反向遺傳學(xué)研究方法范文

導(dǎo)語：如何才能寫好一篇反向遺傳學(xué)研究方法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

曹樹青，2001年7月獲南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位。2001年8月至2003年7月在復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院從事博士后研究。2011年9月至12月在美國普渡大學(xué)從事訪學(xué)研究。現(xiàn)任合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系主任、教授、博士生導(dǎo)師。先后主持包括國家自然科學(xué)基金面上項目、國家重大科技專項子課題等在內(nèi)的國家級和省部級以及企業(yè)委托等課題20余項，指導(dǎo)國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目2項和校級大學(xué)生創(chuàng)新項目7項，主持校級精品課程及研究生教改項目各1項，參與省部級教改項目3項。

作為課題組的負(fù)責(zé)人，曹樹青在本領(lǐng)域研究較深。他先后在國內(nèi)外權(quán)威和核心刊物上發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇，其中在國際知名學(xué)術(shù)期刊New Phytologist、 Nature Communications、Planta、PLOS ONE、Molecular Genetics and Genomics、Pant and Soil、Plant Physiology and Biochemistry、Physiologia Plantarum等上發(fā)表SCI收錄的論文30余篇。除了這些重要論文，曹樹青還獲授權(quán)或申請國家發(fā)明專利14項，參與撰寫“973”專著1部。

土壤重金屬污染是全球面臨的重要環(huán)境問題之一，因為土壤污染的重金屬可通過農(nóng)作物而進(jìn)入食物，嚴(yán)重影響食品安全和人類健康。為解決這一問題，科學(xué)家采取了很多措施，植物修復(fù)基因工程便是解決土壤重金屬污染的重要途徑之一。

其原理是利用綠色植物來轉(zhuǎn)移、容納或轉(zhuǎn)化污染物使其對環(huán)境無害。研究表明，通過植物的吸收、揮發(fā)、根濾、降解、穩(wěn)定等作用，可以凈化土壤或水體中的污染物，達(dá)到凈化環(huán)境的目的。而在其中，植物修復(fù)的對象是重金屬、有機(jī)物或放射性元素污染的土壤及水體。因而，植物修復(fù)基因工程是一種很有潛力、正在發(fā)展的清除環(huán)境污染的綠色技術(shù)。

經(jīng)過長年不懈的努力，合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系主任、曹樹青教授，帶領(lǐng)科研團(tuán)隊首次揭示了植物響應(yīng)重金屬鎘脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制，為土壤重金屬污染植物修復(fù)基因工程提供了新的技術(shù)途徑和基因資源。2014年10月20日，這一成果在線發(fā)表在國際植物學(xué)知名學(xué)術(shù)期刊《新植物學(xué)家》上，并獲得第十三屆全國農(nóng)業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會優(yōu)秀論文獎。

從源頭保障農(nóng)產(chǎn)品安全

尋找和發(fā)掘耐受重金屬毒害且調(diào)控重金屬超量積累的關(guān)鍵基因并闡明其作用機(jī)理卻不容易，但這卻是植物修復(fù)基因工程獲得成功并從源頭上控制農(nóng)產(chǎn)品食品安全的關(guān)鍵所在。

我國有近20%的耕地存在鎘、砷、汞、鉛、鎳、銅等重金屬超標(biāo)，而土壤中重金屬可通過農(nóng)作物吸收進(jìn)入食物鏈，嚴(yán)重影響食品安全并危及人類健康。曹樹青介紹說，通過物理和化學(xué)手段治理土壤重金屬污染非常困難，也容易造成二次污染。

曹樹青課題組的此次研究正是瞄準(zhǔn)于此，主要通過正向和反向遺傳學(xué)途徑，篩選和克隆涉及植物重金屬超量積累（或降低重金屬吸收）的關(guān)鍵基因，并闡明其作用機(jī)理。該研究不僅有助于揭示植物耐受重金屬毒害的分子機(jī)理，而且可以為從源頭上控制農(nóng)產(chǎn)品安全提供新的技術(shù)途徑。

在得到了轉(zhuǎn)基因重大專項以及國家自然科學(xué)基金等項目資助下，曹樹青課題組利用正向遺傳學(xué)途徑篩選和鑒定了一個擬南芥耐鎘突變體xcd1-D，并克隆了其相應(yīng)的基因MAN3，該基因編碼一個1，4-糖苷水解酶。過量表達(dá)MAN3基因?qū)е骆k的耐受和積累，而MAN3基因功能缺失則該突變體表現(xiàn)出對鎘敏感。鎘脅迫誘導(dǎo)MAN3基因表達(dá)、增加甘露聚糖水解酶活性及甘露糖水平，從而激活谷胱甘肽依賴的植物螯合素合成途徑上的相關(guān)基因協(xié)調(diào)表達(dá)，進(jìn)而增加植物對鎘積累和耐受。大量實驗表明，過量表達(dá)MAN3基因的擬南芥植株，在重金屬鎘污染的土壤中仍然保持正常生長狀態(tài)。

隨著研究的不斷深入，他們發(fā)現(xiàn)了MAN3及其介導(dǎo)的甘露糖的新功能，首次揭示了其在植物響應(yīng)重金屬鎘脅迫過程中新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這為土壤重金屬污染植物修復(fù)基因工程提供了新的技術(shù)途徑和基因資源。成果自從在線發(fā)表在國際植物學(xué)知名學(xué)術(shù)期刊《新植物學(xué)家》后，獲得了業(yè)界廣泛矚目。

科研活動是一個連貫的對自然、社會規(guī)律的探索過程，因而一項科研需要堅持以保證其延續(xù)性。曹樹青表示，下一步，他打算深入挖掘植物響應(yīng)重金屬鎘信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制，對植物響應(yīng)其他重金屬包括砷及鉛等的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步研究，爭取將已獲得的研究成果產(chǎn)業(yè)化。

拓展科研的廣度

創(chuàng)新路上，中國科技正不斷向各種高度、深度和廣度延伸。“精度”既是科技創(chuàng)新的目標(biāo)，也是丈量科技創(chuàng)新質(zhì)量的標(biāo)尺，“廣度”則涵蓋了科學(xué)研究領(lǐng)域的方方面面。嚴(yán)格意義上，曹樹青的視野在生物科學(xué)，除了從事植物修復(fù)基因工程、植物抗逆分子生物學(xué)及食品生物技術(shù)等方面研究，他的科研視野也落在利用正向和反向遺傳學(xué)途徑上，他篩選鑒定多個與非生物脅迫相關(guān)的功能基因，初步闡明這些基因參與非生物脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)的可能機(jī)理。

為什么會選擇這方面的研究？緣于他對糧食安全的擔(dān)憂。糧食安全是國家安全的物資基礎(chǔ)，始終是關(guān)系到國計民生和國家安危的重要問題。在他看來，如何增強(qiáng)作物品種的抗逆性，還依然是目前我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的關(guān)鍵問題之一。在解決這個問題方面，利用轉(zhuǎn)基因育種提高作物的耐寒和抗旱能力無疑具有重要的理論與經(jīng)濟(jì)意義。這項工作的關(guān)鍵在于對植物抗逆分子機(jī)理的認(rèn)識及關(guān)鍵基因的發(fā)掘。

