重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文

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篇1

【關(guān)鍵詞】染色體多態(tài)性；不良生殖效應(yīng)；細胞遺傳學(xué)

Study on the relationship between chromosome polymorphism and abnormal reproductive effect in 58 cases

[Abstract] Objective： To study the relationship between chromosome polymorphism and the abnormal reproductive effect. Methods： The peripheral blood lymphocytes of the patients were cultured routinely of karotype analysis with G，C and N banding. Results： There were 141 cases with chromosome variation in 2660 patients.58 cases with chromosome polymorphism，including 15 cases （10.6%） with the short arm lengthened of chromosome D/G group， 9 cases （6.4%） with the SC region lengthened of chromosome 1，9 and 16， 24 cases （17.0%） with inv（9） and 10 cases （7.1%） with Y chromosome polymorphism were observed. Conclusion： Chromosome polymorphism is related to the abnormal reproductive effect.

[Key words] Chromosome polymorphism； Abnormal reproductive effect； Cytogenetics

染色體多態(tài)性也稱為異態(tài)性，指廣泛存在于正常人群中的各種染色體結(jié)構(gòu)和著色強度恒定但非病理性的微小變異。一般認為，染色體多態(tài)性的發(fā)生通常在臨床上沒有明顯的不良效應(yīng)[1]。但如今隨著細胞遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究與資料表明，染色體多態(tài)性與臨床效應(yīng)有一定相關(guān)性，尤其與不良臨床生殖效應(yīng)關(guān)系密切。本文根據(jù)2011年來我院遺傳科進行遺傳咨詢的2660例患者的細胞遺傳學(xué)檢查結(jié)果進行分析并結(jié)合相關(guān)資料探討染色體多態(tài)性與臨床生殖效應(yīng)間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011年來我院遺傳科門診進行遺傳咨詢的患者2660例，就診原因有不孕、不育、少弱精癥、早孕期胚停、流產(chǎn)、胎兒絨毛組織/羊水/臍血核型異常、智力低下等。

1.2研究方法 采集患者外周血1～2ml，肝素抗凝，無菌操作下接種于外周血細胞培養(yǎng)基（產(chǎn)地：青島萊佛生物工程研究所），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，按常規(guī)方法制備染色體標本，G顯帶技術(shù)進行細胞核型分析，對其中疑有染色體多態(tài)性的病例加用C或N顯帶技術(shù)，以確認細胞核型分析結(jié)果。每例至少計數(shù)20個細胞，分析2個核型。

2 結(jié)果

2.1 染色體多態(tài)性的觀察結(jié)果

在2660例遺傳咨詢患者中檢出染色體變異141例，其中染色體多態(tài)性變異為58例，占41.13%，其他染色體變異83例，占58.87%，均表現(xiàn)臨床效應(yīng)。觀察到的染色體多態(tài)性變異可主要分為以下四種類型：（1）D/G組短臂或隨體區(qū)延長（圖1）；（2）次縊痕增長（包括1、9和16號染色體）（圖2）；（3）9號染色體臂間倒位（圖3）；（4）Y染色體變異（包括大Y和小Y）（圖4、5）。對類型（1）（2）分別加用N顯帶、C顯帶技術(shù)，以確認細胞核型分析結(jié)果（圖6、7）

2.2 染色體多態(tài)性與臨床表現(xiàn)的關(guān)系

在觀察到的141例染色體變異中，多態(tài)性變異為58例，占41.13%，其中D/G組短臂或隨體區(qū)延長15例，占10.6%（15/141）；次縊痕增加（包括1、9、16號染色體）9例，占6.4%（9/141）；9號染色體臂間倒位24例，占17.0%（24/141）。以上各類多態(tài)性變異的臨床表現(xiàn)歸納于表1。

表中涉及的其他臨床表現(xiàn)主要是與不良生殖效應(yīng)無關(guān)的臨床表現(xiàn)，如胎兒絨毛組織/羊水/臍血核型異常、智力低下等。由表1可知，具有不良生殖效應(yīng)患者的染色體多態(tài)性發(fā)生率明顯高于非生殖效應(yīng)的患者。

3 討論

染色體多態(tài)性主要表現(xiàn)為異染色質(zhì)的變異，特別是含有高度重復(fù)DNA的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，過去通常認為染色體多態(tài)性無明顯臨床效應(yīng)或病理意義。但近來較多研究表明，染色體多態(tài)性與生殖異常如流產(chǎn)、胚胎停育、死胎、畸胎及男性不育、異常等有關(guān)。[2-3]本文141例染色體變異中，染色體多態(tài)性有58例，與生殖異常相關(guān)的為47例，占81%。

3.1 D/G組短臂或隨體區(qū)延長與生殖異常

D/G組染色體即近端著絲粒染色體的次縊痕處與核仁形成有關(guān)，成為核仁形成區(qū)（necleolus-organizing region，NOR），應(yīng)用DNA-RNA分子雜交技術(shù)已證明該區(qū)含有人類18s和28s核糖體RNA（rRNA編碼結(jié)構(gòu)）的基因（rRNA）。石玉平等研究發(fā)現(xiàn)[4]，D/G組染色體的短臂增長部分是NOR rRNA高度重復(fù)的結(jié)果[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)[5]，NOR是人類染色體隨體聯(lián)合（satellite association，SA）的部位，NOR的活性變化可使D/G組染色體的隨體聯(lián)合頻率（SAF）增加[5]，可能影響染色體在生殖細胞形成過程中的正常分離，而使某些生殖細胞含有非整倍體染色體進而傳遞至受精卵，使其在早期卵裂過程中發(fā)生染色體不分離，最終導(dǎo)致非整倍體胚胎的產(chǎn)生，造成流產(chǎn)[6]。此外，D/G組染色體的隨體區(qū)與主縊痕區(qū)的著絲粒―動粒復(fù)合體（CKC）相鄰，CKC是細胞分裂中紡錘絲微管的著力點，是染色體運動和均等分離的結(jié)構(gòu)功能基礎(chǔ)，故隨體區(qū)的變異可能會導(dǎo)致近端著絲粒染色體的不分離，進而影響正常配子的形成及細胞的分裂分化，最終導(dǎo)致不良生殖效應(yīng)的發(fā)生。本研究所觀察到的15例D/G組染色體短臂或隨體區(qū)延長病例中，有13例發(fā)生了不良生殖效應(yīng)。

3.2 染色體次縊痕增長與生殖異常

人類染色體的次縊痕主要存在于1、9、16號染色體及Y染色體的長臂，本研究所觀察到的次縊痕增長病例也多發(fā)生于以上染色體。這些次縊痕常位于染色體的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)，次縊痕的增長是高度重復(fù)的DNA序列增加所致，此結(jié)論已用C顯帶法加以證實（圖7）。本文9例常染色體次縊痕增長的患者表現(xiàn)為早孕期胚停/流產(chǎn)3例，不孕、不育6例，其原因可能是由于高度重復(fù)的DNA序列增加，影響細胞分裂，造成同源染色體配對困難，產(chǎn)生不平衡的配子，形成非整倍體的子代而發(fā)生流產(chǎn)或不平衡的配子不能受精而死亡造成不孕不育[7]。另有研究報道[8]，高度重復(fù)的DNA序列增加除可影響染色體減數(shù)分裂外，還可能導(dǎo)致胚胎早期細胞分化時基因調(diào)節(jié)異常或劑量效應(yīng)造成有絲分裂錯誤，最終導(dǎo)致胎兒丟失或缺陷兒出生。

3.3 9號染色體臂間倒位與生殖異常

3.3.1 人類的每條染色體都可能發(fā)生臂間倒位，以9號染色體臂間倒位（inv（9））的發(fā)生率最高，國內(nèi)夏家輝等報道inv（9）的發(fā)生率為0.82%，其他倒位的發(fā)生率為0.09%。本文中inv（9）發(fā)生率為0.9%，略高于國內(nèi)報道。過去大部分學(xué)者認為inv（9）屬于一種染色體多態(tài)性表現(xiàn)，一般無病理意義。但近來較多研究發(fā)現(xiàn)并從一定理論層面上證實，inv（9）與生殖密切相關(guān)，并具有一定遺傳效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：在檢出的15例inv（9）患者中，（早孕期）胚停、流產(chǎn)者6例，占inv（9）的25%；不孕、不育者9例，占inv（9）的37.5%；與生殖異常臨床表征無關(guān)者9例，占inv（9）的37.5%。可見，在inv（9）患者中，有不良生殖效應(yīng)者占多數(shù)，該結(jié)果與近年來的研究結(jié)果相符合。

3.3.2 inv（9）的發(fā)生，對其配子形成也會產(chǎn)生相應(yīng)影響，進而影響生殖過程。理論上9號倒位攜帶者會形成4種配子：一種配子帶有正常染色體，一種配子帶有完整的倒位染色體，另外兩種配子有不同程度的重復(fù)和缺失。第一種配子是正常可育的，第二種大部分是可育的，但正常與否具有隨機性。后兩種配子的遺傳效應(yīng)，則主要取決于重復(fù)和缺失的片段長短以及它所包含的基因的致死效應(yīng)。發(fā)生倒位的片段越短，則重復(fù)和缺失的部分就越長，所形成的配子和合子正常發(fā)育的可能性就越小，引起的不良生殖效應(yīng)的可能性也就越大。但目前尚缺乏對這類人群的生殖細胞單倍體及減數(shù)分裂研究，如能將體細胞、生殖細胞及流產(chǎn)胚胎或子代體細胞染色體結(jié)合在一起綜合分析，必將為染色體臂間倒位遺傳效應(yīng)提供更多的線索。

3.4 Y染色體變異與生殖異常

人類Y染色體是最小的近端著絲粒染色體，分為兩個區(qū)域：擬常染色質(zhì)區(qū)和Y特異區(qū)。擬常染色質(zhì)區(qū)位于Y染色體兩端，與性染色體減數(shù)分裂有關(guān)；特異區(qū)占Y染色體的大部分，主要由異染色質(zhì)組成，易發(fā)生變化，與Y染色體多態(tài)性密切相關(guān)。

本研究檢出Y染色體長度變異10例，大Y 4例、小Y 6例，都與不良臨床生殖效應(yīng)有關(guān)，分別表現(xiàn)為胚停、流產(chǎn)、生成障礙等。Y染色體長度變異引起不良生殖效應(yīng)的機制目前尚未完全明確，現(xiàn)討論如下。

人類Y染色體短臂上存在決定分化的基因即決定因子（TDF），現(xiàn)認為Y染色體上性別決定區(qū)（SRY）是TDF的最佳候選基因。TDF定位于Yql2，SRY定位于Yqll.3。Y染色體的存在以及SRY基因的正常表達決定原始性腺發(fā)育成[9]。發(fā)生是一個復(fù)雜的生理過程，其間涉及眾多的基因。Y染色體長臂上具有基因（AZF），對男性的發(fā)生起著十分重要的作用，目前克隆和定位的Y連鎖的發(fā)生基因主要有RBM、DAZ、SPGY和TSPY。它們都是特異表達的，在形成過程中通過所表達的蛋白質(zhì)與各種RNA結(jié)合，控制和調(diào)節(jié)著發(fā)生的進程。若這些基因發(fā)生缺失、易位或突變都將影響正常的發(fā)生過程。另外還有一些生育協(xié)同基因，這些基因的協(xié)同作用才能維持男性正常生育能力。所以，Y染色體結(jié)構(gòu)的完整性是維持男性正常生育能力的關(guān)鍵[10]。

大Y染色體長度與Y染色體長臂DNA螺旋化程度改變有關(guān)，可能是Y染色體異染色質(zhì)區(qū)DNA過度重復(fù)影響生殖細胞在減數(shù)分裂時染色體配對聯(lián)會，使受精卵細胞分裂、分化異常，從而導(dǎo)致胎停育、缺陷兒出生[11]。Patricia等還認為[12]，Y染色體長臂DNA序列的重復(fù)復(fù)制會影響其有關(guān)分化和發(fā)育的基因正常表達，造成受精障礙或影響受精能力而導(dǎo)致流產(chǎn)頻率增高。

小Y染色體引起不良生殖效應(yīng)，可能是由于Y染色體異染色質(zhì)部分或完全丟失，導(dǎo)致常染色質(zhì)排列松散，結(jié)果造成其基因功能喪失和生成異常。目前，Y染色體的微小變異通過常規(guī)的細胞遺傳學(xué)方法不易檢測出來，還需做進一步的分子水平檢測才能明確。

