EGCG生物利用度應用技術研究

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摘要:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)是茶葉中特有的兒茶素類物質。EGCG特殊的化學結構使其同時具有強抗氧化活性和低生物利用度特征，深度應用受到限制。近年來，隨著結構修飾及遞送體制備技術等新方法的發展，不僅提高了經改良的EGCG的穩定性、脂溶性和生物利用度，而且還保留了其原有的抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖及免疫調節等活性，但也存在一定的問題，有待進一步研究。

關鍵詞:EGCG;穩定性;生物利用度;結構修飾;遞送體制

備茶，作為一種天然飲料，因其獨特的風味和保健功效，深受世界人民的喜愛。［1，2］茶葉中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為主的兒茶素類物質是茶葉的主要功能成分，在預防心血管疾病、抗輻射、防癌抗癌、抗菌殺菌和抗氧化方面發揮重要作用。［3］EGCG是2－連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，具有酚類抗氧化劑的共性。因結構中有6個鄰位酚羥基(圖1)，EGCG在許多性質上優于其他兒茶素。雖然EGCG已被廣泛應用于食品、醫藥和日用化工領域，但在實際應用中仍存在一定的局限性。LAIPNSKI等［4］提出生物利用度低的化合物具有以下的化學結構特征:(1)化合物的相對分子質量＞500，CLogP＞5;(2)化合物中的－OH或－NH數量≥5;(3)化合物中可形成氫鍵的N基或O基數≥10。如表1所示，EGCG的3項指標均高于其他兒茶素類物質，如表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，所以其生物利用度低于EGC和EC。［4］特殊化學結構還使得EGCG遇到光照、高溫、堿性等外界環境因素易發生氧化聚合反應;生物體內的pH、酶等生理環境因素會影響其穩定性。［5］另外，EGCG在生物體內的吸收率極低，體內90%以上的EGCG會通過糞便或尿液排出體外。［6］由此可見，EGCG的化學性質以及在生物體內的穩定性，均對其生物利用度造成影響，使其無法在人體發揮更好的作用。［7，8］目前，主要采用結構修飾的方法和遞送體制備工藝改善EGCG的脂溶性和穩定性，從而提高EGCG進入人體后的生物活性和可利用度。