通過長期的鉆研，曹樹青探索出了一條比較有效的科研方法。他以模式植物擬南芥為材料，通過正向和反向遺傳學(xué)途徑，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程手段，篩選和克隆抗逆關(guān)鍵基因，闡明其功能，并用于作物抗逆分子遺傳改良。這一研究可獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新基因，不僅可以為作物抗逆遺傳改良提供新的基因資源，而且對于揭示植物抗逆分子機(jī)理具有重要的理論意義。

科研育人，并行不悖

曹樹青是一個忙碌的人，平時除了做科研，還在合肥工業(yè)大學(xué)作為教授、博士生導(dǎo)師帶學(xué)生。在他的指導(dǎo)下，先后培養(yǎng)碩士和博士生30余人，一些學(xué)生已先后在國內(nèi)外知名大學(xué)從事博士后研究和攻讀博士學(xué)位。他指導(dǎo)過的優(yōu)秀學(xué)生和研究團(tuán)隊更是不計其數(shù)。

篇2

關(guān)鍵詞：RNA干擾;長牡蠣（Crassostrea gigas）;TLR2-2基因;MyD88-2基因

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0349-8114（2014）12-2860-04

Effects of Inhibition of TLR2-2 Gene by RNA Interference on MyD88-2 Gene in Crassostrea gigas

LI Ying-xiang1，2，DU Yi-shuai1，ZHANG Lin-lin1，LI Li1，ZHANG Guo-fan1

（1.Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071，Shandong，China;

2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China）

Abstract：Double strands RNA synthesized in vitro transcription was injected toPacific oysters（Crassostrea gigas）， to study the interaction between TLR2-2 and its potential downstream MyD88 gene. The expression of TLR2-2 and MyD88-2 analyzed by qPCR reduced 72 h after injection. Moreover， in oysters where expression of TLR2-2 was inhibited by dsRNA， MyD88-2 was also found down-regulated， while the expression level of TLR2-2 in oysters where MyD88-2 was suppressed was not significant different compared with that of control group.

Key words： RNA interference; Crassostrea gigas; TLR2-2 gene; MyD88-2 gene

由于技術(shù)手段的限制，經(jīng)典的基因功能研究方法（如誘變）在軟體動物中暫時無法得到應(yīng)用，而RNA干擾技術(shù)則成為了軟體動物基因沉默的反向遺傳學(xué)研究工具[1]。利用雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默也是一種應(yīng)用非常普遍的技術(shù)手段。在細(xì)胞中，dsRNA可以被Dicer酶切割成約21～23 bp的雙鏈RN段，即siRNA（small interference RNA），siRNA整合到沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex， RISC），引導(dǎo)復(fù)合體中的酶切割目標(biāo)基因的mRNA，從而達(dá)到使目標(biāo)基因沉默[2-5];在脊椎動物中，dsRNA已經(jīng)被證明可以特異性地抑制目標(biāo)基因的表達(dá);而在軟體動物中，尤其是雙殼貝類，雖然已經(jīng)有研究在日本珍珠貝、櫛孔扇貝等物種中利用dsRNA成功實現(xiàn)目標(biāo)基因沉默[6-8]，但整體上，在雙殼貝類中RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于脊椎動物。

Toll-like receptor（TLR）家族參與的信號通路是天然免疫系統(tǒng)中非常重要的通路，其中TLR家族能夠作為模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）參與入侵微生物或病原體的識別并激活免疫反應(yīng)。研究表明，MyD88（Myeloid differentiation factor 88）可以通過其TIR結(jié)構(gòu)域參與到該信號通路來闡明TLR信號通路。本研究通過在長牡蠣中對TLR2-2基因和MyD88-2基因進(jìn)行dsRNA干擾，研究了長牡蠣天然免疫中TLR2-2基因與MyD88-2基因的上下游調(diào)控關(guān)系，為長牡蠣天然免疫的深入研究提供了參考，也為RNA干擾技術(shù)在雙殼貝類的應(yīng)用提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 長牡蠣取自山東省青島市膠南海域，選擇大小一致、健康的個體，試驗前于海水培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)1周，每天換水。

1.1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司;PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司;氨芐青霉素、卡那霉素、LB培養(yǎng)基、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit購自Fermentas公司，其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 7500 Fast型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），高速冷凍離心機(jī)、Nanodrop 2000超微量分光光度計（ThermoFisher公司），普通PCR儀（BIOER公司），冰箱、超低溫冰箱、微量可調(diào)移液器、恒溫?fù)u床、高壓鍋、制冰機(jī)、水浴鍋和超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計 PCR所用的引物根據(jù)GenBank中長牡蠣TLR2-2基因（OYG_10012212）和MyD88-2基因（Accession No. KC155822.1）序列設(shè)計，EF-1α（Elongation Factor-1α）基因為內(nèi)參基因，具體序列見表1。

1.2.2 dsRNA的制備 剖取大小一致、健康的長牡蠣鰓組織，以Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。以cDNA為模版，用5′端帶T7啟動子的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段連接pMD 19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取菌落進(jìn)行PCR，選取陽性克隆對應(yīng)的剩余菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并測序。根據(jù)測序結(jié)果，提取的質(zhì)粒即為雙鏈RNA體外轉(zhuǎn)錄的模版。體外轉(zhuǎn)錄模版，利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒提供步驟進(jìn)行操作，即可獲取dsRNA。

將獲得的dsRNA以瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度;用Nanodrop 2 000超微量分光光度計測量濃度和RNA純度;同時用RNase A和DNase I兩種酶檢測產(chǎn)物的質(zhì)量。用RNase A和DNase I進(jìn)行檢測時，按照試劑說明書，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別與RNase A以1∶1的比例，與DNase I以1∶4的比例一起在37 ℃孵育30 min，孵育后電泳檢測。

1.2.3 dsRNA的注射及取樣 將體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA溶解于滅菌的PBS緩沖液中，使其終濃度為1 μg/μL。從暫養(yǎng)1周后的長牡蠣中選取健康個體48只，隨機(jī)分為4組，分別標(biāo)記為空白對照組、PBS對照組、TLR干擾組和MyD88干擾組，每組單獨置于一個養(yǎng)殖桶中。TLR干擾組和MyD88干擾組每只分別注射100 μL其對應(yīng)的dsRNA，PBS對照組每只注射100 μL的PBS緩沖液，空白對照組不做處理。注射后72 h進(jìn)行血細(xì)胞樣品的取樣，提取總RNA，用于檢測目的基因表達(dá)量。

1.2.4 目的基因表達(dá)量的檢測 基因表達(dá)量的檢測通過實時熒光定量PCR進(jìn)行。以Trizol法提取總RNA，以Nanodrop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。以Elongation Factor-1α（EF-1α）基因為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA的制備與檢測

以Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測合成的dsRNA的純度，發(fā)現(xiàn)A260 nm/280 nm為1.9，產(chǎn)量為120 μg/個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μL）。同時瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測發(fā)現(xiàn)dsRNA的條帶單一，且片段大小與模版cDNA大小相符（圖1、圖2）。對于合成的dsRNA的檢測，主要采用了RNase A和DNase I兩種酶進(jìn)行。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與RNase A以1∶1的比例在37 ℃孵育30 min，電泳檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物完全降解，而將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與DNase I以1∶4的比例在37 ℃孵育30 min，則發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物未被降解（圖3）。檢測結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是RNA，而不是DNA。

2.2 dsRNA干擾的效果檢測

dsRNA注射72 h后，提取血細(xì)胞檢測目的基因相對表達(dá)量（相對內(nèi)參基因EF-1α的表達(dá)量）。與空白對照組、PBS對照組相比，TLR組（圖4A）和MyD88 組（圖4B）注射的dsRNA均有效地降低了目的基因的相對表達(dá)量，其中TLR組TLR2-2基因表達(dá)量較PBS組下降了76.7%，而MyD88組MyD88-2基因相對表達(dá)量也是較PBS組下降了74.3%，而PBS組與空白對照組中，兩個目的基因的相對表達(dá)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 TLR2-2基因干擾后對下游MyD88-2基因影響的檢測

由圖5可以看出，與PBS對照組相比，TLR干擾組中MyD88-2基因的相對表達(dá)量大幅下降;與PBS對照組相比，MyD88干擾組中TLR2-2基因的相對表達(dá)量差異不大。

3 小結(jié)與討論

RNAi作為反向遺傳學(xué)的工具已經(jīng)成為研究基因功能的有效手段。近年來，這項技術(shù)在無脊椎動物的研究中也開始得到了越來越廣泛的應(yīng)用。但在長牡蠣等雙殼貝類中相關(guān)的技術(shù)較脊椎動物還是非常不成熟的。研究認(rèn)為，dsRNA處理后靶標(biāo)mRNA水平下降70%以上，才可以認(rèn)為干擾有效[15]。雖然也有其他研究質(zhì)疑這一標(biāo)準(zhǔn)過于苛刻，認(rèn)為mRNA表達(dá)量不必下降到這個水平才可引起足夠的蛋白表達(dá)量變化和表型差異[16]，但即使按照70%的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，本研究干擾效果也可以被認(rèn)為是有效的。

目前，對長牡蠣中天然免疫系統(tǒng)的研究還是非常少，貝類和無脊椎動物缺少特異性的免疫反應(yīng)和免疫記憶，所以完全依賴細(xì)胞和體液介導(dǎo)的天然免疫來進(jìn)行病原防御。本研究初步探究了長牡蠣中TLR2-2基因沉默后對MyD88-2基因的影響，為其調(diào)控關(guān)系的確定提供了研究支持，對于明確TLR和MyD88在天然免疫系統(tǒng)中的作用提供了幫助。

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篇3

摘要:

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，其不僅是進(jìn)行農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新以及現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，更是保障糧食安全、建設(shè)生態(tài)文明并實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。本文從種質(zhì)資源的收集、鑒定和評價、創(chuàng)制及利用等方面進(jìn)行了綜述，以期為分子育種時代的種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用工作提供可利用的信息。

關(guān)鍵詞:

分子育種;種質(zhì)資源;創(chuàng)新;利用

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，是進(jìn)行新品種選育的基礎(chǔ)材料。古老的地方品種、重要的遺傳材料、野生近緣植物以及利用上述繁殖材料人工創(chuàng)造的各種植物的遺傳材料，都屬于種質(zhì)資源的范疇。就作物而言，種質(zhì)資源不僅是進(jìn)行農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新以及現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，更是保障糧食安全、建設(shè)生態(tài)文明、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。種質(zhì)資源的核心是其所攜帶的基因，對優(yōu)異基因進(jìn)行挖掘和充分利用可使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)取得突破性進(jìn)展，舉世聞名的第一次“綠色革命”就源于小麥和水稻中矮稈基因的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用［1］。長期以來，我國作物種質(zhì)資源工作的重點一直停留在收集、保存與鑒定等方面，導(dǎo)致具有廣泛應(yīng)用前景的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效等關(guān)鍵功能基因的發(fā)掘與利用滯后，突破性新種質(zhì)匱乏以及特有基因資源流失嚴(yán)重等問題。根據(jù)《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要》精神，從國家科技發(fā)展總體布局出發(fā)，結(jié)合經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國家安全需求，在現(xiàn)代生物技術(shù)高速發(fā)展的時代背景下，作物種質(zhì)資源的工作重心將轉(zhuǎn)向其優(yōu)異基因資源發(fā)掘與種質(zhì)創(chuàng)新，包括高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗生物及非生物逆境、水肥高效利用等基因資源，在明確其功能和應(yīng)用價值的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造一批可直接用于育種的中間材料。最新公布的七大作物育種專項也將優(yōu)異種質(zhì)資源鑒定與利用作為各項工作的重中之重。本文對我國種質(zhì)資源的收集、鑒定和評價、創(chuàng)制及利用現(xiàn)狀等方面進(jìn)行了綜述，以期為作物種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用工作提供可利用的信息。

1種質(zhì)資源的收集

種質(zhì)資源的收集是一個很古老的話題。作為作物種質(zhì)資源大國，長期以來，我國政府和科學(xué)家也一直非常重視作物種質(zhì)資源的收集工作。自20世紀(jì)50年代以來，不僅先后組織了多次農(nóng)作物種質(zhì)資源征集和考察工作，而且在保存設(shè)施建設(shè)方面也加大了投入，挽救了一大批瀕臨滅絕的地方品種和野生近緣種及其特色資源，建立了完善的種質(zhì)資源保護(hù)體系［2］。2015年，農(nóng)業(yè)部、發(fā)展改革委和科技部聯(lián)合印發(fā)了關(guān)于《全國農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用中長期發(fā)展規(guī)劃(2015—2030年)》的通知，深入分析了在現(xiàn)代農(nóng)作物種業(yè)發(fā)展過程中我國目前農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用工作存在的問題，嚴(yán)密部署了第3次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動，并就實施過程提出了詳細(xì)的技術(shù)規(guī)范。

