人腹膜間皮細胞研究論文

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【摘要】目的：建立簡便有效的人腹膜間皮細胞（HPMC）的體外培養(yǎng)方法。方法：用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化人大網(wǎng)膜組織，細胞懸液經(jīng)100目篩網(wǎng)濾過后進行培養(yǎng)。用形態(tài)學、免疫組化（SP法）鑒定細胞。結(jié)果：分離培養(yǎng)的細胞光鏡下呈鋪路鵝卵石狀。免疫組化鑒定顯示角蛋白、波形蛋白抗原陽性，第Ⅷ因子、白細胞CD45抗原陰性，證實培養(yǎng)的細胞的確是HPMC。結(jié)論：胰蛋白酶消化法是一種簡單實用的分離HPMC的方法。

【關(guān)鍵詞】腹膜間皮細胞；胰蛋白酶；大網(wǎng)膜

腹腔粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥，常引起腸梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘連很難通過再次手術(shù)加以改善[1]。近年來對腹腔粘連的形成機制有了較深入的研究，認為腹腔粘連的形成與多種因素有關(guān)，其中腹膜間皮細胞的完整性及功能正常與否是腹腔粘連形成的關(guān)鍵因素[2]。因此，建立人腹膜間皮細胞培養(yǎng)體系，為體外研究人腹膜間皮細胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段。

早在20世紀80年代初，Wu等[3]通過直接從患者腹水中獲取腹膜間皮細胞的方法，成功地培養(yǎng)出人腹膜間皮細胞。此后Kern[4]和Stylianou[5]等分別采用膠原酶消化組織法和直接種植法，培養(yǎng)出人腹膜間皮細胞，Stylianou并完整地闡述了人腹膜間皮細胞的鑒定方法。雖然目前人腹膜間皮細胞培養(yǎng)方法很多，但由于培養(yǎng)人腹膜間皮細胞的條件苛刻且易受成纖維細胞污染等原因，要獲得大量、高純度的人腹膜間皮細胞仍為實驗研究中的難題。我們綜合文獻方法并加以改進，建立了人腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)方法。

1材料與方法

1.1取材

無菌取自江蘇省中醫(yī)院普外科、肛腸科腹部手術(shù)切除的大網(wǎng)膜。

1.2主要儀器設(shè)備

眼科剪、鑷，培養(yǎng)皿，50mL培養(yǎng)瓶，吸管，10mL尖底離心管，CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，離心機，倒置相差顯微鏡，100目不銹鋼篩，0.22濾膜過濾器。

1.3主要試劑

1.3.1PBS液氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.56g，磷酸二氫鉀0.2g溶于1000mL三蒸水中，過濾滅菌分裝，室溫保存。

1.3.21640培養(yǎng)基InvitrogenCorporation公司產(chǎn)品，按說明配制，并使其含有青鏈霉素各100U/mL，小牛血清20%。

1.3.3細胞消化液胰蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司）2.5g，EDTA二鈉鹽0.16g溶于1000mLPBS液中，過濾除菌，分裝于小瓶內(nèi)，-20℃保存。

1.3.4免疫組化抗體波形蛋白抗體，第8因子抗體，CD45抗體均為福建邁新公司產(chǎn)品。

1.4腹膜間皮細胞的原代培養(yǎng)

