抗Stat3多克隆抗體的制備和其在乳腺癌診斷中的應(yīng)用

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【關(guān)鍵詞】信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；抗體；乳腺腫瘤；組織學(xué)分級(jí)

Preparationofpolyclonalantibodyagainststat3anditsapplicationinthediagnosisofbreastcancer

【Abstract】AIM:TopreparerabbitantibodyagainstStat3andanalyzeitsapplicationinthediagnosisofbreastcancer.METHODS:ThemalerabbitswereimmunizedwithrecombinantmouseStat3proteintoprepareantibodyagainstStat3.ThepurityandspecificityoftheantibodywereanalyzedbyWesternBlot.TheexpressionofStat3proteininthe65casesofbreastcancerand30casesofnormalbreasttissuewasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ThetiterofantiStat3antibodyinserumwas>1∶256000(A450=0.40)atthe6thweekaftertheimmunization.BothSDSPAGEandWesternBlotanalysisshowedthattherewasanobviousproteinbandwithMr92000,TheintracytoplasmicexpressionlevelsofStat3proteininthedifferenthistologicalgradingsof65casesofbreastcancershowedsignificantdifference(P<0.05),sodidtheintranuclearexpressionlevels(P<0.05).CONCLUSION:PolyclonalantibodyagainstStat3withhightiterandspecificitycanbepreparedsuccessfully,anditcanbeusedtodetecttheexpressionofStat3proteininbreastcancertissue.

【Keywords】Stat3;antibodies;breastneoplasms;histologicalgrading

【摘要】目的：制備兔抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）抗體，分析其在乳腺癌診斷中的價(jià)值.方法：應(yīng)用人工重組小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制備抗Stat3抗體；用免疫印跡法分析檢測(cè)抗Stat3抗體的純度和特異性；應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)65例乳腺癌和30例正常乳腺組織中Stat3蛋白的表達(dá).結(jié)果：用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6wk后，其血清中抗Stat3抗體效價(jià)>1∶256,000（A450nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印跡分析均在分子質(zhì)量（Mr）92000處有明顯的帶；65例乳腺癌組織的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，Stat3蛋白表達(dá)量在不同的組織學(xué)分級(jí)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).結(jié)論：高效價(jià)和特異性強(qiáng)的抗Stat3抗體被成功制備.該抗體可用于乳腺癌組織細(xì)胞Stat3蛋白表達(dá)的檢測(cè).

【關(guān)鍵詞】信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；抗體；乳腺腫瘤；組織學(xué)分級(jí)

0引言

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription;Stat3)是一類(lèi)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，于細(xì)胞漿內(nèi)有少量表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員之一.

異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使Stat3磷酸化而被持續(xù)激活，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［1］和阻斷細(xì)胞凋亡［2］.Stat3也可以被多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、非受體酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，激活基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［3］.Stat3表達(dá)的變化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，然而，有關(guān)Stat3在乳腺癌診斷中的作用還沒(méi)有詳細(xì)報(bào)道.我們用本室制備的小鼠重組Stat3蛋白，再制備兔抗Stat3抗體，來(lái)分析Stat3蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)，以及在乳腺癌診斷中的價(jià)值.

1材料和方法

1.1材料雄性，新西蘭兔，體質(zhì)量3.0kg(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心).福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑為美國(guó)GibcoRBL產(chǎn)品.HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和免疫組化顯色試劑盒（購(gòu)自北京中山生物工程公司）.重組小鼠Stat3蛋白由本室和美國(guó)MD公司共同制備（蛋白含量1.63g/L，經(jīng)SDSPAGE分離顯示單一條帶，Mr為92000）.30例正常乳腺組織來(lái)自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌組織來(lái)自女性乳腺癌患者，年齡(48±15)歲.這些研究對(duì)象經(jīng)冰凍切片和免疫組化同時(shí)證實(shí)確診，病理學(xué)分級(jí)由病理科提供，常規(guī)方法做病理切片.