綜上所述，染色體多態(tài)性與不良生殖效應(yīng)關(guān)系密切，因此在染色體多態(tài)攜帶者妊娠時，醫(yī)生應(yīng)建議其進行產(chǎn)前診斷，并告知其后代具有此類臨床效應(yīng)的可能性，從一定程度上實現(xiàn)出生缺陷干預(yù)，對優(yōu)生優(yōu)育有一定意義。

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篇2

自從1957年Waddington提出表觀遺傳學(xué)的概念后，表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)有了相當大的發(fā)展。表觀基因組學(xué)是在全基因組水平上研究表觀遺傳學(xué)標志及其與基因表達的相互關(guān)系。這一新興領(lǐng)域已對毒理學(xué)研究與實踐產(chǎn)生重大的影響。國內(nèi)，表觀遺傳學(xué)在毒理學(xué)研究已較深入地開展了一些研究，并發(fā)表了綜述。

1外源化學(xué)物的表觀遺傳毒性

基因表達的表觀遺傳調(diào)控是通過DNA甲基化，組蛋白編碼和相關(guān)的非編碼RNA(如miRNA)來完成的。3種機制各自的貢獻取決于特定基因及其環(huán)境，如物種，細胞類型，機體的發(fā)育階段和年齡，此外，每個因素可能受到其他因素的影響。因此，表觀基因組的調(diào)控是一個強大的和動態(tài)的綜合過程，在發(fā)育和維持分化狀態(tài)中起關(guān)鍵作用。雖然表觀基因組不是所有的改變預(yù)期都是有害的，但有些可能產(chǎn)生有害結(jié)果(如發(fā)育異常，增加疾病易感性等)。在體外，動物和人類的研究已經(jīng)確定了幾類環(huán)境化學(xué)物，可以修飾表觀遺傳標志，包括金屬、過氧化物酶體增殖劑、空氣污染物、毒物和內(nèi)分泌干擾物/生殖毒物。目前環(huán)境化學(xué)物表觀遺傳標志的研究大多數(shù)集中在DNA甲基化，只有少數(shù)研究涉及組蛋白修飾和miRNA(表1～3)。外源化學(xué)物引起表觀遺傳學(xué)改變可影響細胞應(yīng)激，并是潛在可逆的;也可能是可遺傳的。表觀遺傳毒性(epigenotoxicity)是指脫離外源化學(xué)物暴露后，可遺傳的有害改變。廣義的表觀遺傳毒性也可以包括外源化學(xué)物引起非遺傳的表觀遺傳學(xué)改變中介的外源化學(xué)物毒效應(yīng)。可遺傳的表觀遺傳毒性和表觀遺傳改變中介的毒效應(yīng)是有區(qū)別的。表觀遺傳毒性可以被分為有絲分裂的，減數(shù)分裂的或跨代遺傳的3類。表觀遺傳毒性這一新興研究領(lǐng)域?qū)Χ纠韺W(xué)產(chǎn)生了重大的影響。下文主要討論目前表觀遺傳毒性測試的主要發(fā)現(xiàn)及國際生命科學(xué)研究所(ILSI)“評估表觀遺傳變化”的研討會的意見。

2表觀遺傳毒性的主要發(fā)現(xiàn)

2.1化學(xué)致癌近年來在多種腫瘤細胞觀察到表觀遺傳事件。表觀遺傳事件可能引起基因表達的變化通過DNA甲基化，組蛋白修飾和/或染色質(zhì)重構(gòu)。并估計，在腫瘤細胞中檢測到甲基化變化的數(shù)目遠遠多于遺傳改變的數(shù)目。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳事件參與環(huán)境與職業(yè)因子誘發(fā)癌變進程的引發(fā)和進展。DNA甲基化異常對腫瘤發(fā)生有因果關(guān)系作用，甲基胞嘧啶增加突變可能性，增加致癌物結(jié)合，腫瘤抑制基因沉默，DNA修復(fù)基因沉默，癌的DNA低甲基化和遺傳學(xué)改變。組蛋白修飾可能通過影響DNA修復(fù)和細胞周期關(guān)卡，引起遺傳學(xué)改變。傳統(tǒng)的致癌性試驗可確定表觀遺傳修飾誘導(dǎo)腫瘤的可能性。許多不同的嚙齒類致肝癌物已被確定，而研究發(fā)現(xiàn)這些化合物的作用模式并無遺傳毒性，與人類也無關(guān)聯(lián)性。例如過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-A)介導(dǎo)的和構(gòu)成性雄甾烷受體(CAR)介導(dǎo)的嚙齒類動物癌變。肝腫瘤促長劑苯巴比妥(PB)，其與CAR的激活和隨后的效果相關(guān)。PB誘導(dǎo)的嚙齒類表觀遺傳學(xué)改變包括甲基化改變的區(qū)域，基因表達的特殊改變和外源性及內(nèi)源性化合物的代謝。持續(xù)的核受體介導(dǎo)的肝臟致癌物的分子分析，將更加明確地表征每個受試化合物的作用模式。表觀基因組正常變異性的表征和與處理相關(guān)的表觀遺傳學(xué)影響的理解，將是研究致癌作用模式的巨大挑戰(zhàn)。

2.2遺傳毒理學(xué)評價化學(xué)物引起遺傳損傷的能力是風(fēng)險評定的重要內(nèi)容。表觀遺傳學(xué)影響基因表達的可遺傳的變化可能構(gòu)成遺傳毒性。表觀遺傳導(dǎo)致基因改變的機制包括:錯配修復(fù)基因表觀遺傳缺陷，增加DNA修復(fù)基因表觀遺傳缺陷與癌癥特定突變譜相關(guān)，參與雙鏈斷裂修復(fù)的基因的表觀遺傳失活，有絲分裂關(guān)卡基因表觀遺傳缺陷，致癌物解毒基因與甲基胞嘧啶突變可能性增加，DNA全面低甲基化和染色體不穩(wěn)定等。已經(jīng)確定表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤形成中具有一定的作用。在腫瘤發(fā)展過程中DNA甲基化模式的改變往往是最早觀察到的分子事件。甲基胞嘧啶(5meC)已知是C∶G至T∶A轉(zhuǎn)換突變的熱點，起因于胞嘧啶自發(fā)性水解和酶脫氨基率的增加和DNA修復(fù)降低。增加的5meC脫氨基率和T堿基修復(fù)受限可解釋在CpG位點突變頻率的增加。人類腫瘤p53基因突變的1/4和腫瘤抑制基因p16的C-T轉(zhuǎn)換的1/3已知會發(fā)生在CpG位點上。突變的增加也可能來自于飲食中甲基供體的不足。已證明葉酸補充劑能減少潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險和和預(yù)防結(jié)腸癌細胞p53突變。參與葉酸代謝的酶遺傳多態(tài)性影響表觀遺傳標志，改變SAM水平，并能調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的風(fēng)險。也已提出DNA氧化性損傷在癌癥的發(fā)生、心血管疾病和衰老中所起的作用。8-羥基鳥嘌呤(8oxoG)改變了CpG二核苷酸相鄰的C的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可能改變DNA甲基化。在CpG內(nèi)C5-位的損傷影響DNA甲基化。在體外，5meC和5-氯C因啟動子甲基化引起次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hgprt)基因的沉默。此外，CpG內(nèi)的8oxoG和HmC或顯著減少結(jié)合于DNA的MeCP2，并直接導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。光二聚物，烷基化堿基，脫堿基位點，以及鏈斷裂也會誘導(dǎo)DNA的甲基化變化。對性細胞的致突變性將于下文討論。體外哺乳動物細胞基因突變試驗?zāi)軌蚝Y選表觀遺傳學(xué)介導(dǎo)的危害。例如，在不同嚙齒類細胞系經(jīng)5-氮胞苷處理TK基因可恢復(fù)活性。此外，DNA合成抑制劑3-疊氮基-3-脫氧胸苷(AZT)可引起TK位點超甲基化。應(yīng)進一步開發(fā)篩選試驗以確定表觀遺傳學(xué)中介的遺傳毒性。

2.3發(fā)育與生殖的表觀遺傳毒理學(xué)完全分化的體細胞，在正常情況下，將有相對穩(wěn)定的表觀基因組傳遞到子代細胞。但在哺乳動物的發(fā)育過程中，早期胚胎發(fā)育過程(著床前)，以及在子宮內(nèi)原始生殖細胞的發(fā)育過程中，有兩個表觀遺傳學(xué)的重編程階段，重新設(shè)置DNA的甲基化模式。這兩個發(fā)育的表觀遺傳重編程事件有可能是破壞表觀遺傳編程的敏感窗口。發(fā)育和生殖毒理學(xué)家特別感興趣的是毒物暴露是否可以直接改變發(fā)育的表觀基因組，有害的表型是否可跨代遺傳，及因此存在的潛在危害。表觀遺傳編程紊亂可能有助于對表型的跨代遺傳。使用Avy小鼠(黃色刺小鼠)模型，飲食暴露雙酚A，使Avy和CabpIAP亞穩(wěn)外延等位基因低甲基化。甲基供體膳食補充劑或染料木素可抵消此低甲基化效應(yīng)。這些結(jié)果與造成表觀遺傳影響的其他內(nèi)分泌干擾物報告一致。在環(huán)境相關(guān)水平低濃度的雙酚A(1.2和2.4μg/kg體重)對大鼠可誘導(dǎo)跨代遺傳表型異常。暴露于雙酚A圍生期雄性后代的計數(shù)和活力降低，并在F3代持續(xù)這些表型。甲氧滴滴涕和乙烯菌核利在子宮中暴露也會導(dǎo)致跨代生殖遺傳表型異常。雖然甲氧氯和乙烯菌核利在高于人類接觸的劑量觀察到病理學(xué)改變，但此研究提供了一個模型來研究表觀遺傳跨代的機制。已證明，乙烯菌核利暴露后破壞了多達3代的小鼠一些印跡基因甲基化模式，這表明跨代遺傳異常的表型也有表觀遺傳的基礎(chǔ)。

2.4免疫毒理學(xué)已發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控多能幼稚輔T細胞(Th)分化的啟動和其效應(yīng)亞群的成熟。啟動后不久，幼稚T細胞同時轉(zhuǎn)錄低水平的Th1(CD4)和Th2(CD8)細胞因子，包括IL-2。在選擇性轉(zhuǎn)錄成為Ifng(Th1細胞因子標記)或Th2細胞因子基因(IL-4和IL-5，IL-13)之前需要幾次復(fù)制。在體外用5-aza誘導(dǎo)T細胞，導(dǎo)致由早先不產(chǎn)生這些細胞因子的T細胞系產(chǎn)生IL-2和IFN-g。在用組蛋白去乙酰酶抑制劑處理的CD4T細胞研究證實干擾素IFN-G和Th2型細胞因子的表達增強。上述研究結(jié)果表明，表觀遺傳機制是Th細胞分化和功能的關(guān)鍵因素。盡管與小鼠相比，人類IFNG基因缺乏脫甲基化，分化的人類Th細胞CpG甲基化分析顯示出與小鼠類似的結(jié)果。將化學(xué)物誘導(dǎo)的小鼠T細胞分化的表觀遺傳學(xué)改變數(shù)據(jù)外推到人應(yīng)要謹慎。

2.5其他終點從鼠類模型或單一基因的表觀遺傳學(xué)的某些成果已被外推于人類疾病原因。表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)的表型被認為是人類疾病的起源有待進一步的研究，特別是確定表觀遺傳的正常變異和評價表觀遺傳影響需要適當?shù)膶嶒炘O(shè)計和對照。已經(jīng)提出，內(nèi)分泌干擾物的表觀遺傳毒性可能導(dǎo)致暴露人群的許多發(fā)育，代謝和行為障礙。對其他靶器官或終點的表觀遺傳毒性還有待研究。

2.6檢測流程和模型Szyf2007年對檢測表觀遺傳毒性提出的研究思路為:①在生命一個時間點的環(huán)境暴露可能會改變表觀遺傳編程，導(dǎo)致穩(wěn)定改變表型和反應(yīng)性，②毒物暴露可能導(dǎo)致表觀遺傳重編程，導(dǎo)致生命后期表型的變異。Reamon-Buettner和Borlak提出使用動物模型(如鼠類)環(huán)境暴露后分析表觀遺傳機制的研究方案，見圖1。已推薦了檢測表觀遺傳毒性的動物模型，特別是Avy小鼠和Axin1融合(Axin1Fu)小鼠能用于研究表觀遺傳學(xué)和發(fā)育畸形之間的聯(lián)系，因為在特定的DNA甲基化模式的改變可以與小鼠遺傳疾病廣泛鏈接。