2種質(zhì)資源的鑒定與評價

目前我國編入全國作物種質(zhì)資源目錄的材料約48萬余份，躍居世界第2位［3］。如何對數(shù)以萬計的種質(zhì)資源進(jìn)行精準(zhǔn)評價，從中發(fā)掘出優(yōu)異基因并將其應(yīng)用于現(xiàn)代化育種工作，是現(xiàn)階段我國進(jìn)行種質(zhì)資源收集的最主要的目標(biāo)之一，也是亟待解決的科學(xué)問題之一。在對種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛收集和考察的基礎(chǔ)上，我國相關(guān)研究人員也對所保存的資源進(jìn)行了基本農(nóng)藝性狀的鑒定，并進(jìn)行了綜合評價。而這些基于不同年份、不同地點的調(diào)查所進(jìn)行的評價，由于以易受環(huán)境影響的表型特征為依據(jù)，同時受研究條件和研究方法的制約，不能全方位、多層次地展開，因此精度有限。與表型鑒定相比，基于DNA序列多態(tài)性的分子標(biāo)記則能在DNA水平上揭示種質(zhì)間的不同，不受環(huán)境及發(fā)育時期等因素影響，而且具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，從而成為進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定和評價的一個更直接、高效且可信的工具。現(xiàn)階段，我們應(yīng)重點基于分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源的DNA指紋分析、遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)構(gòu)建以及功能基因的鑒定和評價等。

2.1DNA指紋分析

DNA指紋分析是分析并比較任何生物體之間DNA序列的非常快速的方法，該方法已被廣泛且有效地用于種質(zhì)資源的管理。目前，用于指紋識別的分子標(biāo)記有簡單重復(fù)序列或微衛(wèi)星、SCoT、抗性基因同源序列、SNP等多種類型。這些分子標(biāo)記大多為單位點，符合孟德爾遺傳規(guī)律，而且多態(tài)性高、信息量豐富。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，基于高通量測序的基因型檢測方法也逐漸成為研究熱點之一。

2.2遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的核心問題，是種質(zhì)資源研究的重要方向。物種內(nèi)或物種間的遺傳多樣性可以表現(xiàn)在多個層次上，如分子、細(xì)胞和個體等，遺傳多樣性是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件。近年來，遺傳多樣性的研究發(fā)展迅速，新的理論和方法不斷產(chǎn)生、發(fā)展和完善。基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析可直接用于指導(dǎo)育種實踐，例如利用分子標(biāo)記技術(shù)對作物種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進(jìn)行分析，可以幫助育種家更有目的地選擇雜組親本，提高育種效率。

2.3核心種質(zhì)構(gòu)建

對資源的廣泛征集和不斷累積交換使得種質(zhì)資源越來越多，但數(shù)量的增加并不意味著遺傳變異也得到相應(yīng)增加，因為資源庫中可能含有較大比例的遺傳冗余甚至重復(fù)的材料。這就為我們種質(zhì)資源工作了提出一個新的問題，就是如何對數(shù)目龐大的種質(zhì)資源進(jìn)行評價和有效利用，“核心種質(zhì)”這一概念的提出為這一問題提供了解決辦法。構(gòu)建核心種質(zhì)是提高種質(zhì)資源利用效率、提升種質(zhì)創(chuàng)新能力的基礎(chǔ)。另外，核心種質(zhì)本質(zhì)就是一個基因庫，在作物優(yōu)質(zhì)單元型區(qū)段(或基因)的發(fā)掘過程中也具有廣泛的應(yīng)用價值。近年來，作物遺傳資源核心種質(zhì)的構(gòu)建越來越受到學(xué)者的關(guān)注。目前，我國已構(gòu)建了水稻、小麥、玉米、大豆等幾大作物的核心種質(zhì)庫。在國家973項目的資助下，我國科學(xué)家還開展了水稻、小麥和大豆核心種質(zhì)重要農(nóng)藝性狀單元型區(qū)段及互作研究，該項工作也將為以上作物的分子設(shè)計育種和遺傳轉(zhuǎn)化育種提供基因資源，為未來重要基因的合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

3種質(zhì)資源的創(chuàng)新

種質(zhì)資源創(chuàng)新的過程，就是對現(xiàn)有種質(zhì)資源中所包含的遺傳信息采取某種手段或方法進(jìn)行改變的過程，傳統(tǒng)意義上的雜交育種就是種質(zhì)創(chuàng)新的一種最基本和常用的途徑。隨著人們對生物體認(rèn)識的不斷深入以及生物技術(shù)的不斷發(fā)展，種質(zhì)資源創(chuàng)新的方法也不僅僅停留和局限于通過雜交來進(jìn)行，還在組織、細(xì)胞乃至分子水平上進(jìn)行。創(chuàng)新途徑主要包括誘變、染色體工程技術(shù)、小孢子培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合基因工程等。近化手段、生物技術(shù)的興起也極大地提高了人們創(chuàng)造和利用變異的能力，為種質(zhì)創(chuàng)新提供了多種可利用的手段。突變體庫的建立和篩選也是基因挖掘的重要基礎(chǔ)。國際上已構(gòu)建了4個大規(guī)模水稻插入突變體庫。通過60Co－γ射線照射、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變等技術(shù)，各國科學(xué)家也創(chuàng)制了多個水稻、玉米、小麥、大豆等主要作物的突變體庫［4］。單倍體育種技術(shù)是近來發(fā)展成熟的、基于小孢子培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等組織培養(yǎng)技術(shù)的育種方法，它是對植物單核晚期的花粉進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其形成胚狀體，并通過染色體人工或自然加倍產(chǎn)生純合的二倍體或多倍體植株的過程。該方法可快速獲得大量純合、穩(wěn)定的雙、單倍體再生植株，為保存和創(chuàng)造作物種質(zhì)資源提供了一條有效途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展則實現(xiàn)了不同物種間基因的交流。轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標(biāo)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組和遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的重組單株，最終結(jié)合大田選擇和田間試驗培育新品種或新種質(zhì)的過程。該技術(shù)可以突破物種間的遺傳障礙，大跨度地超越物種間的不親和性，從而打破了遺傳物質(zhì)分類上的界限，實現(xiàn)了基因在不同物種間的轉(zhuǎn)移，大大拓寬了作物遺傳改良可供利用的基因來源［5］。目前，轉(zhuǎn)基因育種在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中都已取得成功［6］。多項研究表明，基因序列的微小變化可以對植物基因型產(chǎn)生顯著影響，從而影響植物的表型。新近發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)有望成為繼突變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)之后的育種技術(shù)發(fā)展的又一個里程碑，主要包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變、轉(zhuǎn)錄激活類似效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)、鋅指核酸酶、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)。以上技術(shù)不僅可以特異地修飾某個靶向序列，從而創(chuàng)造新的等位基因，而且與傳統(tǒng)的點突變相比，效率更高、速度更快、無多余的隨機(jī)突變。目前，基因組編輯技術(shù)在植物的抗病性、除草劑抗性以及營養(yǎng)代謝等相關(guān)領(lǐng)域得到成功應(yīng)用［7］。我們相信在不久的將來，這些基因也將對作物育種產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

