迷迭香酸對慢性腎功能研究

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作者：林威遠,黃榮桂,鄭興中

【摘要】目的觀察迷迭香酸對慢性腎功能不全模型大鼠系膜基質及轉化生長因子β1(TGFβ1)的影響。方法制作大鼠慢性腎功能不全模型(5/6腎切除),以迷迭香酸作為干預因素,應用免疫組織化學半定量法測定迷迭香酸對大鼠系膜基質成分纖維連接蛋白(Fn)、膠原Ⅳ(ColⅣ)及TGFβ1的影響,電鏡觀察腎小球病理學變化,測定血、尿肌酐值。結果(1)與對照組比較,迷迭香酸組肌酐清除率(Ccr)水平升高(P<0.05);(2)Fn、ColⅣ在腎臟細胞外基質的沉積減少(P<0.05);(3)TGFβ1表達減少(P<0.05)。結論迷迭香酸可以抑制TGFβ1的表達,減少Fn及ColⅣ在腎小球細胞外基質的沉積,延緩腎小球硬化,對慢性腎功能不全疾病可能具有治療價值。

【關鍵詞】迷迭香酸;腎小球;細胞外基質;腎切除術;轉化生長因子β;疾病模型,動物

細胞外基質(ECM)的增加是慢性進行性腎小球病變的特征,腎小球ECM積聚是腎小球疾病發展至腎小球硬化的主要病理改變基礎。多種細胞因子通過對系膜細胞的作用參與調節腎小球ECM的分泌,導致腎小球結構和功能的異常,促進腎小球硬化。迷迭香酸(rosmarinicacid)為水溶性的多酚類化合物。1958年由Ellis首次從唇形科植物迷迭香(RosmarinusoffinalisL.)中分離得到，在植物中分布較為廣泛,主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中。由于迷迭香酸為天然抗氧化劑,有抗炎、免疫抑制等多種活性,對其進行研究開發具有一定的意義。筆者觀察迷迭香酸對慢性腎功能不全模型大鼠系膜基質及轉化生長因子β1(TGFβ1)的影響。

1材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠20只,6～8周齡,體質量(175±15)g[上海西普爾必凱實驗動物有限公司,許可證號:SCCKCC(滬)20030002]。纖維連接蛋白(Fn)、膠原Ⅳ(ColⅣ)、TGFβ1免疫組織化學(SABC法)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。迷迭香酸(含量97%,美國Aldrich公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備大鼠分籠飼養于室溫、日光照12h、45%濕度的環境中,自由飲水,進食標準普通飼料。1周后采用Platt法切除5/6腎制作慢性腎功能不全模型[1],分2期完成:先背部切口切除左腎2/3,1周后切除完整右腎。術后2周靜脈采血0.5mL,查肌酐值,明顯高于正常值(35～53μmol/L)者符合入選標準。

1.2.2分組模型大鼠分為模型組和迷迭香酸組,未手術大鼠為對照組,每組6只。迷迭香酸組給予迷迭香酸100mg·kg-1·d-1灌胃,另2組給予等容積蒸餾水灌胃。8周后,留24h尿及心臟取血備查;切開腹腔,取出腎臟,4%甲醛緩沖液固定,石蠟包埋。另取部分腎組織，送電鏡室檢查。

1.2.3免疫組織化學觀察采用SABC法,按試劑盒說明書操作。高倍鏡(×200)下隨機選擇20個腎小球和20個腎小管間質,根據染色面積和強度進行半定量評分:無染色或微弱染色為0，染色面積<25%為1，25%～50%為2，50%～75%為3，>75%為4;基本不著色為0,著色淡者(淡黃)為1,適中者(棕黃)為2,深者(棕褐)為3。兩者得分相加為最終值。

1.2.4尿肌酐和血肌酐測定采用全自動生化分析儀(德國Becman公司)檢測尿肌酐和血肌酐值,按公式換算成肌酐清除率:

肌酐清除率=[尿肌酐濃度(mg/mL)×1min尿量(mL)]/血肌酐濃度(mg/mL)

1.3統計學處理數據用x±s表示,采用SPSS11.0處理方差檢驗組間差異。組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2結果

2.1免疫組織化學觀測評分迷迭香酸可以抑制TGFβ1表達,減少Fn及ColⅣ在腎ECM沉積(表1)。

2.2免疫組織化學改變與對照組比較,模型組Fn及ColⅣ表達明顯增多,腎小球黃色及棕黃色、棕褐色面積大,著色深;迷迭香酸組Fn及ColⅣ表達較對照組減少,黃色及棕黃色面積小,著色較淺。模型組TGFβ1表達較對照組明顯增多,腎小管及間質黃色及棕黃色面積大,著色深;迷迭香酸組TGFβ1表達較對照組減少,黃色及棕黃色面積小,著色較淺(圖1)。

表1腎小球系膜細胞外基質及TGFβ1評分（略）

Tab1TheeffectsofrosmarinicacidontheglomerularmesangiummatrixandTGFβ1

n=6.Fn:纖維連接蛋白;ColⅣ:膠原Ⅳ;TGFβ1:轉化生長因子β1.與模型組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

Fn:纖維連接蛋白;ColⅣ:膠原Ⅳ;TGFβ1:轉化生長因子β1.A:對照組;B:模型組;C:迷迭香酸組.

