血管生成素探究

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1Ang1和Ang2的結構與生物學功能

1.1Ang1和Ang2的結構Ang1基因在1996年由Davis等[3]首次克隆出來。人Ang1基因定位于第8號染色體長臂上（8q22.3～q23），其基因開放的閱讀框為1497bp，編碼498個氨基酸。Ang1是一種糖蛋白，相對分子質量約75000。Ang2基因由Maisonpierre等[4]在1997年從人和小鼠的cDNA文庫內首先克隆出來。人Ang2基因定位于第8號染色體短臂上（8q23.1），其基因開放的閱讀框為1491bp，編碼496個氨基酸。Ang1，Ang2的蛋白結構基本相同，均有信號肽、N端卷曲螺旋結構域（coiledcoildomain，CC）和C端類纖維蛋白原結構域（fibrinogenlikedomain，FL）。其主要的結構特點有：（1）Ang1、Ang2的N端信號肽分別由10和20個疏水氨基酸組成，與血管生成素分泌到細胞外有關。（2）卷曲螺旋結構域分別由180和200個左右氨基酸構成，該斷氨基酸序列折疊彎曲，形成卷曲螺旋四級結構，這一結構可能與血管生成素和其他蛋白形成多聚體有關。（3）類纖維蛋白原結構域具有高度保守性，與血管生成素的生物學功能密切相關。改變該區域的氨基酸序列，血管生成素的功能也發生相應的改變；敲除血管生成素其他區域的氨基酸序列，保留該結構則其功能沒有明顯改變[34]。CC和FL結構域之間的連接肽是Ang1與細胞外基質（extracellularmatrix,ECM）連接的結構域[5]。Ang2和Ang1的主要區別在于CC與FL的交界處前者比后者少1個半胱氨酸，導致了其生物學功能的截然不同。

1.2Ang1和Ang2的生物學功能Ang1和Ang2是Tie2（tyrosinekinasewithimmunoglobulinandepidermalgrowthfactorhomologydomain2）的天然配體。Ang1主要由血管旁支持細胞包括周細胞（pericyte）、血管平滑肌細胞和腫瘤細胞等合成，通過旁分泌作用，與附近內皮細胞膜上的Tie2受體特異性結合，引起其受體磷酸化和隨后的信號傳遞。迄今對調控其表達的因素知之甚少。Ang1的主要生物學功能有：(1)抑制內皮細胞凋亡、促進內皮細胞生存，減少血管的萎縮和退化。與血管內皮生長因子（VEGF）不同，Ang1不是細胞有絲分裂原，不能促進血管內皮細胞增殖和內皮細胞相互聚合形成血管，而是通過激活絲氨酸蘇氨酸蛋白酶AKT，穩定細胞活力，抑制凋亡。(2)促進內皮細胞出芽，遷移，趨化。(3)穩定血管，防止滲漏[3,6]。Ang2主要由血管內皮細胞合成，通過自分泌作用，與自身細胞膜上的Tie2受體特異性結合，但不引起受體磷酸化和隨后的信號傳遞。因此Ang2的主要功能是競爭性抑制Ang1形成不穩定的血管。缺氧、VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等因素可促進Ang2表達增高[7]。

2Ang1和Ang2與腫瘤的血管生成

Ang在腫瘤血管生成中發揮了重要作用，在很多多血管性的實體腫瘤中得到了證實，如在人胃癌、肝癌、乳腺癌和膠質細胞瘤等均可見到有Ang1和Ang2及其受體Tie2表達增加，特別是在腫瘤邊緣的血管新生區。由此可見，Ang1、Ang2參與腫瘤的血管生成，但目前其具體的機制尚不完全清楚。Ang2與腫瘤血管生成關系密切，可促進腫瘤細胞及腫瘤血管的生長；但Ang1和腫瘤血管生成的關系尚有爭議。