4種質(zhì)資源的利用

4.1作物種質(zhì)資源利用的傳統(tǒng)途徑

我國對種質(zhì)資源的傳統(tǒng)利用大致經(jīng)歷了直接利用、雜交育種和雜種優(yōu)勢利用3個階段。20世紀(jì)50年代初期到60年代中期，我國生產(chǎn)上以直接利用種質(zhì)資源中的優(yōu)異地方品種進(jìn)行就地繁殖和推廣為主。在此基礎(chǔ)上，各地不但相互交換優(yōu)良品種，而且還從許多其他國家引進(jìn)了多種農(nóng)作物優(yōu)良品種，并通過系統(tǒng)選擇和雜交改良等途徑，實現(xiàn)了兩次品種更新?lián)Q代，使優(yōu)良品種得到迅速普及［3］。盡管當(dāng)時這些改良品種對產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率比較低，但是，通過對全國種質(zhì)資源的篩選，明確了這些作物種質(zhì)資源所具有的不同特性，為后來作物新品種選育奠定了良好基礎(chǔ)。20世紀(jì)50年代后期，雜交育種技術(shù)初露端倪，我國就迅速推廣普及雜交育種技術(shù)，大規(guī)模獨立自主地培育主要農(nóng)作物新品種。60年代以后，我國自育優(yōu)良品種已經(jīng)覆蓋大部分生產(chǎn)面積。這期間，在第一次“綠色革命”浪潮的影響下，我國科學(xué)家利用水稻地方品種“矮子占”和小麥創(chuàng)新種質(zhì)“矮孟牛”以及從國外引進(jìn)的矮稈種質(zhì)資源育成了大量的水稻和小麥矮稈新品種，進(jìn)一步提高了水稻和小麥的產(chǎn)量水平。雜種優(yōu)勢是在雜交育種過程中，后代所表現(xiàn)出的超親現(xiàn)象。早在20世紀(jì)60年代以前，一些國家就開始在玉米和高粱育種中利用雜種優(yōu)勢，并使得產(chǎn)量大幅提高。我國的雜種優(yōu)勢利用工作起步相對較晚，前期工作主要是從國外引進(jìn)了玉米自交系和高粱雄性不育系，并加以利用，該項工作為我國兩系雜交技術(shù)的迅速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)70年代以來，我國“雜交水稻之父”袁隆平院士利用“野敗”不育株，實現(xiàn)了水稻的“三系”配套，成功育成了雜交稻，水稻產(chǎn)量得到大幅提高，并使得我國迅速擺脫了糧食緊缺的困擾，有效提高了我國生產(chǎn)技術(shù)水平和糧食自給能力。此后，我國雜種優(yōu)勢利用技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展，目前，在水稻、玉米、高梁、谷子、小麥、蔬菜、大豆、棉花、油菜等主要農(nóng)作物新品種培育過程中都不同程度地利用了雜種優(yōu)勢，不僅使得新品種的產(chǎn)量和品質(zhì)得到大幅提高和改善，同時為提升我國糧食綜合生產(chǎn)能力和國際農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力提供了堅實的支撐［3］。

4.2與生物技術(shù)相結(jié)合的種質(zhì)資源利用途徑

種質(zhì)資源利用的最終目的是培育出新品種。目前，世界范圍內(nèi)的育種研究已從傳統(tǒng)的常規(guī)育種進(jìn)入依靠生物技術(shù)育種的時代，從單個基因的測序轉(zhuǎn)為有計劃、大規(guī)模地檢測水稻等重要生物體的基因圖譜。目前，全世界已有6000多項農(nóng)作物方面的生物技術(shù)研究成果進(jìn)入田間試驗，這些也表明，生物技術(shù)在作物育種中具有巨大的應(yīng)用潛力。

4.2.1優(yōu)異基因挖掘。要實現(xiàn)生物技術(shù)在作物育種中的重要作用，首要任務(wù)是確定植物群體內(nèi)基因或基因片段的表達(dá)及與表型現(xiàn)象的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。在這一過程中，目前常用的方法就是基于雙親分離群體(F2、RIL、CSSL、NIL等)的數(shù)量性狀位點定位和基于連鎖不平衡的將標(biāo)記或候選基因的等位變異與目標(biāo)性狀聯(lián)系起來的關(guān)聯(lián)分析，這2者都屬于正向遺傳學(xué)的研究范疇。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于高通量測序的QTL定位和關(guān)聯(lián)分析相關(guān)研究也取得了較大進(jìn)展，并顯示了廣闊的應(yīng)用前景。而在反向遺傳學(xué)中，基因所影響的表型并不清楚，但可通過基于遺傳轉(zhuǎn)化所進(jìn)行的基因功能獲得或缺失技術(shù)研究基因所引起的表型變異及其功能，并對其加以利用。隨著水稻、玉米等基因組測序的完成，以及結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的作物中的重要性狀相關(guān)基因被克隆，如水稻中已克隆的產(chǎn)量與品質(zhì)相關(guān)基因GS3、GS5、GW2、Ghd7，抗病相關(guān)基因xa13，抗褐飛虱基因Bph14等［8］。根據(jù)已克隆的基因信息，在種質(zhì)資源中進(jìn)行目的基因的等位變異分析，找到優(yōu)異的等位基因，這樣不僅能完成對現(xiàn)有種質(zhì)資源的精確鑒定，還能對鑒定的含有優(yōu)異等位基因的材料通過分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用到育種中，從而培育出優(yōu)良的品種。而對于大麥、小麥等基因組龐大的作物來說，也可以參考水稻等模式植物的研究結(jié)果，通過同源克隆、關(guān)聯(lián)分析等策略對一些重要性狀產(chǎn)生的分子機(jī)理進(jìn)行解析，并對相關(guān)基因進(jìn)行功能鑒定和利用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，作物基因發(fā)掘出現(xiàn)了一些新的發(fā)展趨勢，例如基因組測序技術(shù)的更新?lián)Q代、高通量基因型和表型分析平臺的建立，都將促進(jìn)基因發(fā)掘的規(guī)模化和高效化。

4.2.2分子標(biāo)記輔助選擇。20世紀(jì)80年代后期，我國開始利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行新品種的培育。分子標(biāo)記輔助選擇的核心是借助與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，直接選擇目標(biāo)基因型個體。分子標(biāo)記輔助選擇不受環(huán)境影響，可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可以克服再度利用隱性基因時識別難的問題，并能同時聚合多個目標(biāo)基因，因此，可大大提高育種效率和水平。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，各主要作物越來越多的重要性狀相關(guān)基因被定位或克隆，這將極大地促進(jìn)作物分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)的應(yīng)用。在種質(zhì)資源的應(yīng)用工作中，我們應(yīng)以種質(zhì)資源的鑒定評價、種質(zhì)創(chuàng)新和優(yōu)異基因挖掘等工作為基礎(chǔ)，通過分子標(biāo)記輔助選擇，有目的的將野生近緣種屬、地方農(nóng)家品種和國外引進(jìn)優(yōu)異種質(zhì)中的有益基因?qū)朐耘喾N中，從而對栽培種進(jìn)行性狀改良，創(chuàng)造出一批更適合育種需要的中間材料。