無菌摘取腹部手術(shù)切除的大網(wǎng)膜，剪取血管脂肪相對少的網(wǎng)膜組織，大小約3cm×3cm，將剪取的網(wǎng)膜組織置于含500U/mL青霉素和500L/mL鏈霉素的無菌生理鹽水中浸泡20min，然后用生理鹽水流動沖洗5min，將漂洗后的網(wǎng)膜組織平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再用PBS反復漂洗至沒有油珠漂浮，同時剪除血管及脂肪，將洗凈的網(wǎng)膜組織剪成1cm×1cm大小，加入0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA細胞消化液20mL，用吸管反復吹打均勻，裝于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化25min，每5min振搖1次，最后5min保持靜止。消化結(jié)束后將消化液用100目不銹鋼篩過濾于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入等量含20%體積分數(shù)的胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液終止消化。用移液器分裝于10mL尖底離心管，1000r/min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細胞沉淀，分裝于50mL培養(yǎng)瓶，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5腹膜間皮細胞的傳代培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)24h后，鏡下觀察細胞貼壁情況，貼壁良好的以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶內(nèi)全部陳舊培養(yǎng)液，貼壁情況差的以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶內(nèi)一半的陳舊培養(yǎng)液，此后每3d全換液1次。約培養(yǎng)5~8d細胞生長融合，可以首次傳代。當細胞生長融合成單層，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化15min。鏡下觀察細胞消化情況，細胞脫落變形后，加入4mL完全培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液分裝于離心管內(nèi)1000r/min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細胞沉淀，傳代于6孔板（將蓋玻片裁成4片，泡酸，洗凈，烘干，在盛有多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡5~10min，取出，在干燥箱內(nèi)60℃烘干1h，高壓滅菌。將滅菌后的蓋玻片放置于6孔板內(nèi)，每孔3片）內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃，5%CO2，濕度95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，至細胞完全貼壁伸展。

1.6腹膜間皮細胞的鑒定

1.6.1免疫組化鑒定①吸去6孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，將細胞爬片取出，用生理鹽水洗2遍，隨即放入10%中性福爾馬林固定30min；蒸餾水洗4次，每次3min。②加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室溫10min，PBS洗3次。③抗原修復，根據(jù)不同一抗的要求進行（CD45無須修復，波形蛋白和第8因子用檸檬酸緩沖液高壓加熱修復。滴加即用型一抗、室溫下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每張蓋玻片滴加50LElivision試劑盒中的試劑A，室溫下20min，PBS洗3次，每次3min。每張蓋玻片滴加50LElivision試劑盒中的試劑B，室溫下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB顯色，每張蓋玻片滴加新鮮配置的DAB顯色溶液，在顯微鏡下觀察3~10min；自來水洗5min，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS返藍。⑤脫水，逐級脫水：過70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，過二甲苯溶液3次，每次3min。⑥封片，將有細胞的一面向下，用中性樹膠封片。自然通風干燥。普通光學顯微鏡觀察，拍照。

1.6.2掃描電鏡鑒定①細胞準備：同間皮細胞傳代，取出細胞爬片浸入PBS中漂洗細胞表面；②固定：將細胞爬片放入青霉素小瓶中，加入4℃預冷的3%的戊二醛，4℃過夜。吸出固定液，用PBS浸洗2次，每次10min。再加入4℃預冷的1%的四氧化鋨，在4℃固定1h。PBS浸洗2次，每次10min。③脫水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐級脫水，各10min。④置換：將樣品放入醋酸異戊醋:丙酮=l:1的混合液中10min，然后放入醋酸異戊酯中2次，各10min；⑤臨界點干燥：預冷臨界點干燥室的樣品室，使其溫度降到0℃，將玻片放入樣品籃，樣品籃的上下兩面事先鋪好濾紙，在保證細胞被醋酸異戊醋浸潤的情況下，將樣品籃放入樣品室。擰緊室蓋，充入液態(tài)CO2，同時緩慢排出CO2氣體，反復3次，使液態(tài)CO2置換出細胞中的醋酸異戊醋，加熱樣品室，使CO2達到臨界狀態(tài)。緩慢的排出CO2，待樣品室壓力降為零，取出樣品。⑥離子濺射鍍膜：從樣品籃中取出玻片，用銀膠將干燥樣品粘到樣品托上。

導電膠干燥后，將樣品托放入離子濺射儀的真空罩內(nèi)，抽真空。當真空度達0.1托后，加高壓1000V，離子濺射鍍膜。⑦電鏡觀察：啟動掃描電鏡，安裝樣品，觀察細胞表面結(jié)構(gòu)，拍照。