1結構修飾方法

結構修飾方法包括化學結構修飾和微生物轉化修飾。化學結構修飾法是對EGCG的8個酚羥基進行修飾，使其全部或部分發生甲基化、酰基化或糖苷化;微生物轉化修飾是一種生化反應，主要是利用微生物代謝過程中產生的酶對EGCG進行結構修飾。［9－12］經修飾的EGCG衍生物比EGCG有更好的穩定性和生物利用度。［13］1.1甲基化修飾法。甲基化修飾是將EGCG部分或全部的酚羥基轉化成甲基醚的分子修飾方法。SAIJO［14］首次從茶樹鮮葉中分離出EGCG3″Me，但是它在茶樹中的含量少且分離困難。因此，科研工作者利用化學合成法將EGCG苯環上的酚羥基進行甲基化修飾，從而提高EGCG的穩定性。MENG等［9］以CH3I為溶劑與EGCG一同加入丙酮溶液中，在碳酸鉀的催化下，水浴超聲3h合成得到3種甲基化的EGCG衍生物。呂海鵬團隊［15］用同樣的方法合成了5種甲基化的EGCG衍生物，并發現EGCG的4'位最易被甲基化。研究表明EGCG的羥基被更穩定的甲氧基取代后，其穩定性及脂溶性得到提升，進而提高衍生物的生物利用度并改善生物活性。［13］甲基化的EGCG在抗過敏、消炎等方面表現出比EGCG更強的藥理作用。最近還發現EGCG3″Me和EGCG4″Me具有抗氧化、保護肝細胞、降血壓等功能。［16］此外，EGCG″Me的口服吸收率要比EGCG高9倍，而且它在動物血液中的穩定性明顯高于EGCG。［16］甲基化修飾的缺點是試劑多為劇毒化學物質，在化學反應過程中產生較多的副產物，增加了分離和純化的難度。1.2酰基化修飾法。酰基化修飾是將長鏈或短鏈脂肪鏈選擇性地接在EGCG分子的8個酚羥基上形成酯鍵的修飾方法。該法主要以酸酐和酰氯為酰基供體，用N，N－二甲氨基吡啶(DMAP)或吡啶為催化劑，得到一系列酰化衍生物。LAM等［10］用酰基修飾方法得到了8個全乙酰化的EGCG，酚羥基被酰基保護的EGCG的穩定性比EGCG提高6倍，抑制蛋白酶體和誘導MCF7乳腺癌細胞凋亡的生物活性也隨之增強。杜亞俊［17］證實經乙酰化修飾后，EGCG的穩定性、脂溶性和生物利用度都大幅提高。另外，全乙酰化EGCG在HeLa細胞中表現出的抗癌活性高于EGCG，并且與阿霉素聯用還可以明顯提高阿霉素對癌細胞的抑制作用。［18］但是酰基化修飾存在的缺點也是不容忽視的。合成線路單一和酰化位點不確定導致難以實現定點修飾;合成的EGCG衍生物的酰化程度不一致，增加了后期分離純化的難度;酰基化修飾造成EGCG酚羥基數目的減少，對其生物活性和生物利用度均有影響;有毒溶劑的添加也限制了EGCG在藥品和食品領域的應用。1.3糖苷化修飾。糖苷修飾是將親水性的單糖分子選擇性地接到EGCG分子上的修飾方法，以此提高EGCG的水溶性及其在人體內的代謝活性。EGCG經糖苷化修飾后，其水溶性提高了50～100倍，葡萄糖苷元的甜味可減輕EGCG的澀味，其抗氧化能力未受影響并提升了穩定性，表現出更強的清除細胞質內的自由基的能力。［19］MOON等［11］用酶的糖苷化修飾方法在C－4＇位和C－7位引入α－D－吡喃葡萄糖基，分離純化后得到3種微生物產物，紫外線照射實驗發現糖苷化的EGCG具有比EGCG更強的抗褐變能力，穩定性和生物利用度明顯改善。張盼［20］采用化學合成法，即Click反應所合成的糖苷化的EGCG衍生物表現出更好的穩定性和抗腫瘤活性。化學合成法成本較低，在糖苷化EGCG的工業化生產中應用較多，但化學合成法合成路線復雜，對反應條件比較苛刻。相比而言，酶法溫和，反應過程高效，而且底物專一，反應路線也較為簡單，但酶法合成成本過高，不利于工業化生產。1.4微生物轉化修飾法。微生物轉化修飾是一種生化反應。主要是利用微生物代謝過程中的某一種或一系列酶對EGCG進行結構修飾。其原理是:在腸道微生物的作用下EGCG可發生水解、環裂解、脫羥基或內酯化等酶促反應，最終降解轉化成EGC、三羥基苯－異丙醇、戊酸類化合物、γ－丙戊內酯等一系列小分子酚酸代謝產物。［12］目前，人腸道細菌、鼠腸道菌群、乳酸菌及各種真菌是EGCG進行轉化的主要微生物媒介。真菌或乳酸菌可水解EGCG生成EGC和GA，［21］并且真菌黑曲霉和煙曲霉可將EGCG轉化為EGC等兒茶素類氧化物，［22］而EGC可進一步轉化產生其他衍生物或代謝產物。其中，EGC不僅具有更高的生物利用度，而且還保留了EGCG原有的抗氧化、抗腫瘤和免疫調節活性。［12］已證實經微生物轉化修飾的EGCG可明顯提高其在小鼠體內的吸收率、生物可利用率和抗氧化能力。［23］由此可見，微生物轉化修飾有特異性強、周期短和反應條件溫和的優點。［24］更重要的是在加工過程中由于不添加有害物質，相比化學結構修飾，此方法更加綠色、環保和無污染。