3ILSI的“評估表觀遺傳變化”研討會

2009年10月ILSI的健康與環(huán)境科學(xué)研究所(IL-SI/HESI)主辦“評估表觀遺傳變化”研討會，評估和提高表觀遺傳學(xué)方面的科學(xué)知識基礎(chǔ)及其在疾病中的作用，包括跨代的表觀遺傳變化的影響，還討論了將表觀遺傳納入安全性評價的幾個問題。

3.1可能用于評價化學(xué)物產(chǎn)生表觀遺傳毒性的模型系統(tǒng)大鼠和/或兔可能是評價外源化學(xué)物產(chǎn)生表觀遺傳變化影響F1和/或F2和F3代的適當?shù)哪Ｐ汀Ｐ∈罂赡苁歉子谔幚淼哪Ｐ停驗樾∈蠡蚪M有更多的數(shù)據(jù)，并已有用于檢測表觀遺傳變化的工具。已建議Avy小鼠模型作為潛在的篩查工具，其毛色受亞穩(wěn)Avy等位基因IAP隱蔽啟動子附近CpGs甲基化狀態(tài)的影響。然而，Avy小鼠模型用于篩選可能過于敏感。其他可能的模型包括斑馬魚和秀麗隱桿線蟲，以及蜜蜂和果蠅。體外模型是使用哺乳動物細胞或利用干細胞。干細胞包括其他物種不存在的印跡基因。印跡基因有可能作為確定表觀遺傳改變的感應(yīng)器。以上討論的模型有可能用于潛在危害識別，并提供機制基礎(chǔ)。然而，將很難直接解釋這些數(shù)據(jù)對整體動物和人類的意義。在表觀遺傳模型轉(zhuǎn)化為管理決策測試之前，需要進行大量的基礎(chǔ)工作和驗證研究。

3.2可能評價的終點/靶對于表觀遺傳變化的指標，應(yīng)確定適應(yīng)反應(yīng)還是有害反應(yīng)。確定表觀遺傳修飾與可能提示特定有害影響的疾病相關(guān)基因表達改變之間的因果關(guān)系或強的關(guān)聯(lián)需要表型錨定。在發(fā)現(xiàn)受影響的表觀遺傳效應(yīng)的基因與某種疾病相關(guān)的基礎(chǔ)上，應(yīng)建立由表觀遺傳機制調(diào)控的基因數(shù)據(jù)庫。表觀遺傳效應(yīng)很可能有物種，組織，暴露和時間特異性。目前，在研究中實驗對照組是化合物反應(yīng)表觀遺傳變化的最適當?shù)膮⒄眨⒈碛^遺傳印跡的參考對照范圍可能是有意義的，因為這些區(qū)域甲基化模式可能更趨于穩(wěn)定和遺傳。

3.3可能應(yīng)用的技術(shù)關(guān)于DNA甲基化和miRNA，以陣列為基礎(chǔ)的平臺，針對人類和小鼠樣品已優(yōu)化。針對大鼠可用的工具有限，但可用根據(jù)大鼠基因組序列基于陣列的高通量方法。雖然硫酸氫鹽為基礎(chǔ)的測序評價DNA甲基化方法可用于所有物種，但需要發(fā)展高通量測序方法。區(qū)分異常信號和背景信號并不容易，最大的挑戰(zhàn)將是數(shù)據(jù)分析和解釋，應(yīng)發(fā)展信息學(xué)。

3.4管理機構(gòu)的觀點為了將表觀遺傳毒性納入風(fēng)險評定，有很多的考慮。必須明確的問題，理解環(huán)境、營養(yǎng)和/或藥物暴露對個人，群體及跨代水平的公共健康的潛在長期影響，界定希望解決的問題，確定模型系統(tǒng)。這就需要努力使與有害結(jié)局和基線改變相聯(lián)系的研究設(shè)計、方法和模型標準化。以適當?shù)膮⒖蓟衔铩⑼緩胶蛣┝框炞C該模型。模型試驗檢測的任何變化必須以合理的方式鏈接到表型或臨床結(jié)局。對于法規(guī)測試，方法必須標準化，具有重復(fù)性和重現(xiàn)性。為了將表觀遺傳數(shù)據(jù)有效地納入人類風(fēng)險評定，最好與管理機構(gòu)共同努力，確定一個正常基線范圍，并與有害結(jié)局關(guān)聯(lián)，界定公共衛(wèi)生關(guān)注的適當水平。管理機構(gòu)將需要開發(fā)分析工具，以對公共健康方面的數(shù)據(jù)進行解釋，并將此類數(shù)據(jù)應(yīng)用于風(fēng)險評定模式和慢性健康結(jié)局。

篇3

【關(guān)鍵詞】黑皮質(zhì)素受體-1；基因；表型

【中圖分類號】R751【文獻標識碼】A【文章編號】1008-6455（2011）04-0541-01

不同人種皮膚和毛發(fā)顏色差異是人類最為顯著的特性之一。人類皮膚顏色差異是由遺傳學(xué)控制的。皮膚色素遺傳學(xué)研究已遠落后于人種皮膚顏色表型多樣性和原因?qū)W的研究，尤其是鼠皮毛色素調(diào)節(jié)基因逐個被研究發(fā)現(xiàn)（在已知127個鼠色素形成基因中， 有60個已被證實是人類種間同源基因[1]）已使狀況大為改觀。

人類皮膚色素形成具有半孟德爾遺傳模式，有多基因特性，由主要基因和修飾基因共同作用形成。色素形成是外界環(huán)境影響下的各種基因同步化相互作用的一大性狀[2]。

黑素合成生物化學(xué)和酶學(xué)方面的新發(fā)展使人們對黑素合成的遺傳調(diào)節(jié)過程有了深入的了解。 在眾多變異基因中，能影響人黑素細胞功能的有 MC1R （黑皮質(zhì)素受體-1），P基因，和TYRP 及SILV基因家族成員等。其中，MC1R表達于人黑素細胞，MC1R和α-MSH和ACTH有親近性（α-MSH：α-促黑素細胞激素和ACTH均可促進黑素形成而使皮膚著色），一旦黑皮質(zhì)素肽結(jié)合MC1R，就會刺激黑素的形成；而P基因及TYRP 和SILV基因家族成員可直接在黑素細胞內(nèi)組裝并參與黑素小體形成。

在這里，我們主要強調(diào)MC1R與不同人種皮膚顏色形成的關(guān)系；MC1R關(guān)聯(lián)的不同人種皮膚顏色表型-基因型關(guān)系及MC1R基因序列多樣性譜三方面內(nèi)容。

1 MC1R與不同人種皮膚顏色形成

MC1R編碼產(chǎn)生317個氨基酸的前蛋白，如同G-蛋白受體，MC1R有50個外顯子，不含內(nèi)含子（無明顯生理學(xué)意義）。MC1R的N端有15NSTP18和29NQTG32兩個糖基化氨基酸殘基序列 ，N端糖基化有何作用還不明確。[3]黑皮質(zhì)素家族還包括其他四種受體: MC2R（ACTH受體）; MC3R 和 MC4R（在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮效應(yīng)）及MC5R（主要調(diào)節(jié)鼠皮脂腺功能，可能同樣作用于人類）[4]。

MC1R 是鼠類基因座的人類同系物，而鼠類基因座已證實可調(diào)節(jié)鼠皮毛真黑素和褐黑素的形成。在人類，真黑素的合成依賴黑素細胞表達功能性MC1R及聯(lián)結(jié)α-促黑素細胞激素共同起作用。MC1R被認為是決定人類毛發(fā)和皮膚顏色的主要基因之一，已被成功克隆，同時發(fā)現(xiàn)其位點在16q24.3。

Cone等猜想MC1R多態(tài)性可能是造成人類皮膚顏色差異的主要原因。紅發(fā)白皮膚北歐人表現(xiàn)了MC1R 多態(tài)性，減低了皮膚曬黑的能力，卻增加了皮膚黑色素瘤和其他皮膚腫瘤的危險性[5]。與此同時，進入歐亞大陸的人類，因日光較少緣故，MC1R等位基因未產(chǎn)生明顯變異，所以這一人群未產(chǎn)生黑色皮膚。最近進行的MC1R啟動子功能模型研究對放松性選擇提出了質(zhì)疑，認為亞洲人和歐洲人的一些MC1R變異是純化和多樣化選擇活動之結(jié)果[6]。也有研究說明人類于不同時間不同區(qū)域發(fā)生的皮膚顏色進化與自然選擇相關(guān)聯(lián)，它導(dǎo)致了深淺膚色表型不受約束的進化及包括可能的皮膚著色和失色過程。

2 MC1R基因型-表型與不同人種皮膚顏色

MC1R基因編碼區(qū)具有高度多態(tài)性，已有超過35個分隔位點被確定[7]。在亞洲人種，雖然功能性R163Q 位點變異較常見，但研究仍很缺乏。而編碼區(qū)外的基因序列變異不對不同人種皮膚顏色差異起作用。

對人類，家族，人口以及相關(guān)疾病研究表明了MC1R多樣性與一系列重復(fù)表型息息相關(guān)。例如R151C位點, R160W 位點和 D294H位點改變關(guān)聯(lián)著紅發(fā)白皮膚人種，因為大多數(shù)紅發(fā)人種不是這些相關(guān)基因改變的純合子就是復(fù)合雜合子。大約10-20% 的紅發(fā)個體因某一個等位基因改變，從而顯現(xiàn)出淺紅色皮膚外觀；對于已潛在喪失兩個功能性等位基因的個體則表現(xiàn)出金發(fā)碧眼外觀 。在英國北部，超過40% 的人口具有一些已知重要下調(diào)作用的等位基因，諸如如R151C 或 R160W。

另外，以此上這些具有下調(diào)作用的功能性等位基因的重要性為標準，其他一系列表型特征也很容易被聯(lián)想到，包括反復(fù)日曬產(chǎn)生燒傷趨勢超過曬黑趨勢;客觀評價雀斑和痣[8]以及黑色素瘤和其他皮膚腫瘤。

MC1R發(fā)揮日曬保護作用不是通過黑色素的數(shù)量及類型，可能借助其他無色素的機制起作用的，畢竟腫瘤產(chǎn)生于不同的細胞類型，它在日光誘導(dǎo)下發(fā)生，不會只是特異的單一細胞類型作用結(jié)果，如單一的黑色素細胞。在一項針對意大利人和美國人總體做的研究表明MC1R變異會使BRAF基因變異的黑色素瘤發(fā)生惡變的可能性增加。MCIR相關(guān)作用機制還不是完全清楚，需要進行更多研究去弄清內(nèi)在關(guān)聯(lián)。[9]

3 MC1R基因序列多樣性譜

由于MC1R基因多樣性存在著程度問題，這也使早期的綜合性研究變得混淆不清。在早期的研究中，盡管說明了一些基因變異聯(lián)系著紅發(fā)白皮膚人種的表型，但不能指出最最有影響力的，且只證實小部分人群所具有的共有序列，對于遺傳方式仍不清楚。隨后的關(guān)聯(lián)性、家族性研究及功能性研究，只部分地認識了一些等位基因的作用，包括 R151C, R160W 和 D294H 及其他一些等位基因。有很多仍無法弄清; 另外，家族性研究也提示V60L模型是一種緩慢作用的功能下調(diào)性等位基因，而對于其他一些等位基因，諸如D84E,其功能狀態(tài)依然不清楚且有矛盾的結(jié)果產(chǎn)生[10]。

4 結(jié)語

總之，人類皮膚顏色的遺傳學(xué)研究尚處于初步探索階段，需進一步了解影響皮膚顏色表型基因位點多態(tài)現(xiàn)象的水平，效應(yīng)及其相互作用。對MC1R研究，今后的重點依然是是確定其哪一等位基因起顯著意義，更多的聯(lián)系其有價值的表型特征，進一步擴大皮膚顏色遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究價值。