4.2.3分子設(shè)計育種。種質(zhì)創(chuàng)新和基因挖掘是對種質(zhì)資源研究工作的提升，對種質(zhì)資源進(jìn)行充分利用則是作物種質(zhì)資源研究工作的最終目的。科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展將使得作物基因發(fā)掘的速度和數(shù)量大幅提高，這也將促進(jìn)后基因組時代的到來，加深我們對基因互作的了解，從而揭開作物重要性狀的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控途徑。因此，在創(chuàng)制一批滿足育種需要的中間材料的同時，還應(yīng)著眼于未來，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將挖掘到的優(yōu)異基因?qū)氲皆撟魑锏漠?dāng)前應(yīng)用廣泛、綜合性狀優(yōu)良的某一品種中，構(gòu)建包括高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗等基因的一系列的近等基因系;以上述近等基因系為材料，通過基因的定向組裝達(dá)到性狀的協(xié)調(diào)改良，突破傳統(tǒng)育種的瓶頸，實現(xiàn)作物品種的精準(zhǔn)分子設(shè)計育種。同時，我們也應(yīng)該把握機(jī)遇，充分利用植物基因組學(xué)和生物信息學(xué)等前沿學(xué)科的重大成就，及時開展分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)理論研究，建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的分子設(shè)計育種技術(shù)體系和技術(shù)平臺［9］。

5展望

當(dāng)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，如高通量表型和基因型鑒定技術(shù)，使得種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用的各個環(huán)節(jié)都融入了現(xiàn)代高新科技的元素。有理由相信，這些工作的順利完成將為選育突破性農(nóng)作物新品種、發(fā)展現(xiàn)代種業(yè)、保障糧食安全提供物質(zhì)和技術(shù)支撐。

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篇4

關(guān)鍵詞：熱激反應(yīng)；耐熱機(jī)制；轉(zhuǎn)錄因子；遺傳規(guī)律分析

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中溫度對植物生長發(fā)育的影響尤其嚴(yán)重。近年來，隨著全球“溫室效應(yīng)”的加劇，氣溫上升，植物面臨著高溫的脅迫。一般認(rèn)為，當(dāng)溫度高于環(huán)境溫度10～15℃時，植物就會產(chǎn)生熱激反應(yīng)（heat shock response），在數(shù)小時內(nèi)迅速獲得耐熱性，以抵御致死高溫[1]。但是高溫會影響植物的各種生理生化過程，如抑制光合作用、改變細(xì)胞膜穩(wěn)定性、改變激素和次級代謝物的合成，甚至導(dǎo)致植物死亡[1]，因此，探究植物耐熱性機(jī)理和分子機(jī)制對于提高植物耐熱性及植物的引種選育都具有指導(dǎo)意義。

1 植物耐熱性的分子機(jī)理

植物在長期的進(jìn)化過程中形成了各種機(jī)制使其在溫度升高的情況下得以生存，包括遺傳機(jī)制、形態(tài)適應(yīng)、短期的逃避機(jī)制（改變?nèi)~片方向和蒸騰作用等）、細(xì)胞生理反應(yīng)等。

1.1 熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）

陸地上的植物通常一年四季都暴露在外界大范圍的溫度波動當(dāng)中，和許多動物不同的是，植物固定在一個地方生長，且不能逃脫它所不適宜的溫度環(huán)境。為了生存，植物必須能夠預(yù)期到即將面臨的為害，然后在細(xì)胞中表達(dá)和積累所謂的熱休克蛋白（Hsps）基因，從而來對抗熱損傷。

植物在熱脅迫下會瞬時合成新的或功能增強(qiáng)的Hsps，Hsps的積累可以增強(qiáng)植物的耐熱性[2]，從而維持細(xì)胞正常的生理行為。在真核細(xì)胞中由熱激基因所編碼的熱激蛋白在結(jié)構(gòu)上可分為6個家族：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 （Chaperonins）、小分子量熱激蛋白（small Hsps， sHsps）以及泛素蛋白（8.5 kDa）[3]，其中發(fā)揮最主要作用的就是sHsps[4]。

①sHsps 存在于高級植物的葉肉組織中，sHsps是最豐富的一個組分，為17～30 kDa。sHsps含量的豐富和它的遺傳特性說明其可能具有獨特的生理功能[5]。植物中一般會產(chǎn)生20種以上的sHsp，它們含量豐富并呈不均勻分布，是植物體中最主要的壓力應(yīng)激Hsp。植物sHsp都是由細(xì)胞核編碼的，分為6個級別：CⅠ、CⅡ、CⅢ位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，其他3個組分CⅣ、CⅤ、CⅥ位于原質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中。所有的sHsps都有90個保守氨基酸碳端區(qū)域，就是所謂的熱休克區(qū)域。這個區(qū)域使得sHsps能夠被熱誘導(dǎo)而且可能在伴侶活性方面有很重要的作用。在植物中，sHsps的積累量和耐熱性呈正相關(guān)。Korotaeva等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米、小麥和黑麥在42℃的環(huán)境中時，玉米中有5種線粒體sHsps（28，23，22，20，19 kDa）表達(dá)，而在小麥和黑麥中只有一種sHsp （20 kDa）表達(dá)，這說明玉米相對小麥和黑麥具有更強(qiáng)的耐熱性。

②Hsp70 Hsp70家族成員具有很大的保守性，在氨基酸序列上至少50%是相同的。Hsp70家族蛋白包括：大腸桿菌dnaK蛋白，酵母細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白Ssalp和Ssa2p。它們存在于真核細(xì)胞的線粒體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體中。Hsp70家族蛋白在高溫、寒冷和化學(xué)品刺激等環(huán)境壓力下都會表達(dá)，同樣，過表達(dá)Hsp70會誘導(dǎo)植物的耐熱性和對環(huán)境壓力的抵抗性[7]。

③Hsp100和Hsp90 組成型表達(dá)的Hsp100家族蛋白，在環(huán)境壓力下可以上調(diào)，它們的主要功能是保護(hù)蛋白質(zhì)，防止其變性和聚集。研究表明，Hsp101對于擬南芥和酵母的耐熱性都是必需的，同時對于其他植物的耐熱性也是非常關(guān)鍵的[8]。在擬南芥中過表達(dá)Hsp101對于其生長過程中的恢復(fù)期有積極影響[9]。最近也發(fā)現(xiàn)，Hsp101同源蛋白在擬南芥中也涉及細(xì)胞質(zhì)體分化過程中調(diào)節(jié)內(nèi)部類囊體膜的形成和在熱激壓力下賦予葉綠體耐熱性的作用[10，11]。

Hsp90家族蛋白的大小在80～94 kDa，是一種ATP依賴的分子伴侶，主要功能是協(xié)助蛋白折疊，并在各種脅迫反應(yīng)中表達(dá)量增加[2]。Hsp90也是高度保守，通過全基因組測序鑒定到葡萄中的7個Hsp90基因和擬南芥的相應(yīng)基因具有高度相似性，而且在提高溫度時，Hsp90表達(dá)量會增加，這也說明Hsp90在熱激反應(yīng)時起保護(hù)作用[12，13]。

