形態觀察鑒定為4個目,5個科,26個屬(見表1)。從表1可以看出,植物小連翹內生真菌中,從目的分類水平上以叢梗孢目(Moniliales)和無孢菌群(Myceliasterilia)為優勢菌群,分別為50株和23株占總菌株數的61.7%和28.4%;在屬的分類水平上以頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)和絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)為優勢菌群,分別為20株和16株,占總菌數的24.7%和19.7%。

2.3植物小連翹不同部位內生真菌的分布對小連翹根莖葉內生真菌的種類,數目和分布部位進行統計分析,結果見表2。

表1小連翹植物內生真菌種群組成(略)

Tab.1ThecomposingofendophyticfungiinHyperioumssampsoniiHance

從表2中看出,從小連翹植株內分離的81株內生真菌的分布各有特點,根部分布有31株內生真菌(占總數的38.2%),隸屬于12個屬(占26個屬的46.2%);莖部分布有12株內生真菌(占總數的14.9%),分屬于10個屬(占26個屬的38.5%);從葉部分離出的38株內生真菌(占總數的469%),分屬于13個屬(占26個屬的50%)。由此可知,小連翹的內生真菌主要存在于植株的葉和根中,莖部組織中分離到的內生真菌相對較少。從根莖葉中分離到的內生真菌的種屬分布來看,頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)在葉部、根部和莖部都有分布,說明頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)不僅是葉部的優勢種群,而且也是整株小連翹植物內生真菌的優勢種群。絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)僅在根部分布,是根部的優勢種群,占根部所有分離到的內生真菌的51%。另外,短梗霉屬(Aureobasidiumsp.)、鞘孢霉屬(Chalarasp.)、束絲菌屬(Ozoniumsp.)也只在根部分布;而串珠孢霉屬(Moniliasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)、粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)、痕格霉屬(Sirosporiumsp.)、彎孢霉屬(Curvulariasp.)、毛殼菌屬(Chaetoniumsp.)和直毛殼菌屬(Ascotrichasp.)的內生真菌只在葉部分布,而葉組織內生真菌的優勢種也和根部不同,頭孢霉屬和痕格霉屬內生真菌是葉部的優勢菌群;從莖部分離的內生真菌的優勢菌群不明顯,其中分離到的木霉屬(Trichodermasp.)、黑孢霉屬(Nigrosporasp.)、芽枝霉屬(Cladosporiumsp.)內生真菌只在莖部分布。結果表明,小連翹根莖葉組織的不同部位所分離到的內生真菌的數量不同,所分離到內生真菌的分布和優勢種群也存有差異。

表2小連翹植物內生真菌數量與分布(略)

Tab.2ThenumberanddistributionofendophyticfungispeciesinHyperioumssampsoniiHance

2.4內生真菌對植物病原菌的拮抗作用通過平板對峙試驗分別對從小連翹中所分離的81株菌對植物病原菌紋枯病菌(立枯絲核菌)(Rhizoctoniasolani)、白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)、惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)的抑菌活性進行測定(圖1)。結果發現,從小連翹中分離的81株內生真菌中共有53株對一種或多種病原菌有拮抗作用(占總分離株數的52.48%)。其中對惡苗病菌有抑菌作用的有23株,對白葉枯病菌有抑菌作用的18株,對紋枯病菌有抑菌作用的有12株,對棉花枯萎病菌有抑菌作用的有4株。這表明多數小連翹內生真菌具有抗植物病原菌的功能,在小連翹中存在著廣泛的抗菌生物活性資源。

A.內生真菌J-53拮抗紋枯病菌;B.內生真菌f-55和f-166拮抗惡苗病

Dualculturebetweenendophytesandpathogens

3討論

從近年來的研究看,植物體中存在內生真菌是普遍的。內生菌系統地分布于植物體根、莖、葉、花、果實和種子等器官、組織的細胞或細胞間隙。有報道說,內生真菌菌絲在宿主植物的葉鞘和種子中含量最多,而葉片和根中含量極少[9]。但是也有報道,根和葉內生真菌含量較多[10]。不同的植物可能具有的內生真菌的種類和數目相差很大。我們從中藥植物小連翹的根、莖、葉共分離出81株內生真菌,分屬于4個目,5個科,26個屬。頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)在小連翹根、莖、葉內生真菌的分離過程中都得到,它既是葉內的優勢菌群也是整個植物的優勢菌群;絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)分離獲得的數量比較多,但是它僅僅是根內的優勢菌群。植物內生真菌生活在活體植物組織中,其生長代謝受多方面因素制約,不僅受到宿主植物的影響,外界環境因子也是其重要影響因素。外界環境變化直接影響植物生長代謝,間接影響到植物內生菌生物多樣性與生長代謝。從小連翹的根、莖、葉不同部位分離的內生真菌在數量、種類有很大的差異。小連翹的大部分內生真菌主要存在于葉和根部,而莖中相對很少,這表明不同的內生菌在植物不同器官和組織中占據不同的生態位。其原因可能是由于不同部位的微環境如通氣狀況、生物酶和其他化學成分的不同,從而適合不同種屬的內生真菌類群的侵入和生長。迄今的研究表明,植物內生菌與宿主發生聯系時,對宿主有以下影響:可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力[11]、抗逆抗蟲[12]、具有除草劑活性[13]等。內生真菌對宿主的作用機制可能是由于內生菌在植物體內繁殖和生長,并產生豐富多樣具有生物活性的次生代謝產物,從而在一定程度上調節植物的生長和代謝。通過對峙試驗研究小連翹內生真菌對紋枯病菌、白葉枯病菌、惡苗病菌和棉花枯萎病菌等植物病原菌的拮抗性,結果發現,小連翹內生真菌中多數種類(約52.48%)能夠抑制一種或者多種病原菌的生長,這表明小連翹內生真菌中存在著廣泛的抗菌生物活性資源,這些內生真菌及其代謝產物在植物對抗病原菌的過程中占有一定的地位。由此可見,藥用植物內存在著廣泛的內生真菌,這些內生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物因子,在生態農業和生物農藥研制方面具有重要的用途。研究內生真菌的各種次生代謝產物及其作用機制,在農業和(或)醫藥業中具有重要的應用潛力。研究和開發植物內生真菌,從而為尋找植物病害的抗菌藥用資源提供了一條新的途徑。

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