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篇4

1 理論分子群體遺傳學(xué)的發(fā).展簡史

經(jīng)典群體遺傳學(xué)最早起源于英國數(shù)學(xué)家哈迪和德國醫(yī)學(xué)家溫伯格于1908年提出的遺傳平衡定律。以后， 英國數(shù)學(xué)家費希爾、遺傳學(xué)家霍爾丹(Haldane JBS)和美國遺傳學(xué)家賴特(Wright S)等建立了群體遺傳學(xué)的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)及相關(guān)計算方法， 從而初步形成了群體遺傳學(xué)理論體系， 群體遺傳學(xué)也逐步發(fā)展成為一門獨立的學(xué)科。群體遺傳學(xué)是研究生物群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的科學(xué)， 它應(yīng)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)的原理和方法研究生物群體中基因頻率和基因型頻率的變化， 以及影響這些變化的環(huán)境選擇效應(yīng)、遺傳突變作用、遷移及遺傳漂變等因素與遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)系， 由此來探討生物進化的機制并為育種工作提供理論基礎(chǔ)。從某種意義上來說， 生物進化就是群體遺傳結(jié)構(gòu)持續(xù)變化和演變的過程， 因此群體遺傳學(xué)理論在生物進化機制特別是種內(nèi)進化機制的研究中有著重要作用[1]。

在20世紀60年代以前， 群體遺傳學(xué)主要還只涉及到群體遺傳結(jié)構(gòu)短期的變化， 這是由于人們的壽命與進化時間相比極為短暫， 以至于沒有辦法探測經(jīng)過長期進化后群體遺傳的遺傳變化或者基因的進化變異， 只好簡單地用短期變化的延續(xù)來推測長期進化的過程。而利用大分子序列特別是DNA序列變異來進行群體遺傳學(xué)研究后， 人們可以從數(shù)量上精確地推知群體的進化演變， 并可檢驗以往關(guān)于長期進化或遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定性推論的可靠程度[1]。同時， 對生物群體中同源大分子序列變異式樣的研究也使人們開始重新審視達爾文的以“自然選擇”為核心的生物進化學(xué)說。20世紀60年代末、70年代初， Kimura[2]、King和Jukes[3]相繼提出了中性突變的隨機漂變學(xué)說: 認為多數(shù)大分子的進化變異是選擇性中性突變隨機固定的結(jié)果。此后， 分子進化的中性學(xué)說得到進一步完善[4]， 如Ohno[5]關(guān)于復(fù)制在進化中的作用假說: 認為進化的發(fā)生主要是重復(fù)基因獲得了新的功能， 自然選擇只不過是保持基因原有功能的機制; 最近Britten[6]甚至推斷幾乎所有的人類基因都來自于古老的復(fù)制事件。盡管中性學(xué)說也存在理論和實驗方法的缺陷， 但是它為分子進化的非中性檢測提供了必要的理論基礎(chǔ)[7]。目前， “選擇學(xué)說”和“中性進化學(xué)說”仍然是分子群體遺傳學(xué)界討論的焦點。

1971年， Kimura[8]最先明確地提出了分子群體遺傳學(xué)這一新的學(xué)說。其后， Nei從理論上對分子群體遺傳學(xué)進行了比較系統(tǒng)的闡述。1975年， Watterson[9]估算了基于替代模型下的DNA多態(tài)性的參數(shù)Theta(θ)值和期望方差。1982年， 英國數(shù)學(xué)家Kingman[10， 11]構(gòu)建了“溯祖”原理的基本框架， 從而使得以少量的樣本來代表整個群體進行群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究成為可能， 并可以進一步推斷影響遺傳結(jié)構(gòu)形成的各種演化因素。溯祖原理的“回溯”分析使得對群體進化歷史的推測更加合理和可信。1983年， Tajima[12]推導(dǎo)了核甘酸多樣度參數(shù)Pi(π)的數(shù)學(xué)期望值和方差值。此后， 隨著中性平衡的相關(guān)測驗方法等的相繼提出[13~15]， 分子群體遺傳學(xué)的理論及分析方法日趨完善[16]。

近20年來， 在分子群體遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上， 又衍生出一些新興學(xué)科分支， 如分子系統(tǒng)地理學(xué)(molecular phylogeography)等。系統(tǒng)地理學(xué)的概念于1987年由Avise提出， 其強調(diào)的是一個物種的基因系譜當前地理分布方式的歷史成因[17]， 同時對物種擴散、遷移等微進化歷史等進行有效的推測[18]。

2 實驗植物分子群體遺傳研究內(nèi)容及進展

基于DNA序列變異檢測手段的實驗分子群體遺傳學(xué)研究始于1983年， 以Kreitman[19]發(fā)表的“黑腹果蠅的乙醇脫氫酶基因位點的核苷酸多態(tài)性”一文為標志。以植物為研究對象的實驗分子群體遺傳學(xué)論文最早發(fā)表于20世紀90年代初期[20， 21]， 但是由于當時DNA測序費用昂貴等原因， 植物分子群體遺傳學(xué)最初發(fā)展比較緩慢， 隨著DNA測序逐漸成為實驗室常規(guī)的實驗技術(shù)之一以及基于溯祖理論的各種計算機軟件分析程序的開發(fā)和應(yīng)用， 實驗分子群體遺傳學(xué)近10年來得到了迅速的發(fā)展， 相關(guān)研究論文逐年增多， 研究的植物對象主要集中在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)及重要的農(nóng)作物如玉米(Zea mays L.)、大麥(Hordeum vulgare L.)， 水稻(Orazy sativa L.)、高粱(Sorghum bicolor L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)等上[16]。其研究內(nèi)容涵蓋了群體遺傳結(jié)構(gòu)(同源DNA分化式樣)、各種進化力量如突變， 重組， 連鎖不平衡、選擇等對遺傳結(jié)構(gòu)的影響、群體內(nèi)基因進化方式(中性或者適應(yīng)性進化)、群體間的遺傳分化及基因流等。同時， 通過對栽培物種與野生祖先種或野生近緣種的DNA多態(tài)性比較研究， 分子群體遺傳學(xué)在研究作物馴化的遺傳學(xué)原因及結(jié)果等也取得了重要的進展， 如作物馴化的遺傳瓶頸， 人工選擇對“馴化基因”核苷酸多態(tài)性的選擇性清除(selective sweep)作用等等。

2.1 植物基因或基因組DNA多態(tài)性

分子群體遺傳學(xué)的研究基礎(chǔ)是DNA序列變異。同源DNA序列的遺傳分化程度是衡量群體遺傳結(jié)構(gòu)的主要指標， 其分化式樣則是理解群體遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生和維持的進化內(nèi)在驅(qū)動力諸如遺傳突變、重組、基因轉(zhuǎn)換的前提。隨著DNA測序越來越快捷便利及分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， 越來越多的全基因組序列或者基因序列的測序結(jié)果被發(fā)表， 基因在物種或群體中的DNA多態(tài)性式樣也越來越多地被闡明。

植物中， 對擬南芥和玉米基因組的DNA多態(tài)性的調(diào)查最為系統(tǒng)， 研究報道也較多。例如， Nordborg等[22]對96個樣本組成的擬南芥群體中的876個同源基因片段(0.48 Mbp)的序列單核苷酸多態(tài)性進行了調(diào)查， 共檢測到17 000多個SNP， 大約平均每30 bp就存在1個SNP位點。而Schmid等[23]的研究結(jié)果顯示: 擬南芥基因組核甘酸多態(tài)性平均為0.007( W)。Tenaillon等[24]對22個玉米植株的1號染色體上21個基因共14 420 bp序列的分析結(jié)果顯示玉米具有較高的DNA多態(tài)性(1SNP/27.6 bp、 =0.0096)。Ching等[25]研究顯示: 36份玉米優(yōu)系的18個基因位點的非編碼區(qū)平均核苷酸多態(tài)性為1SNP/31 bp， 編碼區(qū)平均為1SNP/124 bp， 位點缺矢和插入則主要出現(xiàn)在非編碼區(qū)。此外， 其他物種如向日葵、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、高粱、火矩松(Pinus taeda L.)、花旗松(Douglas fir)等[26～30]中部分基因位點的DNA多態(tài)性也得到調(diào)查， 結(jié)果表明不同的物種的DNA多態(tài)性存在較大的差異。

繁育方式是顯著影響植物基因組的DNA多態(tài)性重要因素之一。通常來說， 自交物種往往比異交物種的遺傳多態(tài)性低， 這已經(jīng)被一些親緣關(guān)系相近但繁育方式不同的物種如Lycopersicon屬植物和Leavenworthia屬植物的種間比較研究所證實[31， 32]。但是在擬南芥屬中則不然， Savolainen等[33]比較了不同繁育方式的兩個近緣種Arabidopsis thaliana(自交種)和Arabidopsis lyrata(異交種)的乙醇脫氫酶基因(Alcohol Dehydrogenase)的核苷酸多態(tài)性， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)A. thaliana的核苷酸多態(tài)性參數(shù)Pi值為0.0069， 遠高于A. lyrata的核苷酸多態(tài)性(Pi=0.0038)。

2.2 連鎖不平衡

不同位點的等位基因在遺傳上不總是獨立的， 其連鎖不平衡程度在構(gòu)建遺傳圖譜進行分子育種及圖位克隆等方面具有重要的參考價值。Rafalski和Morgante等[34]在比較玉米和人類群體的連鎖不平衡和重組的異同時對連鎖不平衡的影響因素做了全面的闡述， 這些因素包括繁育系統(tǒng)、重組率、群體遺傳隔離、居群亞結(jié)構(gòu)、選擇作用、群體大小、遺傳突變率、基因組重排以及其他隨機因素等。物種的繁育系統(tǒng)對連鎖不平衡程度具有決定性的影響， 通常來說， 自交物種的連鎖不平衡水平較高， 而異交物種的連鎖不平衡水平相對較低。但是也有例外， 如野生大麥屬于自交物種， 然而它的連鎖不平衡水平極低[35~37]。

擬南芥是典型的自交植物， 研究表明: 擬南芥組基因大多數(shù)位點的連鎖不平衡存在于15～25 kb左右的基因組距離內(nèi)[22]， 但是在特定位點如控制開花時間的基因及鄰接區(qū)域， 連鎖不平衡達到250 kb的距離[38]。擬南芥基因組高度變異區(qū)段同樣具有較強的連鎖不平衡[39]。這些研究結(jié)果說明擬南芥非常適合構(gòu)建連鎖圖譜， 因為用少量的樣本就可以組成一個有效的作圖群體。除擬南芥外， 其它自交物種大多表現(xiàn)出較高的連鎖不平衡水平， 如大豆的連鎖不平衡大于50 kb[40]; 栽培高粱的連鎖不平衡大于15 kb[41]; 水稻的Xa位點連鎖不平衡可以達到100 kb以上[42]。

與大多數(shù)自交物種相比， 異交物種的連鎖不平衡程度則要低得多。例如， 玉米的1號染色體的體連鎖不平衡衰退十分迅速，大約200 bp距離就變得十分微弱[24]， 但是在特定的玉米群體如遺傳狹窄的群體或者特定基因位點如受到人工選擇的位點， 連鎖不平衡水平會有所增強[43~46]。野生向日葵中， 連鎖不平衡超過200 bp的距離就很難檢測到(r=0.10)， 而栽培向日葵群體連鎖不平衡程度則可能夠達到約1 100 bp的距離(r=0.10)[26]。馬鈴薯的連鎖不平衡在短距離內(nèi)下降迅速(1 kb降到r2=0.2左右)， 但在1Kb以外下降卻十分緩慢(10 cM降到r2=0.1)[27]。此外， 異交繁育類型的森林樹種如火矩松、花旗松等同樣顯示出低水平的連鎖不平衡[30， 31]。

轉(zhuǎn)貼于 2.3 基因組重組對DNA多態(tài)性的影響

基因組的遺傳重組是指二倍體或者多倍體植物或者動物減數(shù)分裂時發(fā)生的同源染色體之間的交換或者轉(zhuǎn)換[47]。它通過打破遺傳連鎖而影響群體的DNA多態(tài)性式樣， 其在基因組具點發(fā)生的概率與該位點的結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系， 基因組上往往存在重組熱點區(qū)域， 如玉米的bronze(bz)位點， 其重組率高于基因組平均水平100倍以上[48]; 并且重組主要發(fā)生在染色體上的基因區(qū)域， 而不是基因間隔區(qū)[49， 50]。同時， 在基因密度高的染色體區(qū)段比基因密度低的染色體區(qū)段發(fā)生重組的頻率也要高得多[41， 51]; 在不同的物種中， 基因組重組率平均水平也有很大的差異。如大麥群體基因組的重組率為 =7～8×10–3 [52]，高于擬南芥( =2×10–4)40倍[27]， 但只有玉米( =12～14×10–3)的一半左右[24]。