圖1Fn、ColⅣ、TGFβ1表達(SABC法×200)（略）

Fig1TheexpressionofFn,ColⅣandTGFβ1inthekidneys(SABC×200)

2.3病理學改變光鏡:模型組腎小球系膜細胞及系膜基質增生明顯,有不同程度的萎縮、硬化,小球基底膜增厚,囊周纖維化,腎小管有擴張和萎縮,間質有大量炎癥細胞浸潤,伴纖維增生。迷迭香酸組系膜細胞及系膜基質增生程度和硬化程度較輕,基底膜較薄,腎小管擴張和萎縮改善,可見少量炎癥細胞浸潤(圖1)。

電鏡:模型組系膜細胞增生及系膜基質增生、擴大明顯,并有少量沉積物,內皮下大量沉積物,上皮足突明顯融合,結構紊亂;基底膜增厚,毛細血管壁增厚、萎陷;線粒體腫脹,溶酶體增多。迷迭香酸組系膜細胞及系膜基質增生程度較輕,足突結構基本正常,部分區域有輕度融合,基底膜增厚不明顯(圖2)。

2.4血肌酐、內生肌酐清除率的變化迷迭香酸對大鼠血肌酐、內生肌酐清除率的影響見表2。

3討論

3.1腎小球系膜細胞的細胞外基質在腎衰過程中的作用腎小球系膜細胞的ECM合成和降解的平衡對基質增生與否起關鍵作用[2]。大量研究證明,ColⅣ分泌增多或多肽鏈結構異常均影響GBM的分子結構,導致腎小球濾過功能異常。近年研究發現,在腎小球硬化進展過程伴有ColⅣ合成和/或降解異常,使其在病變腎小球中積聚,參與了硬化灶的形成[34]。在體內Fn有血漿型和組織型兩種,在慢性腎功能衰竭時血漿型Fn消耗增加而產生抑制,故明顯下降,但組織型Fn在組織中大量積聚[5]。本組大鼠模型有相同的表現。

3.2迷迭香酸的藥理作用及機制迷迭香酸是咖啡酸和3,4二羥苯基乳酸形成的酯類,屬于咖啡酸的一種衍生物,具有一系列的藥理作用,如抗炎、免疫調節、抗氧化、抗血小板聚集及抗血栓、抗系膜細胞增殖等作用[6]。對于迷迭香酸對腎小球ECM及細胞因子的影響方法,Makino等觀察迷迭香酸對兔抗鼠胸腺細胞血清誘導的系膜增殖型腎炎大鼠模型的影響,發現口服迷迭香酸(100mg·kg-1·d-1)8d后,系膜細胞增殖及系膜基質增生明顯抑制,認為迷迭香酸主要通過它的纖維蛋白溶解活性及抗氧化活性而產生上述作用。他還觀察了迷迭香酸對體外培養的鼠系膜細胞增殖的影響,發現它能抑制PDGF或TNFβ誘導的細胞增殖,主要作用于G0/G1及G1/S期的細胞,認為該作用機制主要是迷迭香酸抑制了系膜細胞PDGF及CmycmRNA的表達[78]。

A:對照組;B:模型組;C:迷迭香酸組

圖2腎小球的病理學改變(×3600)（略）

Fig2Thepathologyoftherenalconstitutionexamined(×3600)

表2大鼠血肌酐、內生肌酐清除率（略）

Tab2TheeffectsofrosmarinicacidonthetheScrandCcrofrats

n=6.Scr:血肌酐;Ccr:內生肌酐.與模型組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

3.3TGFβ對慢性腎功能衰竭的影響TGFβ是一種調節細胞生長和分化的多肽,促使ECM沉積,主要通過以下3個途徑:(1)明顯增加ECM膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型以及Fn表達;(2)通過減少MMP表達以及促進PAI(纖溶酶原激活抑制物)和TIMP的合成來減少ECM的降解;(3)刺激ECM受體——整合素的合成,使細胞粘附于ECM,而富含ECM的基膜也作用于細胞,調控TGFβ的產生。Takashi等用NorthernBlot雜交發現殘余腎小球有TGFβ1mRNA的表達,進一步觀察到尿毒癥時血清硫酸吲哚酚含量增高,利用5/6腎切除大鼠模型通過飲水和腹腔注射給予硫酸吲哚酚,發現實驗2.5周時殘腎TGFβ1mRNA表達增加,而肌酐、肌酐清除率正常,但5周時則出現腎功能下降,證明TGFβ1mRNA的異常高表達是慢性腎衰進展的啟動因素而非結果的表現[9]。Yamamoto等用免疫染色和原位雜交技術檢測人腎小球疾病TGFβ及mRNA表達,發現基質增多不明顯的腎小球疾病中TGFβ表達明顯增強,另外還見到TGFβ的3個亞型中以TGFβ1型表達加強為主,可見TGFβ1的表達與基質病理性增多有關[10]。本實驗結果顯示,迷迭香酸對TGFβ1的表達有抑制作用,可改善腎臟纖維化。

【參考文獻】

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