④Hsp60和泛素蛋白 Hsp60家族是一類高度保守的大小約為60 kDa的分子伴侶，它們在原核和真核中的成員是二聚體而且是被磷酸化的亞型。這個家族的成員通常是具有14個亞基的低聚物，位于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，主要在胞液、線粒體與葉綠體的內(nèi)部，不存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)中。主要幫助蛋白的折疊和其亞基的裝配， 并且需要一個更小的大約10 kDa的伴侶蛋白與之一起作用[14]。

泛素蛋白是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的高度保守的蛋白，是由75～76個氨基酸殘基組成的低分子量蛋白，存在于每一個真核細(xì)胞中。泛素蛋白對于熱激誘導(dǎo)合成中的耐熱性和恢復(fù)性有著至關(guān)重要的作用，主要介導(dǎo)蛋白的降解。在牧豆樹和大豆遭受熱脅迫時，作為一種重要的耐熱機(jī)制，泛素蛋白在熱脅迫開始的30 min內(nèi)會大量合成[15]。

1.2 抗氧化系統(tǒng)

高溫脅迫會使植物發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生一系列活性氧中間體（reactive oxygen species，ROS），如O2-?、H2O2、?OH及丙二醛（MDA）等，它們會催化細(xì)胞膜脂質(zhì)和色素類的過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增加，破壞其功能。這時，植物便會產(chǎn)生一些酶和抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、抗壞血酸（AsA）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR），h型硫氧還蛋白（Trxh）、谷胱甘肽還原酶（GR）及谷胱甘肽（GSH）等，來清除ROS對細(xì)胞膜的傷害，提高植物的耐熱性[16，17]。Khanna等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在藜（Chenopodium album）的葉片和花序的葉綠體和線粒體中含有多種耐熱性的SOD和APX，而且SOD的熱穩(wěn)定性優(yōu)于APX。

1.3 植物激素

在植物的耐熱等環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中，包括脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）等多種植物激素也都參與其中。比如，有研究證實ABA在翦股穎（Agrostispalustris）遭受熱脅迫后的植株恢復(fù)期中有所積累并發(fā)揮作用[19]，ABA轉(zhuǎn)錄因子ABF3的過表達(dá)可以使植物獲得對高溫、冷凍等脅迫的抗性[20]。SA是植物系統(tǒng)獲得耐熱性（SAR）和過敏反應(yīng)（HR）信號通路中的重要組分，SA通過穩(wěn)定熱休克轉(zhuǎn)錄因子促使Hsps產(chǎn)生[21]。此外，SA的衍生物磺基水楊酸（SSA）能夠有效地清除黃瓜在熱脅迫時產(chǎn)生的H2O2[22]。

1.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

在壓力環(huán)境下，植物會積累很多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如糖類、糖醇、脯氨酸、叔銨和季銨化合物及叔硫化合物等來增強(qiáng)植物的抗逆性。Amooaghaie等[23]研究發(fā)現(xiàn)，多胺類可以使熱處理后的大豆幼苗恢復(fù)生長，而用多胺類的抑制劑CHA和DMFO處理會導(dǎo)致幼苗的熱敏性增強(qiáng)。甜菜堿（GB，一種兩性的季銨化合物）在植物遭受高鹽或高溫脅迫時會作為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用，如玉米和甘蔗在遭受干旱或高溫時就會大量積累GB來保持水分[24]。同樣，脯氨酸和可溶性糖類在植物遭受高溫脅迫時也會大量積累來提高耐熱性，它們也是植物抵御高溫脅迫的最受關(guān)注的滲透類物質(zhì)[25]。但是最近也有研究指出，高溫下擬南芥幼苗中脯氨酸的積累可能會誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生從而降低其耐熱性，而ABA和乙烯會抑制這一過程[26]。

1.5 光合作用與蒸騰作用

光合作用是植物最重要的生理過程之一，對高溫脅迫也最為敏感。高溫可以破壞光系統(tǒng)Ⅱ、阻止CO2的擴(kuò)散、降低Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）對CO2的親和力及使PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶和丙酮酸羧激酶活性下降等，從而導(dǎo)致光合速率降低[27]。與不耐熱品種相比，耐熱品種在高溫解除后凈光合速率回升較快，能維持較高的同化速率[28]。此外，葉綠素的含量也是判斷耐熱性的一個標(biāo)準(zhǔn)，被作為覆盆子耐熱性指標(biāo)[29]。有研究指出，通過噴灑外源Ca2+可以有效地提高應(yīng)激反應(yīng)中煙草的光合作用，從而增強(qiáng)其耐熱性[30]。

水分對植物耐熱性的影響主要與蒸騰作用的強(qiáng)度有關(guān)，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，植物的葉導(dǎo)度增加，蒸騰作用增強(qiáng)，可以起到降溫作用，但隨著蒸騰作用的加強(qiáng)，植物會因為缺水而枯萎，這時要降低蒸騰速率來維持體內(nèi)的水分，而耐熱品種的這種保護(hù)能力更強(qiáng)[31]。

1.6 細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性（cell membrane thermostability，CMT）

高溫會破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，使質(zhì)膜的電解質(zhì)通透性增加，降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，因此，CMT也成為眾多植物品種中衡量其耐熱性的主要指標(biāo)之一，如小麥、棉花、高粱和大麥等。陳希勇等[32]測定了春小麥多種基因型幼苗的CMT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMT與產(chǎn)量性狀表現(xiàn)出較高的正相關(guān)。

1.7 其他耐熱機(jī)制

植物葉片會向大氣層中不斷揮發(fā)大量的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs），其中異戊二烯和單萜占了80%以上，最近眾多研究表明VOCs的揮發(fā)是植物耐熱性的一項重要機(jī)制[33]。Kadman等[34]分別將過表達(dá)異戊二烯和野生型的擬南芥品種在60℃下處理2.5 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者明顯具有更好的耐熱性。

自然生態(tài)系統(tǒng)中的所有植物都是與真菌共生的，這些真菌在獲取營養(yǎng)時會不同程度地影響宿主的適應(yīng)性。Regina等[35]通過研究指出，這種植物和真菌的共生系統(tǒng)會使植物獲得耐熱性，他們從美國兩個火山地收集了200種植物，研究表明，這些植物不論在試驗條件下還是田間種植條件下，與真菌Curvularia sp.（彎孢霉屬）共生的植物都具有更好的耐熱性。Baynes等[36]指出，廣泛生長在亞歐大陸和北美的旱雀草（Bromustectorum）的耐熱性也與其共生的羊肚菌（Morchella）有關(guān)。