目前有很多關(guān)于重組和DNA多態(tài)性之間的相關(guān)關(guān)系的研究， 但是沒有得到一致的結(jié)論。部分研究顯示重組對DNA多態(tài)性具有較強的影響。如Tenaillon等[24]研究顯示玉米1號染色體的DNA多態(tài)性高低與重組率具有較高的相關(guān)性(r=0.65， P=0.007)， 野生玉米群體、大麥及野生番茄也都存在同樣的現(xiàn)象[52~54]。而在擬南芥中， 重組對DNA多態(tài)性的貢獻率就非常低[22]。Schmid等[23]用大量的基因位點對擬南芥群體的核苷酸多態(tài)性進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn): 重組率與核苷酸多態(tài)性相關(guān)關(guān)系不顯著; Wright等[55]調(diào)查了擬南芥1號和2號染色體的6個自然群體序列變異式樣， 結(jié)果顯示， 在著絲粒附近重組被抑制的染色體區(qū)域， 核苷酸多態(tài)性并沒有隨之降低。說明了擬南芥基因組的重組率與DNA多態(tài)性并沒有必然的相關(guān)關(guān)系。Baudry等[31]對番茄屬內(nèi)5個種進行了比較研究， 結(jié)果也顯示重組對種群間的DNA多態(tài)性的影響也不明顯。

2.4 基因進化方式(中性進化或適應(yīng)性進化)

分子群體遺傳學(xué)有兩種關(guān)于分子進化的觀點: 一種是新達爾文主義的自然選擇學(xué)說， 認為在適應(yīng)性進化過程中， 自然選擇在分子進化起重要作用， 突變起著次要的作用。新達爾文主義的主要觀點包括: 任何自然群體中經(jīng)常均存在足夠的遺傳變異， 以對付任何選擇壓力; 就功能來說， 突變是隨機的; 進化幾乎完全取決于環(huán)境變化和自然選擇; 一個自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)往往對它生存的環(huán)境處于或者接近于最適合狀態(tài); 在環(huán)境沒有發(fā)生改變的情況下， 新突變均是有害的[56]。另一種是日本學(xué)者Kimura為代表的中性學(xué)說， 認為在分子水平上， 種內(nèi)的遺傳變異(蛋白質(zhì)或者DNA序列多態(tài)性)為選擇中性或者近中性， 種內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)通過注入突變和隨機漂變之間的平衡來維持， 生物的進化則是通過選擇性突變的隨機固定(有限群體的隨機樣本漂移)來實現(xiàn)， 即認為遺傳漂變是進化的主要原因， 選擇不占主導(dǎo)地位[2~4]。這兩種學(xué)說， 在實驗植物分子群體遺傳學(xué)的研究中都能得到一定的支持。

對植物基因在種內(nèi)進化方式的研究主要集中在擬南芥菜、玉米、大麥等農(nóng)作物及少數(shù)森林樹種。Wright和Gaut[16]對2005以前發(fā)表的相關(guān)文章進行詳細的統(tǒng)計， 結(jié)果顯示: 擬南芥中大約有30%的基因表現(xiàn)為適應(yīng)性進化; 玉米中大約有24%的基因表現(xiàn)為非中性進化; 大麥的9個基因中， 有4個受到了選擇作用的影響。

選擇作用主要包括正向選擇、平衡選擇、背景選擇及穩(wěn)定選擇， 它們單獨或者聯(lián)合對特定基因的進化方式產(chǎn)生影響。如花旗松中的控制木材質(zhì)量和冷硬性狀的基因[30]、火炬松的耐旱基因[29]、歐洲山楊(European aspen)的食草動物誘導(dǎo)的蛋白酶抑制基因(Herbivore-induced Protease Inhibitor)等[57]， 經(jīng)檢測在各自的群體受到了正向選擇、平衡選擇、背景選擇單獨或者多重影響。植物抗性基因(R基因)是研究得比較深入的一類基因， 大部分研究結(jié)果顯示抗性基因具有高度的多態(tài)性， 并經(jīng)受了復(fù)雜的選擇作用[58]。Liu和Burke[26]對栽培大麥和野生大麥群體中9個基因在調(diào)查顯示其中的8個基因受到穩(wěn)定選擇。Simko等[27]對47份馬鈴薯66個基因位點調(diào)查表明， 大部分基因位點在馬鈴薯群體進化過程中受到了直接選擇或者分化選擇作用。以上對不同物種的不同基因位點的研究都強調(diào)了分子進化的非中性的結(jié)果， 這說明選擇在基因的進化過程中具有非常重要的作用; 另一方面， 中性進化的結(jié)果報道較少， 或被有意或者無意地忽略， 事實上即使在強調(diào)選擇作用的研究文獻中， 仍然有相當一部分基因表現(xiàn)為中性進化， 說明在種內(nèi)微觀進化的過程中， 選擇作用和中性漂變作用可能單獨或者聯(lián)合影響了物種內(nèi)不同的基因位點， 共同促進了物種的進化。

2.5 群體遺傳分化

分子群體遺傳學(xué)一個重要的研究內(nèi)容是闡明物種不同群體之間甚至不同物種群體之間(通常近緣種， 如栽培種及其近緣種或祖先野生種)遺傳結(jié)構(gòu)的差異即遺傳分化， 并推測形成這種差異的原因， 從而使人能夠更好地理解種群動態(tài)。

植物種內(nèi)不同群體間遺傳分化的研究案例有很多， 典型的有: (1)擬南芥全球范圍內(nèi)的遺傳分化。Kawabe和Miyashita[59]利用堿性幾丁質(zhì)酶A(ChiA)、堿性幾丁質(zhì)酶B(ChiB)及乙醇脫氫酶(Ahd)3個基因?qū)M南芥進行群體亞結(jié)構(gòu)的分析， 結(jié)果只有ChiB顯示出一定的群體亞結(jié)構(gòu)， 而ChiA、Ahd的系統(tǒng)學(xué)聚類與樣本地理來源之間沒有表現(xiàn)出任何相關(guān)關(guān)系，這樣的結(jié)果暗示了擬南芥近期在全球范圍內(nèi)經(jīng)歷了迅速擴張。Aguade[60]和Mauricio等[61]分別用不同的基因、Schmid等[23]用多基因位點進行的擬南芥分子群體遺傳學(xué)研究也支持同樣的結(jié)論。(2)森林樹種的遺傳分化。Ingvarsson等[62]發(fā)現(xiàn)歐洲山楊的日長誘導(dǎo)發(fā)芽的侯選基因(phyB)變異方式呈現(xiàn)出緯度漸變方式， 表明歐洲山楊出現(xiàn)了明顯的適應(yīng)性分化; Ingvarsson等[63]對多個基因單倍型地理格局分布的研究同樣發(fā)現(xiàn)歐洲楊具有明顯的地理遺傳分化。但是研究表明花旗松(Pseudotsuga menziesii)[30]、火炬松(Pinus taeda)[29]、圓球柳杉(Cryptomeria japonica)等[64]等物種沒有發(fā)生明顯遺傳多樣性的地理分化。

植物不同物種間遺傳分化的研究主要集中對在栽培種及其野生近緣種的DNA多態(tài)性的比較上。由于早期的馴化瓶頸及人工選擇繁育等遺傳漂變作用結(jié)果[65]。栽培物種的遺傳多樣性通常都低于他們的野生祖先種。Hamblin等[28]利用AFLP結(jié)果篩選得到基因片段的DNA多態(tài)性， 對栽培高粱(S. bicolor)和野生高粱(S. propinquum)進行了比較研究， 結(jié)果表明: 野生高粱的平均核苷酸多態(tài)性大約為0.012( )，大約是栽培高粱的4倍。Liu等[26]的研究顯示: 野生向日葵中， 核苷酸多態(tài)性達到0.0128( )、0.0144( W)，顯著高于栽培向日葵的0.0056( )、0.0072( W)。Eyre-Walker等[66]對栽培和野生玉米Adh1基因大約1 400 bp的序列研究表明: 栽培玉米的遺傳多樣性大約只有野生玉米種(Zea mays subsp. parviglumis)的75%。Hyten等[67]的研究顯示野大豆的平均核苷酸多態(tài)性為0.0217( )、0.0235( W)， 地方種則分別為0.0143( )、0.0115( W)，大約為野大豆的66%( )和49%( )。以上結(jié)果充分反應(yīng)了栽培物種馴化過程中曾遭受過瓶頸效應(yīng)。

3 分子系統(tǒng)地理學(xué)

分子系統(tǒng)地理學(xué)是在分子群體遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上， 衍生出的新學(xué)科分支。早在20世紀的60年代， Malecot[68]就發(fā)現(xiàn)了基因的同一性隨地理距離增加而減少的現(xiàn)象; 1975年Nei的《分子群體遺傳學(xué)和進化》一書中也提到在描述群體的遺傳結(jié)構(gòu)時要重視基因或者基因型的地理分布[1]; 1987年Avise等[17]提出了系統(tǒng)地理學(xué)概念。在植物方面， 分子地理系統(tǒng)學(xué)研究取得很多重要的成果。如對第四世紀冰期植物避難所的推測及冰期后物種的擴散及重新定居等歷史事件的闡釋， 其中最為典型的研究是對歐洲大陸冰期植物避難所的確定及冰期后植物的重新定居歐洲大陸的歷史事件的重現(xiàn)。如歐洲的櫟屬植物的cpDNA的單倍型的地理分布格局表明， 櫟屬植物冰期避難所位于巴爾干半島、伊比利亞島和意大利亞平寧半島， 現(xiàn)今的分布格局是由于不同冰期避難所遷出形成的[69]。King和Ferris[70]推測歐洲北部的大部分歐洲榿木種群是從喀爾巴阡山脈這個冰期避難所遷移后演化形成的。Sinclair等[71， 72]推測歐洲赤松在第四紀冰期時的避難所可能是在愛爾蘭島或者在法國的西部。此外， 分子系統(tǒng)地理學(xué)在闡明了一些栽培作物的馴化歷史事件如馴化發(fā)生的次數(shù)及馴化起源地等方面也取得了重要的進展。如Olsen等[73]對木薯(Manihot esculenta)單拷貝核基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)在木薯群體中單倍型的地理分布方式深入調(diào)查后推測: 栽培木薯起源于亞馬遜河流域南部邊界區(qū)域。Caicedo等[74]利用核基因果實液泡轉(zhuǎn)化酶(fruit vacuolar invertase)的序列變異闡明了栽培番茄(Lycopersicon esculentum)的野生近緣種(Solanum pimpinellifolium )的種群擴張歷史， 基因變異的地理分布方式表明栽培番茄起源于秘魯北部， 然后逐步向太平洋岸邊擴張。Londo等[75]利用一個葉綠體基因和兩個核基因的變異對兩個亞洲的栽培秈、粳亞種及其近緣野生種進行了系統(tǒng)地理學(xué)研究， 闡明了秈、粳稻分別起源于不同的亞洲野生稻(O. rufipogon)群體， 其中秈稻起源于喜馬拉雅山脈的南部的印度東部、緬甸、泰國一帶， 而粳稻則馴化于中國南部， 等等。

篇5

【關(guān)鍵詞】染色體；異常核型；無精癥。

【中圖分類號】R596 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）12-0079-01

1 病例資料

患者，男，35歲，第二性征發(fā)育良好。婚后1年半不孕，三次行常規(guī)檢查均未見。既往無腮腺炎病史。夫婦表型和智力正常，非近親婚配，家系中無不良孕產(chǎn)史，無智力低下兒。女方已行染色體檢查，核型為46，XX。

2 高分辨染色體制備

抽取患者外周血，取0.3mL接種于5mL外周血淋巴細胞培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72小時，加入10-5mol/L Frdu和10-4mol/L Uridine各100?L， 繼續(xù)培養(yǎng)17小時后加入10-3mol/L TDR100?L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加1g/L EB 50?L，45分鐘后加20mg/L秋水仙素35?L，10分鐘后常規(guī)收獲細胞，滴片，常規(guī)吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并用染色體圖像分析系統(tǒng)進行照相。