1.6.3透射電鏡鑒定①消化間皮細胞，1000r/min，離心5min，3%戊二醛固定，PBS洗滌2次，每次20min；②1%鋨酸固定30min，PBS浸洗2次，每次10min；③脫水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐級脫水，各10min；④100%丙酮固定10min；Epon812浸泡、包埋；⑤LKB-V型超薄切片機切片（70m）；H-600透射電鏡（日本）下觀察、拍片。

2結(jié)果

剛從大網(wǎng)膜消化下來的間皮細胞在倒置顯微鏡下為葡萄串狀，50%的間皮細胞大約24h左右貼壁，個別細胞伸展。72h所有貼壁細胞均伸展，呈多形性（梭形、橢圓形、多角形等），邊緣不整，細胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀生長，與相鄰的細胞相互連接。以后細胞拉網(wǎng)生長現(xiàn)象減少，生長融合呈多角形，大小較為一致，似鋪路鵝卵石樣外觀。細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，2~4代細胞的形態(tài)與生長方式與原代細胞基本無異。5代開始間皮細胞增殖明顯緩慢。

2.1免疫組化鑒定

光鏡下觀察所培養(yǎng)細胞的波形蛋白染色為陽性，是間皮細胞的特征。波形蛋白抗原陽性，CD45、第8因子抗原陰性可排除成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和白細胞。

2.2超微結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下細胞完全鋪展，與周圍對比不強烈。細胞呈橢圓形或多角形，胞核圓形，位于細胞中央、較小，有核處細胞隆起較厚。細胞表面大量密集的微絨毛，細胞周圍高密度的絨毛在背景中形成高密度的暈圈。透射電鏡檢查：細胞表面存在大量多少不等的微絨毛，細胞漿內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，未見Weibelpalade小體。

3討論

間皮細胞培養(yǎng)中要注意以下幾點：①正確確定首次換液時間，避免換液過早，首次換液越晚越好，最好第3天進行，動作輕柔，減少振蕩。原代培養(yǎng)頭3天盡量勿動培養(yǎng)液，以免干擾間皮細胞貼壁，換液越早丟失的間皮細胞數(shù)目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的間皮細胞不要，因為最先消化下來的往往是活力不好的細胞。終止消化后用培養(yǎng)液吹打下來的細胞活力好，生長快；③注入培養(yǎng)瓶中的間皮細胞要具備一定細胞密度，不要太稀。生長良好的細胞可提供“化學信使”去促進其它細胞生長，因此細胞密集時它們彼此能提供和接受該“化學信使”越長越好；假若過稀，則可因缺乏該化學信使而停止生長、死亡。此外，腹膜供體的年齡越年輕越好。

雖然目前國內(nèi)、外的文獻已介紹了多種間皮細胞的培養(yǎng)方法，但這些培養(yǎng)方法均較為復雜且重復性不高，不能滿足科學研究的需要。本實驗所建立的體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)模型，操作簡單，培養(yǎng)迅速，4~7d即可傳代，可重復性強。

【參考文獻】

〔1〕MillerG,BomanJ,ShrierI,etal.Naturalhistoryofpatientswithadhesivesmallbowelobstruction〔J〕.BrJSurg,2000,87:1240

〔2〕劉洪斌,李東華,郭世鐸.腹腔粘連形成機制及治療研究進展〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2005,11(1):84-86

〔3〕WuYJ,ParkerLM,BinderNE,etal.Themesothelialkeratins:anewfamilyofcytoskeletalproteinsidentifiedinculturedmesothelialcellsandnonkeratinzingepithelia〔J〕.Cell,1982,31:693

〔4〕KernPA,KnedlerA,EckelRH.Isolationandcultureofmicrovascularendotheliumfromhumanadiposetissue〔J〕.ClinInvest,1983,71:1822

〔5〕StylianouE,JennerLA,DaviesM,etal.Isolation,cultureandcharacterizationofhumanperitonealmesothelialcells〔J〕.KidneyInt,1990,37:1563