2遞送體制備技術

以蛋白質納米顆粒、多糖納米顆粒、金屬或非金屬納米顆粒、脂質體或水凝膠作為遞送體包載藥物，能防止EGCG發生異構和氧化反應，提高其緩釋性和穩定性，并且實現了靶向輸送，從而擴展EGCG的應用范圍。［25］2.1以蛋白質或多糖為載體的EGCG納米顆粒制備。蛋白質和多糖由于良好的生物相容性和可生物降解的特征，被視為遞送生物活性成分的良好壁材。多糖載體多以殼聚糖、果膠、透明質酸等為壁材。LIU等［26］以殼聚糖所制備的EGCG－CS納米顆粒顯著提升了EGCG抑制乳腺癌細胞增殖的能力。但是多糖的多孔性、包埋率低和加芯材，影響EGCG－CS納米顆粒在腸道中的穩定性。牛血清白蛋白、酪蛋白、乳鐵蛋白、β－乳球蛋白以及玉米醇溶蛋白(zein)是較為常用的載體蛋白。DONSI等［27］運用反溶劑法所制備的EGCG－zein納米顆粒不僅增強穩定性，還顯著提升表面抗氧化活性和生物可利用率。酪蛋白封裝后的EGCG在結腸癌細胞中仍具有抗惡性細胞增生的活性。［28］相較游離的EGCG，由β－乳球蛋白(pH6.5)和EGCG生成的共組裝納米顆粒對人體惡性黑色素瘤細胞的抑制活性增強了近70%，同時對食管癌細胞增殖的抑制活性也提升了63.7%，更重要的是該納米顆粒對正常人結腸細胞和小鼠非腫瘤細胞的生長均沒有明顯的抑制作用，說明該納米顆粒可有效提高EGCG的抗癌活性，且對正常細胞幾乎沒有不良反應。［29］2.2以金屬或非金屬為載體的EGCG納米顆粒制備。納米金粒子是研究最多的一種金屬納米粒子，由于具有體積小、穿透性強、靶向性高及良好的生物相容性的特點，為心血管疾病和癌癥的臨床治療提供了新的思路。［30，31］KHOOBCHANDANI等［31］制成的EGCG交聯金納米顆粒可用來替代藥物涂層支架，為心血管疾病的治療提供了新的方法。而納米金粒子與EGCG結合治療癌癥的效果也明顯。另外，以非金屬硒為載體制備EGCG納米硒顆粒，能有效抑制H22肝癌細胞的增殖，從而彌補了藥理劑量的EGCG不能抑制H22癌細胞增殖的不足。［32］SAMUTPRASERT等［33］制備的EGCG－ZnO共晶納米顆粒，既可以使EGCG的穩定性得到改善，并且促進癌細胞對鋅元素的吸收和積累，以起到與EGCG協同抵抗肝癌、胰腺癌以及前列腺癌的效果。營養學家認為多種微量礦物質在人體內起著重要的作用，但是過量使用任何一種微量礦物質都是有害的。因此，金屬納米顆粒的制備應嚴格控制劑量。2.3以脂質為載體的EGCG納米顆粒制備。EGCG由于脂溶性較差，致使在細胞中的滲透性較差，且吸收率較低，導致其在臨床治療中的口服利用率很低。脂質體是磷脂雙分子層分散在水中自然形成的多層囊泡，這種結構特性使得親脂性和親水性藥物得以包封。因此，采用脂質體包裹可顯著提高EGCG的生物利用度。多項研究證實EGCG脂質體比單體EGCG具有更好的貯存穩定性、包埋性和緩釋性，其抗癌活性也比單體EGCG更高，在食品和制藥領域廣泛應用。然而，脂質體在消化過程中，易受弱酸環境和消化酶的破壞，導致被載物泄露。因此，脂質體作為EGCG的遞送載體仍需要深入研究。2.4以水凝膠為載體的EGCG納米顆粒制備。D－葡糖糖醛酸和N－乙酰葡糖胺雙糖組成的酸性黏多糖，是一種透明質酸，是目前使用最多的水凝膠載體，這種載體具有吸水性強、質地柔軟、低免疫原性和可生物降解性等特點。［34］LEE等［35］研究發現經由透明質酸交聯而形成的水凝膠，可顯著提高EGCG的生物穩定性。JIANG等［36］發現，相較于游離的EGCG，透明質酸－EGCG有更強地抑制淀粉樣β凝蛋白聚集的作用，從而推遲阿爾茨海默病的發病年齡。水凝膠制備技術成熟且方法多樣，且可延長食品貯藏和保存期限，已被廣泛應用于食品工業;其不足在于水凝膠在高溫下容易分解，且生產成本也比較高。

3總結

綜上所述，經酚基化修飾后，雖然EGCG的脂溶性和穩定性都有所提高，但是EGCG衍生物的羥基數目的減少使其生物活性也有所降低。另外，有毒化學試劑的使用限制了其在食品和藥品領域的應用;而酶法又因成本過高，也不適合工業化生產。相比之下，微生物轉化修飾的EGCG不僅提高了生物利用度，還保留了EGCG原有的抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等活性，更重要的是方法上更加綠色環保。然而，大多數微生物的代謝途徑和催化酶系的相關研究尚不明晰，對代謝產物的生物活性也知之甚少。EGCG遞送體制備技術完整地保留EGCG的8個活性酚羥基，為增強EGCG的穩定性、緩釋性和靶向性提供了新的思路。隨著新技術的發現，EGCG會具有良好的應用前景。

作者:許麗遐 單位:石家莊職業技術學院管理系