3 結(jié)果

隨機觀察的30個完整分裂相，分析15個核型，均為46，XY， der（1）（1pter1q44：：12q1212qter），der（11）（11pter11q13：：12q1112q12：：22p11.222pter），der（12）（12pter12q11：：1q441qter），der（22）（11qter11q13：：22p11.222qter）（見圖1和圖2）。經(jīng)國家異常核型數(shù)據(jù)庫查閱所有國內(nèi)外資料均未見報道，為世界首報核型。

4 討論

患者1號，11號，12號和22號共4條染色體發(fā)生了斷裂和交換，其中12號染色體發(fā)生了兩處斷裂，分別形成了4條新的衍生染色體。這種畸變屬于相互易位并伴隨插入，屬罕見的染色體結(jié)構(gòu)異常。其形成可能系單倍體的或卵子的染色體以染色質(zhì)絲狀態(tài)散布在細胞核中，受一次或多次擊中事件影響，導(dǎo)致染色體片段重新組合所致[1]。

經(jīng)高分辨染色體核型分析未發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)帶的丟失和重復(fù)，即初步認為該患者的遺傳物質(zhì)總量不變，所以對該個體自身生長發(fā)育沒有造成嚴重影響。根據(jù)遺傳學(xué)定律[2]，涉及到4條染色體相互易位并伴隨插入的染色體異常核型，理論上產(chǎn)生正常配子的概率微乎其微[3]，因此臨床上認為此類患者無法正常生育下一代，可通過供精人工授精的方式來生育。

此患者目前唯一可查的臨床表型為“無精癥”，但其染色體畸變是否與無精癥相關(guān)，作者認為還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 葉志純，趙蕊，祝興元，三條染色體復(fù)雜易位攜帶者的遺傳效應(yīng)分析，中國優(yōu)生與遺傳雜志， 2005， 13（4）：47-48

篇6

【摘要】

本研究探討常規(guī)細胞遺傳學(xué)(conventional cytogenetics， CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction， nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(dualcolor and dualfusion fluorescence in situ hybridization， DFISH) 三種技術(shù)監(jiān)測慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者造血干細胞移植治療過程中腫瘤負荷的靈敏度和特異性。聯(lián)合應(yīng)用CC、巢式RTPCR 和DFISH三種技術(shù)對7例CML患者非清髓性異基因干細胞移植治療前后的腫瘤負荷水平進行檢測。檢測結(jié)果顯示： 7例CML患者治療前后的40份骨髓標本中，有29份標本檢出不同比率的Ph染色體；3份因細胞數(shù)少CC分析失敗；36份標本RTPCR檢測結(jié)果為陽性。病例1移植后12、18、26及38個月的4份標本Ph染色體及RTPCR結(jié)果均為陰性。病例1移植后9、10個月、病例2移植后15個月、病例3移植后12個月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標本經(jīng)FISH檢測，分別檢出5.4%、 0%、 16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細胞。病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份標本因細胞數(shù)少而CC核型分析失敗，對其行FISH檢測，結(jié)果bcr/abl(+)細胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%。病例1移植后12個月Ph(-)bcr/abl(-)的標本行FISH檢測，結(jié)果bcr/abl(+)細胞檢出率為0%。結(jié)論： CC可作為監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負荷水平的基本手段。在移植后早期細胞數(shù)太少而無法進行CC檢測，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負荷降低到CC不能檢出而RTPCR仍為陽性時，借助FISH準確檢測體內(nèi)腫瘤負荷，以監(jiān)測其動態(tài)變化。FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測核定。

【關(guān)鍵詞】 慢性髓系白血病；細胞遺傳學(xué)；聚合酶鏈反應(yīng)；熒光原位雜交

Detection of Tumor Load in Chronic Myeloid Leukemia During Treatment with Transplantation by Conventional Cytogenetics， NestedRTPCR and FISH

Abstract

This study was purposed to investigate the sensitivity and specificity of conventional cytogenetics (CC)，nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction (nestedRTPCR) and dualcolor / dualfusion fluorescence in situ hybridization (DFISH) technique in monitoring the tumor load of chronic myeloid leukemia (CML) during treatment with transplantation. CC， nestedRTPCR and interphase DFISH were simultaneously carried out to detect the tumor load of 7 CML patients during treatment with nonmyeloablative allogentic stem cell transplantation(alloNSCT).40 specimens from 7 CML patients before and after alloNSCT were analyzed. The results showed that 29 specimens were Ph(+) with different positive ratio and 3 specimens with lower cells were not analyzed by CC. 36 specimens were bcr/abl mRNA (+) by RTPCR. 4 specimens from case 1 at 12，18，26 and 38 months after alloNSCT were Ph(-) and bcr/abl mRNA (-)，4 Ph(-)bcr/abl(+) specimens containing 2 from case 1 at 9 and 10 months after alloNSCT， 1 from case 2 at 15 months after alloNSCT， 1 from case 3 at 12 months after alloNSCT showed 5.4%， 0%， 16.5% and 1.5% bcr/abl(+) cells by FISH. 3 specimens with lower cells containing 2 from case 5 at 20 and 60 days after alloNSCT and 1 from case 7 at 40 days after alloNSCT were analyzed by FISH and showed 55.0%， 27.5% and 73.5% bcr/abl(+) cells. The Ph (-) bcr/abl(-) specimen from case 1 at 12 monthss postalloNSCT showed 0% bcr/abl (+) cells by FISH. It is concluded that CC can be used as a basic tool to monitor the change of tumor load in CML during treatment. When specimen with lower cells can not be analyzed by CC in early period after alloNSCT， or result of CC can not evaluate precisely dynamic change of tumor load and when tumor load in treated patient are lower to Ph(-) by CC while bcr/abl mRNA (+) by RTPCR， FISH must be used to detect precisely tumor load and monitor dynamic change of it. More sensitive RTPCR is used to monitor tumor load when it is lower to bcr/abl(-) by FISH during treatment.

Key words

chronic myeloid leukemia; cytogenetics;　 polymerase chain reaction; fluorescence in situ hybridization

Ph染色體是慢性髓系白血病（CML）的標志染色體，其本質(zhì)是t(9;22)(q34;q11)易位，易位的結(jié)果使位于9號染色體長臂3區(qū)4帶 (q34) 上的cabl原癌基因與22號染色體長臂上一個功能未明的斷裂點簇集區(qū)(breakpoint cluster region， BCR)發(fā)生拼接，形成bcr/abl融合基因。易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是CML的惡性克隆標志。在評價CML對各種治療如INFα、骨髓移植、格列衛(wèi)等的反應(yīng)程度時，準確判斷患者骨髓細胞中的腫瘤負荷十分重要。我們聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)細胞遺傳學(xué)(CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(DFISH)技術(shù)對7例非清髓性異基因干細胞移植治療的CML患者的腫瘤負荷水平進行檢測，探討3種技術(shù)對監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負荷的靈敏度和特異性。

病例

7例CML患者系我院血液科2001年9月-2005年1月就診的住院病人，均符合《血液病診斷及療效標準》臨床診斷標準，其中男性5例，女性2例，年齡19-56歲，中位年齡38歲。7例患者均行非清髓性異基因干細胞移植，術(shù)后根據(jù)臨床反應(yīng)及嵌和體形成情況給予供體淋巴細胞輸注。陰性對照為3例健康供體骨髓細胞，陽性對照為K562細胞。

常規(guī)細胞遺傳學(xué)分析

采用骨髓直接法和(或)24小時短期培養(yǎng)法按常規(guī)制備染色體并進行R顯帶核型分析。染色體核型異常按《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)》(1995)進行描述，每份標本至少分析10個中期細胞。

bcr/abl融合基因轉(zhuǎn)錄本的巢式RTPCR檢測

巢式RTPCR按我室常規(guī)方法進行。外測引物序列為：C:5′GCTTCTCCCTGACATCCGTG3′，D:5′CGAGCGGCTTCACTCAGACC3′內(nèi)測引物序列為：A:5′CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3′，B:5′CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3′，每次實驗均設(shè)陽性和陰性對照，只有陽性對照為陽性，陰性對照為陰性時結(jié)果才視為可靠。

bcr/abl融合基因的DFISH法檢測［1］

bcr/abl融合基因探針 LSI BCRABL DFISH探針由美國Vysis公司提供。

FISH檢測 取出保存于 -20℃的染色體標本，換上新鮮固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)滴片， 室溫氣干后放入37℃預(yù)溫的2×SSC中30分鐘，分別在70%、85%、100%的乙醇(體積比)中室溫梯度脫水，每梯度2分鐘， 晾干。 在73℃變性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中變性5分鐘， 70%、85%、100%冰乙醇(-20℃)系列脫水， 每梯度2分鐘， 晾干備用。將1 μl混合探針與9 μl雜交稀釋液（hybridization buffer，購自Vysis公司)混合，在73℃水浴中變性5分鐘， 然后加在染色體標本上，蓋片封膠， 放入預(yù)熱的濕盒中， 37℃雜交過夜。雜交后標本在73℃ 0.4×SSC/0.3% Triton100中洗滌2分鐘，再用2×SSC/0.1% Triyon100室溫洗滌1分鐘， 避光晾干后加10 μl二氨基酚吲哚(DAPI)復(fù)染標本， 20分鐘后熒光顯微鏡檢測。

熒光顯微鏡檢查 在NikonE600熒光顯微鏡下通過三色濾光塊(DAPI/TRITC/FITC)觀察雜交信號，每例至少分析200個間期細胞，不計數(shù)重疊細胞，計算陽性細胞的百分比率。FISH結(jié)果判斷標準:紅色(red， R)信號為abl，綠色(green， G)信號為bcr，將R信號與G信號重疊或接觸定義為融合信號(fusion， F)， 融合信號在熒光顯微鏡下呈黃色，為bcr/abl或abl/bcr融合基因。具有典型t(9;22)易位的細胞顯示2個黃色的融合信號和1個紅色及1個綠色信號(2F1R1G)，而正常細胞則顯示2個分離的紅色信號和2個分離的綠色信號(2R2G)。

結(jié)

果

正常分界值的確定

正常分界值的取值為正常對照組中所觀察到的陽性細胞數(shù)平均值+3個標準差(分界值=X+3SD)［1-3］，陽性細胞率大于分界值的標本我們將其定義為異常。本研究陰性對照組DFISH檢測到陽性細胞率為0%-0.5%，平均值0.17%，標準差0.24%，分界值為0.17%+3×0.24%=0.89%。K562細胞用DFISH重復(fù)2次檢測，陽性率為100%。

移植前后CC、RTPCR及FISH檢測結(jié)果

對來自7例CML患者非清髓性異基因干細胞移植治療前后的40份骨髓標本進行了檢測，其中29份標本檢出有不同比率的Ph染色體，8份Ph染色體陰性，3份因細胞數(shù)少CC分析失敗。36份標本RTPCR結(jié)果為陽性，包括29份Ph(+)標本、3份CC分析失敗標本及4份Ph(-)標本。病例1移植后12、18、26及38個月的4份標本Ph染色體及RTPCR結(jié)果均為陰性。對來自病例1移植后9及10個月、病例2移植后15個月、病例3移植后12個月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標本進一步行FISH檢測，分別檢出5.4%、0%、16.5及1.5%的bcr/abl(+)細胞。對病例5移植后20、60天和病例7移植后40天的3份因細胞數(shù)少即CC核型分析失敗的標本行FISH檢測。bcr/abl(+)細胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%。對病例1移植后12個月Ph(-)bcr/abl(-)的標本行FISH檢測，結(jié)果為bcr/abl(+)細胞檢出率為0%（附表）。

討

論

95%以上的CML具有t(9;22)(q34;p11)易位， 易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的基礎(chǔ)。因此Ph染色體和bcr/abl融合基因是CML診斷、療效觀測和微小殘留病監(jiān)測的有效指標。在評價CML對各種治療如INF、骨髓移植等的反應(yīng)程度時，從定量角度準確判斷患者骨髓細胞中的腫瘤負荷有重要的臨床意義。研究表明［4］，病人骨髓或造血干細胞移植后殘留腫瘤負荷的水平提示了疾病復(fù)發(fā)的可能性大小。目前進行定量研究常用的檢測手段有CC、FISH和實時定量PCR等［5-7］。我們應(yīng)用這3種技術(shù)對7例非清髓性異基因干細胞移植治療中CML患者的腫瘤負荷水平進行了檢測。