2.1Ang1與腫瘤血管生成

2.1.1Ang1在腫瘤中的表達及其對腫瘤生長的作用有研究表明，Ang1可促進腫瘤血管生長。Torimura等[8]用雙重免疫熒光染色和RealtimePCR檢測Ang1及其受體Tie2在不同肝癌細胞系和59例肝癌組織中的表達情況，發現Ang1在體外培養的肝癌細胞和肝癌組織中均較對照組表達升高，但與腫瘤的分化程度無相關性；其受體Tie2表達于內皮細胞、肝星狀細胞和平滑肌細胞，說明Ang1在肝癌的血管生成中起了重要作用。Wang等[910]用免疫組化、RTPCR和WesternBlot檢測53例胃癌組織和23例正常胃粘膜中Ang1的表達，結果顯示有66％的胃癌組織中Ang1明顯升高且與胃癌細胞株的分化程度有相關性。他們構建正、反義Ang1載體并將其轉染至胃癌細胞SGC7901，裸鼠成瘤試驗發現轉染正義Ang1組腫瘤生長及血管生長較對照組明顯增加，而反義轉染組腫瘤生長緩慢，血管生長減少。Stratmann等[11]將內皮細胞與膠質瘤細胞共同培養于基質膠（matrigel）中，可檢測到Ang1的表達，并觀察到內皮細胞遷移，形成相互吻合的血管網，血管成條索狀；反之，當去除膠質瘤細胞時，未能檢測到Ang1的表達，而內皮細胞堆積成團，血管延伸異常。推測腫瘤細胞可分泌Ang1，使內皮細胞遷移、趨化，從而促進腫瘤血管生成。Zadeh等[12]將Ang1轉染至惡性膠質細胞瘤，建立皮下和顱內動物模型，并用四環素控制Ang1的表達水平，發現Ang1可促進膠質瘤形成“絲球體”（glomeruloidbodies:microvascularproliferationandformationofvascularentities）,且有明顯的劑量依賴性；而當阻斷Ang1/Tie2作用后，“絲球體”形成也被阻斷，由此推測Ang1是膠質細胞瘤病理性血管形成的關鍵調節分子。上述體、內外試驗及臨床研究均提示Ang1可促進腫瘤的血管生成。而與前述結論相反，也有少數人的研究結果認為Ang1抑制腫瘤血管生成。Tian等[13]用RTPCR檢測乳腺癌細胞MCF7及組織中Ang1的表達時發現，Ang1在體外培養的癌細胞中大量表達，但在組織中的表達率僅為體外培養癌細胞的1/7。在乳腺癌的異種種植瘤動物模型中，Ang1過表達時，腫瘤邊緣血管被大量的間充質細胞、周細胞所包繞，血管的擴張及出芽受限，癌細胞增殖減少，凋亡增加，腫瘤生長遲滯。Stoeltzing等[14]用重組Ang1轉染人肝癌、結腸癌細胞并種植到裸鼠身上，發現轉染Ang1的HT29種植瘤比轉染空載體組的體積小，血管密度低，腫瘤細胞增殖程度低，血管周細胞包繞程度高，血管滲透性低。推測Ang1可通過抵抗血管滲漏，抑制血管新生，維持血管穩定，有阻止腫瘤轉移的潛能。

2.1.2Ang1在腫瘤血管生成中的可能作用機制盡管目前就Ang1在腫瘤生成中的作用尚未形成一致觀點，但其參與腫瘤血管生成已是一個不爭的事實。認為Ang1可促進腫瘤血管生成主要有如下幾方面的可能機制。（1）抑制內皮細胞凋亡。Ang1抗內皮細胞凋亡作用是一系列復雜的生化反應通路。其中由磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase,PI3K）的信號傳導在抗凋亡中起到重要作用。Ang1與Tie2受體結合后，能夠引起與受體相連的PI3K的亞基P85磷酸化從而激活PI3K。隨后活化的PI3K作用磷酸肌醇脂，提高細胞內1、4、5三磷酸肌醇和3、4、5三磷酸肌醇的含量，兩者正性調節絲氨酸/蘇氨酸激酶。蘇氨酸結合磷脂酰肌醇后被磷酸化，磷酸化位點在激活環Thr308和羧基端Ser473，其中Ser473位點是依賴PI3K磷酸化的。Ang1作用后survivin表達升高，可通過抑制caspase7、caspase9磷酸化或Bad等途徑抗凋亡[15]。（2）介導血管內皮細胞與血管旁細胞間的相互作用。Ang1是一種分泌性的蛋白分子，當腫瘤細胞受到各種因素作用后可分泌Ang1，Ang1可促進胞漿素及金屬基質蛋白酶2（matrixmetalloproteinases,MMP2）的分泌，促進基底膜的降解，從而使內皮細胞遷移并促進與血管旁細胞間的相互作用[15]。（3）抑制腫瘤細胞凋亡。有實驗發現轉染Ang1基因的腫瘤細胞凋亡指數降低，但目前具體機制不清楚。而認為Ang1抑制腫瘤血管生成的主要機制是過高的Ang1使血管周細胞包繞程度高，減少了血管滲漏，形成穩定的血管，從而抑制了腫瘤的生長。由此可見，在腫瘤發展過程中，Ang1形成的穩定血管可以促進腫瘤血管生成，也可以抑制腫瘤生長，可能受到其他一些因子的調節[16]。