1.8 植物耐熱機(jī)制的信號途徑

植物在高溫脅迫下的耐熱性反應(yīng)由一系列的信號途徑參加完成，復(fù)雜而有序，這些信號機(jī)制中包括離子運輸者、滲透保護(hù)劑、自由基清除劑、信號級聯(lián)反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄控制中的一系列蛋白和元素，這些物質(zhì)的協(xié)同運作對抵制壓力效應(yīng)都是必需的。其中，有些組分是此信號通路中的關(guān)鍵因素，如細(xì)胞膜和第二信使（Ca2+、NO、H2O2等）及各種下游調(diào)節(jié)組分（鈣調(diào)蛋白、MAPK、Hsp90、Hsfs、ATP、PLC9等）[37～40]。植物耐熱性的一系列改變和機(jī)制，從感知高溫到信號傳導(dǎo)，再到產(chǎn)生一系列相關(guān)代謝物來應(yīng)付各種熱激脅迫，其基本原理和過程都已被提出[1]（圖1）。

2 植物耐熱性的分子生物學(xué)研究

2.1 植物耐熱性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究

在植物耐熱的信號傳導(dǎo)過程中，轉(zhuǎn)錄因子是一個關(guān)鍵因素，在脅迫反應(yīng)中它們不斷合成并將信號傳遞和放大，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而引起植物的一系列抗逆反應(yīng)。目前在植物的耐熱機(jī)制中，已發(fā)現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)錄因子。Hsfs （heat shock transcription factors）是植物耐熱機(jī)制中最重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)Hsps的產(chǎn)生[41]。在植物中有20多種Hsfs，番茄HsfA1a和擬南芥HsfA2是誘導(dǎo)產(chǎn)生耐熱性的主要轉(zhuǎn)錄因子[42]，而且通過對眼子菜屬不同種耐熱性的對比研究發(fā)現(xiàn)，由HsfA2誘導(dǎo)獲得的耐熱性具有種的特異性[43]。Suzuki等[44，45]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MBF1c （multiprotein bridging factor 1c）是擬南芥耐熱過程中必需的，它可以在熱激反應(yīng)中控制36種不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)來介導(dǎo)植物對高溫的耐性。APX1 （cytosolic ascorbateperoxidase1）和Zats （zincfinger proteins）在植物耐熱反應(yīng)ROS信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著必不可少的作用[46，47]。DREB2A/DREB2C （dehydration-responsive element-binding proteins）通過激活HsfA3來正調(diào)控植物的耐熱性[48，49]。Li等[50]利用WRKY家族中的WRKY25/26/33的擬南芥缺失突變體作為研究材料，通過試驗發(fā)現(xiàn)它們與野生型相比熱敏感度增加，發(fā)芽率和成熟率明顯下降，可見WRKY也是植物耐熱反應(yīng)中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。此外，MYB類、bZIP類、NAC類和AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答過程中具有重要功能[51]。

2.2 植物耐熱性的遺傳規(guī)律研究

植物的耐熱性并不是由某一種耐熱基因所決定，而是在不同生命周期和不同部位由不同基因控制。下面介紹幾種常用的分析方法及研究結(jié)果。

①數(shù)量性狀位點（QTL，Quantitative trait loci）分析 開始運用QTL的方法來分析植物的耐熱性是在1991年，Ottaviano等[52]發(fā)現(xiàn)在玉米的44個重組自交系（RILs，recombinant inbred line）的遺傳性CMT中，有6個QTLs占了全部遺傳變異的53%。盤毅等[53]以耐熱水稻品系996和熱敏感品系4628為親本構(gòu)建的RILs為材料，采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到2個花粉育性耐熱性QTL，命名為qPF4和qPF6，對高溫脅迫下花粉育性的表型解釋率分別為15.1%和7.15%。

②共分離（Co-segregation）分析 在春小麥的RIL群體里，小麥幼苗耐熱性的獲得是依據(jù)CMT與以色列炎夏中小麥產(chǎn)量的RILs的對應(yīng)關(guān)系而確定的[54]，此外，關(guān)于Hsps參與耐熱性的遺傳效應(yīng)也是通過對冬小麥RILs的共分離分析揭示的[55]。陳飛雪等[56]利用耐高溫和不耐高溫黃瓜品系為材料，利用SSR（Simple Sequence Repeats）和SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）引物進(jìn)行多態(tài)性和選擇基因型分析，發(fā)現(xiàn)了1個SSR和9個SRAP標(biāo)記與黃瓜耐高溫QTL連鎖，對表型貢獻(xiàn)率為6%～17%。

③遺傳繁殖群（Genetic stock）分析 通過分析小麥、大麥、燕麥或其他谷類的遺傳繁殖系，包括末端缺失、重組和移位品系以及雜交系，可以說明這些谷類耐熱性的遺傳基礎(chǔ)。例如，缺失染色體1B長臂的小麥品種可以在更低的溫度下獲得耐熱性，而缺失7D長臂的小麥品種變?yōu)闊崦粜圆⑶襀sp的表達(dá)合成下降，可見，染色體1B長臂攜帶有在低溫和耐熱反應(yīng)中抑制熱激反應(yīng)的基因，而7D長臂攜帶有誘導(dǎo)Hsps合成和獲得耐熱性的必需基因[57]。

最近利用轉(zhuǎn)基因、反向遺傳學(xué)和突變的方法分析一些非谷類植物品種所獲得的實驗數(shù)據(jù)有力地證明了Hsp在植物耐熱性中的作用。利用熱敏感突變體證實了4個基因位點在擬南芥中決定了獲得耐熱性的能力，其中包括編碼Hsp101的基因[58]。

3 展望

詳細(xì)介紹了目前在植物耐熱性分子機(jī)理和遺傳規(guī)律等方面獲得的研究成果，為耐熱性品種的培育提供了理論基礎(chǔ)。在眾多參與植物熱激反應(yīng)的成分中，Hsps是最為重要的一類物質(zhì)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得Hsps高表達(dá)的品種不失為一種有效的培育方法。此外，選育耐熱品種，進(jìn)行熱鍛煉及在幼苗上噴灑ABA、SA、Ca2+等植物生長調(diào)節(jié)劑也是提高耐熱性的有效方法[23]。

盡管前人對植物的耐熱性進(jìn)行了較多的研究，但目前植物對抗熱脅迫方面還存在一些問題：①對耐熱性的遺傳機(jī)理研究不夠深入，多集中于對植物耐熱性相關(guān)的農(nóng)藝性狀和生理特性的分析；②很多研究僅僅停留在實驗中，許多實驗結(jié)果并未能真正用到生產(chǎn)實踐中；③對于植物的耐熱性研究現(xiàn)階段主要集中在農(nóng)作物上等，對木本植物的耐熱性研究比較少，而且對于木本植物的抗熱性的研究還沒有形成一個完整的系統(tǒng)。

高溫脅迫是影響植物生長、降低農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一，因此，獲得耐熱性在內(nèi)的各種抗逆性是人們最為希望得到的作物品質(zhì)。我們只有通過在熱脅迫環(huán)境下，對植物體內(nèi)的一系列參數(shù)變化進(jìn)行進(jìn)一步的探究，才可以從變化中找到與抗熱性密切相關(guān)的各種因素，為今后植物抗熱性研究奠定重要的基礎(chǔ)。

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