對7例CML患者非清髓性異基因干細胞移植治療前后的 40 份骨髓標本檢測發(fā)現(xiàn)， 移植后早期(3個月)由于細胞數(shù)少，CC分析往往不敏感，甚至失敗。對病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份因細胞數(shù)少CC核型分析失敗的標本行FISH檢測，bcr/abl(+)細胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%，可見在移植后早期用FISH可以準確檢測體內(nèi)腫瘤負荷水平，從而判定是否成功植入。移植后3個月至CC檢測Ph染色體轉(zhuǎn)陰前階段，可以用CC對體內(nèi)腫瘤負荷進行動態(tài)監(jiān)測。當應(yīng)用CC檢測Ph(-)而用RTPCR檢測bcr/abl(+)時，應(yīng)該用FISH監(jiān)測體內(nèi)腫瘤負荷的動態(tài)變化。我們對病例1移植后9、10個月、病例2移植后15個月、病例3移植后12個月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標本進一步行FISH檢測，分別檢出5.4%、0%、16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細胞，說明CC檢測Ph轉(zhuǎn)陰后，體內(nèi)仍可能有一定數(shù)量的微小殘留病存在。病例1移植后10個月Ph(-)bcr/abl(+)標本及移植后12個月Ph(-)bcr/abl(-)的標本行FISH檢測，bcr/abl(+)細胞檢出率均為0%，提示FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測，一旦RTPCR結(jié)果呈陽性，即需配合FISH監(jiān)測，以便及早發(fā)現(xiàn)病情變化，實施干預(yù)措施。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，非清髓性異基因干細胞移植后病人體內(nèi)Ph（+）細胞殘留時間較長，但這并不意味著移植失敗。大多數(shù)病人隨者時間延長及輔以供體淋巴細胞輸注(DLI)，Ph（+）細胞會逐漸減少并最終消失。其原因可能是嵌合的供者T淋巴細胞通過識別宿主殘留細胞的次要組織相容性抗原（mMHC）或殘留的抗原呈遞細胞（DC）提呈遞的白血病相關(guān)抗原，活化并產(chǎn)生移植物抗白血病反應(yīng)(graft versus leukemia，GVL)，從而清除宿主體內(nèi)的腫瘤細胞或遺傳學(xué)異常的造血干細胞。T 細胞、NK細胞協(xié)同參與了GVL效應(yīng)，CD4+ T細胞在GVL效應(yīng)中起主要作用，CD8+ Tc2亞群細胞可介導(dǎo)GVL效應(yīng)并在降低移植物抗宿主病（GVHD）發(fā)生率的同時防止移植物被排斥。這與非清髓性預(yù)處理干細胞移植后實施供者淋巴細胞輸注后產(chǎn)生的效應(yīng)一致［8-10］。

移植后病人體內(nèi)殘留的Ph（+）細胞比率下降不明顯、停滯甚至有增高趨勢時，應(yīng)實施臨床干預(yù)。病例6移植后8個月仍殘留70%的Ph（+）細胞，多次給予DLI， Ph（+）細胞比率反復(fù)升降，效果不好，后又輔以干擾素治療，效果仍然不好。目前病人仍處于血液學(xué)緩解期，正在考慮二次移植。

另外，移植成功也并不意味著病人就一定能夠長期生存。病例2移植后Ph（+）細胞漸降，并于移植后15個月CC檢測Ph轉(zhuǎn)陰，但病人一般狀況卻一直不是很好，有嚴重的慢性移植物抗宿主病（cGVHD）表現(xiàn)，最終于移植后22個月因骨轉(zhuǎn)移而死亡。由于病人一直處于血液學(xué)緩解期，骨髓檢查并無復(fù)發(fā)傾向，所以我們考慮其骨轉(zhuǎn)移可能早在移植前就已發(fā)生，提示移植要把握好時機，及早進行。病例5為一老年患者，年齡56歲，移植前已進入加速期，但移植非常成功，移植后5個月Ph（+）細胞就降至20%，術(shù)后發(fā)生cGVHD，于術(shù)后1年死于間質(zhì)性肺炎。因此，如何防治cGVHD成為移植成功的關(guān)鍵之一。

綜上所述，CC、RTPCR和FISH 3種方法在檢測CML病人對治療的反應(yīng)時各有其特點：①CC可作為監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負荷水平的基本手段；②在移植后早期細胞數(shù)少時，CC檢測結(jié)果無法準確判斷體內(nèi)腫瘤負荷動態(tài)變化時，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負荷降低到CC不能檢出而RTPCR仍為陽性時，需借助FISH來準確檢測體內(nèi)腫瘤負荷，監(jiān)測其動態(tài)變化；③FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測。根據(jù)病人所處的時期及體內(nèi)的腫瘤負荷量選擇適當?shù)姆椒ǎ梢栽诓辉黾硬∪私?jīng)濟負擔(dān)的前提下，對病人體內(nèi)腫瘤負荷實行動態(tài)監(jiān)測，為實施臨床干預(yù)提供可靠的依據(jù)。

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篇7

【關(guān)鍵詞】春小麥 抗倒伏 遺傳參數(shù) 分析

眾所周知，隨著生產(chǎn)和栽培條件的不斷改善，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對于小麥品種的抗倒伏能力提出了越來越高的要求。因而，抗倒伏性狀的選育是近代小麥高產(chǎn)育種的重要內(nèi)容之一。雖然有報道指出，小麥品種抗倒伏能力的大小與株高、莖稈韌性、彈性、基部節(jié)間長、莖粗、莖壁厚度和根系特征等有關(guān)。而且進一步指出，基部第一節(jié)間長度大于10cm，第二節(jié)間大于15cm，極易發(fā)生倒伏；一般抗倒品種的節(jié)間長度是第一節(jié)間不超過5cm，第二節(jié)間不超過10cm.但是，用數(shù)量遺傳學(xué)的原理來分析揭示小麥抗倒伏性狀遺傳規(guī)律的報道較少，為此，本文對主要抗倒伏性狀的幾個遺傳參數(shù)進行了計算和分析，明確各抗倒伏性狀的遺傳變異規(guī)律，為水地春小麥抗倒伏品種的育種提供理論和試驗依據(jù)。

一、材料和方法

1.試驗地點

試驗地點設(shè)在定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心試驗地。該試驗地海拔1920米，北緯35°32′，東徑104°37′，年降雨量400mm左右，年平均氣溫6.4℃左右，年日照時數(shù)2500.1小時。

2.供試品種（系）

參試956-21、8926-4-2、9810-25-5、200311-10、定豐16號、200311-9、989-12-17、943、9635-5、隴春23號共10份材料。

3.試驗設(shè)計

田間采用隨機區(qū)組排列，三次重復(fù)，小區(qū)面積13.3m2，播12行區(qū)，行距20cm，區(qū)距40cm，畝播種量按35萬粒（有效發(fā)芽粒數(shù)計算）。手鋤開溝條播，耙磨兩次。

4.測定項目

抗倒伏性狀大多是比較復(fù)雜的數(shù)量性狀，許多性狀不同程度地均與植株的抗倒伏能力有關(guān)。本試驗測試了株高、地上部第二節(jié)間長、地上部第二節(jié)間莖壁厚、地上部第二節(jié)間莖粗、穗下節(jié)間長、穗頸粗、旗葉長度、葉基角、葉披垂度、畝穗數(shù)及抗倒值11個性狀。

二、結(jié)果與分析

1.遺傳力h2及遺傳變異系數(shù)CVG

遺傳力的大小體現(xiàn)了遺傳因素和環(huán)境條件兩者對性狀表現(xiàn)的影響程度，同時也指出了依據(jù)表現(xiàn)型進行選擇的可靠性大小，因此，各性狀的遺傳力是一項重要的遺傳參數(shù)。本試驗采用方差分析法計算了各倒伏性狀的廣義和遺傳變異系數(shù)（見表1）。

由表一知，各性狀遺傳力從大至小排列順序為穗下節(jié)間長＞葉披垂度＞旗葉長度＞株高＞穗頸粗＞地上部第二節(jié)間莖粗＞畝穗數(shù)＞地上部第二節(jié)間長＞抗倒值＞地上部第二節(jié)間莖壁厚＞葉基角。可以看出，與其它性狀相比，抗倒值的遺傳力較低，僅為72.36%。因此對抗倒值進行直接選擇的效果不大。但是，與抗倒值密切相關(guān)的株高、第二節(jié)間長、莖粗等性狀的遺傳力卻較高在80%左右，因此，在雜交早代通過對株高、第二節(jié)間長、莖粗的直接選擇，就可間接得到抗倒值較大的遺傳類型。葉基角的遺傳力最低僅為44.32%，說明它易受環(huán)境條件的影響，所以對葉基角在早代不宜選擇過嚴或推遲選擇世代、也可根據(jù)與其它性狀間的相關(guān)程度進行間接選擇。

遺傳變異系數(shù)是遺傳潛力的另一個重要指標。通過對它的計算就可以觀察出各性狀遺傳變異幅度的大小。有表一知，抗倒值以及與其密切相關(guān)的株高等性狀在遺傳上的變異幅度都校大。因此，通過品種間雜交來選育抗倒伏品種的潛力很大，抗倒值的遺傳變異系數(shù)很大，說明供試材料的抗倒值表現(xiàn)在遺傳上的變幅很大。

表1 各抗倒伏性狀的廣義遺傳力及遺傳變異系數(shù)

表2 各抗倒伏性狀的遺傳進度和相對遺傳進度

2.遺傳進度

遺傳力只是表明性狀的相對遺傳能力，即使同樣的遺傳力，從親代到子代的遺傳效果也會隨其變異幅度的大小而不同。遺傳進度反映了經(jīng)過選擇，子代從親代獲得的遺傳增量，它可以作為衡量選擇效果的一個指標。遺傳進度越大，說明在一定的選擇條件下，選擇效果就越好。為此，本試驗采用遺傳力計算了幾個抗倒伏性狀在5%和1%選擇下的遺傳進度和相對遺傳進度（見表2）。

三、小結(jié)

1.由相關(guān)分析和通徑分析可知：穗下節(jié)間長度對倒伏值的總影響最大，株高次之；第二節(jié)間粗對抗倒值的直接作用最大，第二節(jié)間長次之。據(jù)此，從遺傳上看可初步認為：水地春小麥抗倒伏品種應(yīng)以第二節(jié)間粗而短，植株較矮為基本性狀，并使之綜合協(xié)調(diào)，才能達到目的，同時，為增強品種的抗倒伏能力，葉基角不可過小。

2.與抗倒值關(guān)系密切的株高、第二節(jié)間長和莖粗三個性狀的遺傳力和遺傳進度都較高，因此，在雜交早代對這三個性狀進行直接選擇，就可受到良好的選擇效果。

篇8

線粒體DNA非編碼區(qū)由兩個tRNA基因分離，D-loop區(qū)域就處在這個非編碼區(qū)中[2]。在線粒體DNA中，D-loop區(qū)是重鏈和輕鏈的復(fù)制起點，也稱之為“控制區(qū)ControlRegion”，其進化壓力較小，是線粒體DNA基因組序列和長度變異最大的區(qū)域，Horai等[3]發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的基因變化速度比細胞核DNA和其他細胞器的基因快5倍，同時也是進化最快的部分。因此，選擇D-loop區(qū)作為鑒定種群遺傳狀況的分子標記直接有效。利用D-loop的序列在群體遺傳學(xué)上進行分析的工作在20世紀70年代就已經(jīng)展開了，那時候僅僅用于分析區(qū)域內(nèi)種間的親緣關(guān)系。現(xiàn)今，D-loop區(qū)已經(jīng)廣泛被用作非常高效的工具來推斷不同區(qū)域內(nèi)種間或種內(nèi)的親緣關(guān)系和遺傳狀況。D-loop區(qū)中仍然細分為3個部分，中央保守區(qū)、終止序列區(qū)和保守序列區(qū)。其中終止序列區(qū)包含了線粒體DNA終止復(fù)制的相關(guān)序列，是變異最大的部分[4]，最具研究和分析價值。在進行數(shù)據(jù)結(jié)果分析時，由D-loop序列分析得到的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性是兩個評價群體遺傳資源或者群遺傳多樣性的重要指標。