1.2方法

1.2.1免疫動(dòng)物將Stat3蛋白（0.336g/L）0.2mL與福氏完全佐劑0.5mL混勻后，注射于家兔腹股溝和后腳掌進(jìn)行初次免疫.14d將同樣量的Stat3蛋白與福氏不完全佐劑0.5mL混勻后進(jìn)行第二次免疫，注射部位同前.28d取Stat3蛋白（0.25g/L）0.15mL用福氏不完全佐劑0.5mL混勻后，于背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行最終免疫.42d處死兔子收集全血.其中于初次免疫前取耳靜脈血2mL；第1次免疫后12d，第2次免疫后7d，第3次免疫后9,14d分別抽血3mL用于抗體效價(jià)測(cè)定.

1.2.2抗體效價(jià)的檢測(cè)用0.05mol/LpH9.5CBS稀釋Stat3蛋白，用常規(guī)方法包被酶標(biāo)板，ELISA法檢測(cè)兔血清中抗Stat3抗體的效價(jià).

1.2.3抗體的純化用330g/L飽和硫酸胺鹽析抗血清，離心沉淀后，用生理鹽水透析24h，8h換1次生理鹽水，將透析液用DEAE32層析柱進(jìn)行濃縮，收集洗脫液，測(cè)A280nm值.

1.2.4抗體純度和特異性檢測(cè)將Stat3蛋白進(jìn)行SDSPAGE分離（分離膠濃度為120g/L）.電泳后，用考馬斯亮藍(lán)R250染液染色確認(rèn)蛋白條帶，將分離膠中的蛋白用電泳轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜用50g/L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜.洗膜后，與兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀釋)37℃反應(yīng)2h；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5000稀釋)，于37℃反應(yīng)1h，以DAB顯色.

1.2.5乳腺組織細(xì)胞Stat3表達(dá)的檢測(cè)200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本，30例良性增生和良性腺病的乳腺組織進(jìn)行組織切片.將上述方法制備的兔抗Stat3抗體用PBS做1∶400稀釋?zhuān)闯Ｒ?guī)SP方法進(jìn)行乳腺組織免疫組化染色.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照Laird標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行，Stat3陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀，細(xì)胞核呈棕色顆粒狀.每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞>50%為強(qiáng)陽(yáng)性（），5%～50%的為陽(yáng)性（+），<5%為陰性（-）.Stat3蛋白胞質(zhì)表達(dá)：細(xì)胞質(zhì)呈深棕色云霧狀>80%（），細(xì)胞質(zhì)呈棕色云霧狀>50%（），細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀>5%～50%（+），細(xì)胞質(zhì)呈淡棕黃色云霧狀<5%（-）.Stat3蛋白胞核表達(dá)：細(xì)胞核呈深棕色顆粒狀>80%（），細(xì)胞核呈棕色顆粒狀>50%（），細(xì)胞核呈棕黃色顆粒狀>5%～50%（+），細(xì)胞核不染色或呈淡棕黃色顆粒狀<5%（-）.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：免疫組化染色所得結(jié)果用SPSS11.5軟件分析，統(tǒng)計(jì)方法為非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，Spearmans等級(jí)相關(guān).P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1兔抗Stat3血清效價(jià)基礎(chǔ)免疫后2,3,5,6wk分別采取靜脈血，間接ELISA法檢測(cè)抗Stat3抗體的血清效價(jià)，分別為1∶6400,1∶32000,1∶240000和>1∶256000(A450nm=0.40).

2.2抗Stat3抗體的特異性和純度鑒定Stat3蛋白經(jīng)SDSPAGE分離，用考馬斯亮藍(lán)R250染液染色，分離出1條Mr為92000的蛋白條帶，大小與Stat3理論值相符（圖1中M和1）.將凝膠中的Stat3轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用制備好兔抗Stat3抗體進(jìn)行免疫印跡，也出現(xiàn)Mr為92000左右的帶（圖1中2），證明此抗體為抗Stat3的特異性抗體.

M:marker;1:Stat3蛋白考馬斯亮藍(lán)R250染色；2：Stat3蛋白免疫印跡.