2.2Ang2與腫瘤血管生成

2.2.1Ang2在腫瘤中的表達及其對腫瘤生長的作用Ang2參與多種腫瘤的血管生成，且與腫瘤血管形成的數目、腫瘤的臨床分期及預后關系密切。Ahmad等[17]應用Ang2cDNA轉染人結腸癌細胞HT29建立小鼠荷瘤模型，發現Ang2轉染組的腫瘤體積明顯變大，腫瘤組織內血管密度明顯增高，腫瘤細胞的增殖指數高；而Ang1轉染組腫瘤的生長、血管密度均較對照組低，推測Ang2可能通過拮抗Ang1促進血管新生，從而加速腫瘤的生長。Etoh等[18]對胃癌病例的研究也發現，組織中Ang2高表達同時伴有血管密度增高、成熟度下降，患者臨床TNM分期晚,術后生存率低。用Ang2轉染的胃癌細胞接種裸鼠，結果發現腫瘤轉移率增高，且轉染的胃癌細胞在體外VEGF存在的條件下，能促進人臍靜脈內皮細胞分泌更多的金屬基質蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）和尿激酶等蛋白水解酶，這可能與Ang2促進腫瘤生長、轉移有關。

2.2.2Ang2在腫瘤血管生成中的可能作用機制Ang2在早期可促進血管退化。在腫瘤形成早期，腫瘤細胞與宿主共擇（cooption）并形成一個血供較好的血管區，但這些血管并不隨腫瘤的生長而生長，卻發生了退化，同時伴有Ang2表達增多。其可能的原因是腫瘤組織和健康組織為同一血供，由于腫瘤組織生長快、代謝高，較正常組織有優勢，此時機體就自分泌Ang2進行“自殺性防御”，破壞被腫瘤組織占據的血管，阻止腫瘤的進一步生長。這期間VEGF的表達不增高，腫瘤組織表現為血管退化、腫瘤細胞凋亡。隨后，邊緣殘存的腫瘤在缺氧的刺激下，產生大量的VEGF[19]。Ang2參與血管形成的啟動階段和激發階段。Ang2開始通過拮抗Ang1破壞腫瘤血管，消除血管基底膜和血管旁細胞對血管形成的限制，并激活了內皮細胞；然后，在殘余腫瘤細胞受到缺氧等刺激大量分泌VEGF的情況下，活化的內皮細胞對VEGF的作用極為敏感，迅速發生增殖、侵襲、遷徙，新生血管芽生。但由于Ang2的持續高表達拮抗了Ang1穩定血管的作用，所以新生的腫瘤血管管壁不完整，滲透性高。在腫瘤的生長過程中，發生了原宿主成熟血管的退化和腫瘤新生血管形成的雙向效應，同時伴有Ang2的持續性增高和VEGF遲發性增高。另外，Ang2可通過細胞整合素激活FAK(focaladhesionkinase)、p130Cas和JNK(cjunNH2terminalkinase)，促進MMP2的表達與分泌，引起內皮細胞的遷移，促進腫瘤新生血管的形成，引起腫瘤的生長與轉移[20]。

3有待進一步解決的問題

Ang1和Ang2均參與腫瘤的血管生成。Ang1在腫瘤血管生成的作用尚未達成一致的意見，Ang1是促進還是抑制腫瘤的血管生成？Ang1受哪些因素或細胞因子的調節？是否在腫瘤形成的不同階段Ang1發揮了不同的作用？有哪些調控機制？Ang2主要是由血管內皮細胞產生，部分腫瘤細胞也能分泌Ang2，那么，這些表達Ang2的內皮細胞和腫瘤細胞是否存在某種自分泌調節機制？Ang2對淋巴管的作用機制是什么？這些問題都有待于進一步研究。相信隨著對Ang信號轉導、基因表達調控等方面進一步深入的研究，有望為腫瘤的臨床治療提供一種新途徑。

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