圖1兔抗Stat3血清特異性的免疫印跡分析（略）

2.3抗Stat3抗體在乳腺癌診斷中的應(yīng)用將正常乳腺組織30例和乳腺癌組織65例組織切片進(jìn)行抗Stat3抗體免疫組化染色（表1，圖2），Stat3在正常乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中呈淡棕黃色云霧狀，胞核不著色.乳腺癌組織在不同組織學(xué)分級(jí)的細(xì)胞質(zhì)中Stat3蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；細(xì)胞核中Stat3蛋白表達(dá)在不同組織學(xué)分級(jí)乳腺癌組織中也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).正常乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色霧狀著色，胞核不著色（圖3A）；在低分化癌細(xì)胞質(zhì)呈棕色云霧狀，胞核呈顆粒狀深棕色（圖3B）；而高分化癌組織的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色云霧狀，胞核著色呈棕色顆粒狀（圖3C）.

表1不同組織學(xué)分級(jí)的乳腺癌組織中Stat3的表達(dá)（略）

圖2Stat3蛋白在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)（A）和細(xì)胞核（B）中的表達(dá)量與組織學(xué)分級(jí)（略）

A：正常乳腺組織；B：Ⅲ級(jí)；C：Ⅱ級(jí).

圖3Stat3在不同分級(jí)乳腺癌組織中表達(dá)SP×400（略）

3討論

Stat3分子由750～795個(gè)氨基酸組成，Mr約為92000.編碼Stat3的基因在鼠科動(dòng)物定位于第11號(hào)染色體，在人類(lèi)定位于第17號(hào)染色體q21.Stat3在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活途徑中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子受體及非細(xì)胞因子受體與相應(yīng)配體相結(jié)合后，使胞質(zhì)內(nèi)的Jauns激酶（JaunsKinase;JAK）處于適當(dāng)空間位置而相互磷酸化，然后募集Stat3蛋白到胞質(zhì)區(qū)磷酸化激酶的酪氨酸殘基上，以激活該蛋白，活化的Stat3形成同源或異源二聚體迅速轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與其特異的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄［5］.Stat3持續(xù)活化可引起急性髓細(xì)胞性白血病、磷狀細(xì)胞癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞異常增生［6-8］.細(xì)胞核內(nèi)Stat3含量的高低標(biāo)志著該細(xì)胞JAkStat途徑的持續(xù)激活程度，只有激活的Stat3才能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，參與基因的表達(dá)調(diào)控［9］.Berclaz等［10］報(bào)道，正常人乳腺上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞周?chē)闹拘匀橄匍g質(zhì)等組織，檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)有微量Stat3的表達(dá)；在乳腺癌組織胞質(zhì)內(nèi)和胞核，都有非常強(qiáng)的Stat3表達(dá)，比正常乳腺組織高出很多倍.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活可使下游癌基因獲得轉(zhuǎn)錄活性并表達(dá)，最終有可能形成癌癥.因此，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活是疾病（如腫瘤）形成的一個(gè)早期事件，Stat3的激活可能發(fā)生在疾病進(jìn)程的早期，檢測(cè)Stat3蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的表達(dá)量將可能用于乳腺癌的診斷.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)Stat3蛋白表達(dá)量與組織學(xué)分級(jí)成正相關(guān)，在不同組織學(xué)分級(jí)的細(xì)胞質(zhì)中Stat3蛋白表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05).乳腺癌組織的細(xì)胞核中Stat3蛋白表達(dá)量與組織學(xué)分級(jí)成正相關(guān)，Stat3蛋白表達(dá)的含量也與組織學(xué)分級(jí)有顯著性差異(P<0.001)，組織學(xué)分級(jí)越高，細(xì)胞分化程度越低，胞核Stat3量越高.當(dāng)乳腺癌發(fā)生時(shí)，Stat3的胞漿表達(dá)量增高，而胞核Stat3的含量從無(wú)到有，即胞核中Stat3蛋白呈陽(yáng)性，因此Stat3蛋白的過(guò)量表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用.

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