1.1野生群體遺傳多樣性分析

1.1.1D-loop部分序列分析D-loop序列分析中，由于并不是整個D-loop序列都發(fā)生堿基的插入或者替換，可以采取對保守序列區(qū)或者終止序列區(qū)的部分區(qū)域進行擴增。由于這兩個部分的進化比中央保守區(qū)迅速得多，只對這一區(qū)段的序列進行分析也能代表物種的遺傳多樣性和進化過程。張仁意等[5]對青海4個不同湖水采集的155尾裸鯉（Gymnocyprisprzewalskii）個體的線粒體DNA的D-loop區(qū)中部分序列進行擴增，得到754bp的序列長度，分析發(fā)現(xiàn)155個樣本中有34個單倍型，但4個群體中可魯克湖群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性遠低于其他種群；進一步的遺傳分化系數(shù)的分析表明，該地區(qū)已經(jīng)產(chǎn)生一定的遺傳分化，但由于地理隔離的原因，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果還沒有發(fā)展出明顯的單枝，加之該區(qū)域群體的遺傳多樣性偏低，需要進行重點保護。

鄭真真等[6]對全球大青鯊（Prionaceglauca）進行了D-loop區(qū)中694bp擴增分析，采集了來自中東太平洋、中西太平洋、中東大西洋、西南大西洋和印度洋5個海域的165尾個體，分析發(fā)現(xiàn)145個單倍型，變異程度非常大。進一步分析后發(fā)現(xiàn)5個區(qū)域的大青鯊種群的單倍型和核苷酸都處于較高水平，種質(zhì)資源較好；但是遺傳分化指數(shù)顯示5個區(qū)域存在強烈的基因交流，種群遺傳分化水平較低。鄒芝英等[7]采集了8尾長鰭鯉（Cyprinuscarpiovar.longfin），擴增得到600bp的部分序列，找到了與終止區(qū)域相關(guān)的6個特征序列；對這些特定的區(qū)域分析得到6個單倍型，13個變異位點，顯示了較好的種質(zhì)資源狀況，核苷酸多樣性數(shù)值與其他魚類接近，遺傳狀況中等，由于該物種稀有且僅存在偏遠地區(qū)，保護珍惜水產(chǎn)動物資源已經(jīng)迫在眉睫。向燕等[8]為了了解3種鱘魚：達氏鱘（Acipenserdabryanus）、中華鱘（A.sinensi）和史氏鱘（A.schrencki）親魚的遺傳狀況和遺傳背景，對線粒體D-loop區(qū)部分序列進行分析，擴增得到400bp的序列，49尾親魚個體一共得到僅18個單倍型，并且對于單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹分析后，發(fā)現(xiàn)集中在6個單倍型中，說明這些群體很有可能來自同一母親；不過各單倍型遺傳距離較遠，說明父本來自不同的個體；其結(jié)果提示，在生產(chǎn)中仍要采用不同單倍型進行人工繁育，以避免近親而導(dǎo)致種質(zhì)退化。

Kumazawa等[9]研究發(fā)現(xiàn)，D-loop的5＇端和3＇端有串聯(lián)重復(fù)序列，這段的變異速率較快。Abinash等[10]在北美不同區(qū)域采集淡水扁頭鯰（Pylodictisolivaris），對35bp的串聯(lián)重復(fù)區(qū)進行分析檢測，從美國35個水系采集了330尾樣本，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在東南墨西哥灣的70%樣本出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)的變異，而采自密西西比河95％的樣本和墨西哥灣西南沿岸的扁頭鯰沒有出現(xiàn)這個區(qū)域的變異；系統(tǒng)發(fā)育的計算結(jié)果表明，在70萬年和205萬年左右出現(xiàn)群體分流；從地理位置上看，密西西比河的支流進入墨西哥灣西南沿岸流域，而東南墨西哥灣為另一條流域；該結(jié)果表明種群的遺傳結(jié)構(gòu)受到地域特殊性的影響。D-loop區(qū)部分序列的結(jié)果分析能滿足一定程度的遺傳多樣性和遺傳狀況分析，可以得到可靠的結(jié)果數(shù)據(jù)幫助人們進行資源保護和簡單的育種工作。隨著科技進步和測序水平的改善，進行全序列的測序漸漸進入研究者的視野，全長序列將獲得更加完整和正確的結(jié)果。

1.1.2D-loop全序列分析D-loop的多態(tài)性一種是來源于堿基的突變、插入和替換形成的不同單倍型，不僅種間有差異，種內(nèi)個體間也存在差異，只是重復(fù)的差異小于種間的差異。而且在個體中D-loop一旦發(fā)生差異，線粒體DNA會穩(wěn)定地將這種差異遺傳下去，這種差異在個體間表現(xiàn)為線粒體DNA分子的長度變異，因此對D-loop全長進行分析研究更能體現(xiàn)整體的變異程度。肖明松等[11]在淮河淮濱段、鳳臺段、蚌埠段、洪澤湖段采集84尾野生烏鱧（Ophicephalusargus）進行種群資源的研究，分析發(fā)現(xiàn)33個單倍型，檢測了單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（Pi）、遺傳分化指數(shù)（Fst）、遺傳距離以及中性檢驗、錯配分析和NJ樹，發(fā)現(xiàn)其h和Pi較高，表明種群平均多態(tài)性相對較好；但在遺傳距離的分析中發(fā)現(xiàn)所有群體的差異都較小，這可能是由于在淮河流域中不同支流的種流程度較高造成的，所以變異發(fā)生在種內(nèi)，而種群之間的分化較少。董志國等[12]對大連、東營、連云港、舟山、湛江和漳州6個地區(qū)的野生三疣梭子蟹（Portunustritubercatus）進行D-loop全基因組區(qū)的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，選擇單倍型多樣性和核苷酸多樣性作為重要指標，并加入了群體遺傳分化指數(shù)的分析，進行Tajima’sD中性檢驗和單倍型間的分子變異分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)梭子蟹的遺傳多樣性很高，產(chǎn)生一定的遺傳分化；不過在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析中，地理距離對遺傳距離沒有顯著的關(guān)系，原因仍需要進一步研究。趙良杰等[13]在千島湖汾口、富文、臨岐3個大眼華鳊（Sinibramamacrops）主要繁殖區(qū)域采集了115尾個體，對樣品進行了形態(tài)學(xué)和D-loop序列測定后，分析形態(tài)主成分和各個基因遺傳學(xué)分析指標，發(fā)現(xiàn)千島湖各地的大眼華鳊之間有豐富的基因交流，并沒有形成容易滅絕的小種群，表明各個地理群體仍然有豐富的遺傳多樣性，面對一定的災(zāi)害時有一定的彈性，不過這樣的良好狀況仍然需要政府和漁民對該區(qū)域的種質(zhì)資源進行保護。高志遠等[14]對海南松濤水庫南豐鎮(zhèn)、番加鄉(xiāng)、白沙群體的長臀鮠（Cranoglanisbouderius）的D-loop序列全場進行分析，44尾個體中發(fā)現(xiàn)11個單倍型，但在分析中發(fā)現(xiàn)單倍型較高，而核苷酸多樣性較低，認為是由于海南島偏僻的地理位置難與大陸長臀鮠進行基因交流，推斷在歷史中可能出現(xiàn)過嚴重的瓶頸效應(yīng)；中性檢測也表明沒有任何整體或局部的種群擴張，數(shù)據(jù)皆表明該地域長臀鮠正處在較危險的境地，需要進行種群的保護措施。

1.2養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析目前，國內(nèi)對水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的生長不良與病害頻繁大多歸結(jié)于飼料與環(huán)境的問題。誠然，營養(yǎng)和免疫是養(yǎng)殖的關(guān)鍵，但是由于人工育種和繁育雜交造成的種質(zhì)資源下降也是重要因素之一。養(yǎng)殖戶往往在育種過程中，沒有考慮到育種群體的遺傳狀況，導(dǎo)致近親雜交，子代產(chǎn)生各種問題。徐鋼春等[15]對灌江納苗養(yǎng)殖刀鱭（Coilianasus）的子三代品種與在淡水生活環(huán)境下湖鱭（C.nasustaihuensis）兩個群體的遺傳多樣性進行了比較和分析，進行單倍型和核苷酸分析后，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖刀鱭的遺傳多樣性要優(yōu)于湖鱭，這可能是由于刀鱭僅是子三代，還未經(jīng)歷大量的人工繁殖和育種，保留了較好的遺傳狀況；而湖鱭由于其陸封型的特點，導(dǎo)致其種質(zhì)資源漸漸下降，需要進行放流等活動保證種質(zhì)資源。姚茜等[16]對來自浙江湖州某公司的養(yǎng)殖群體、緬甸引進的群體和兩者雜交的“南太湖1號”群體的羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）的D-loop區(qū)進行分析，共16尾群體分析得到14個單倍型，結(jié)果表明緬甸引進的群體核苷酸多樣性最高，浙江湖州人工養(yǎng)殖群體的多樣性最低，說明人工育種對遺傳多樣性有較大的影響。通過遺傳距離和遺傳分化指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，雜交群體更加偏向本地種群。在今后的育種工作中，可在雜交代中選取優(yōu)秀性狀的沼蝦，與緬甸種群雜交，以獲得更優(yōu)秀的品種，為今后的人工繁育打下基礎(chǔ)。李勝杰等[17]將珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖品種大口黑鱸（Micropterussalmoides）與北方和佛羅里達兩個野生群體進行D-loop區(qū)的遺傳分析，在23尾采集的樣品中，5尾個體含有兩種單倍型，北方11尾個體發(fā)現(xiàn)9種單倍型，而佛羅里達僅有1種單倍型。在遺傳距離分析上發(fā)現(xiàn)，珠江水產(chǎn)研究所的養(yǎng)殖群體與北方群體更加接近。對于單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析，結(jié)果表明養(yǎng)殖群體與國外種群相比，其遺傳多樣性處于較低水平，需要開展種質(zhì)的保護工作，應(yīng)引入國外品種進行雜交，改善國內(nèi)養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)，提高遺傳多樣性，豐富大口黑鱸的種質(zhì)資源。

1.3親緣與起源分析D-loop區(qū)串聯(lián)重復(fù)的現(xiàn)象雖然豐富，但是不同動物的重復(fù)位置不一致，重復(fù)的序列和重復(fù)的單元也不一致，所以相近物種之間對比分析有助于明確不同物種的關(guān)系。郝君等[18]對烏克蘭鱗鯉（Cyprinuscarpio）、鯽（Carassisauratus）、鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）、鳙（Aristichthysnobilis）、草魚（Ctenopharyngodonidellus）和烏蘇里擬鲿（Pseudobagrusussuriensis）6種不同魚的線粒體D-loop區(qū)進行測序，分析了種內(nèi)、種間遺傳結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)作為分子標記對系統(tǒng)分化效果的差異，6種不同魚的堿基含量、堿基差異、遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育都有顯著的差異，構(gòu)建的D-loop序列的NJ系統(tǒng)樹展示了6種魚的分類地位，肯定了D-loop區(qū)比鄰近區(qū)段的tRNA和12sRNA在魚類識別、分類、種類鑒定和遺傳多樣性分析上更加可靠。侯新遠等[19]對5種蝦虎魚類進行了系統(tǒng)進化關(guān)系的研究，分析了河川沙塘鱧（Odontobutispotamophila）、鴨綠沙塘鱧（O.yaluensis）、中華沙塘鱧（O.sinensis）、葛氏鱸塘鱧（Perccottusglenii）及尖頭塘鱧（Eleotrisoxycephala）這6種蝦虎魚類同源長度約為830bp的D-loop序列，通過系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離分析，得到6種魚類的親緣關(guān)系即河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、平頭沙塘鱧聚為一支，尖頭塘鱧、葛氏鱸塘鱧和褐塘鱧等聚為另一支，為魚類資源的分類和利用提供了基礎(chǔ)。馬波等[20]在額爾齊斯河采集了兩種類型的銀鯽（C.auratusgibelio），對幾種鯽魚的可量性狀和D-loop區(qū)進行分析，得到了優(yōu)勢種群的生長性狀，確定了它們的遺傳學(xué)特征和分類學(xué)地位，同時通過D-loop區(qū)的單倍型共享率研究了兩種鯽的起源和遺傳特征，這些結(jié)果對我國將來進行銀鯽育種有很大幫助。Klaus等[21]利用D-loop序列對歐洲鯉魚（C.carpio）137的起源進行研究。在此之前對于歐洲鯉魚也有過很多關(guān)于起源的研究：Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)一些歐洲養(yǎng)殖的鯉魚起源可能在德國和歐洲，而俄羅斯主要養(yǎng)殖的鯉魚起源在亞洲。Zhou等[23]在德國鏡鯉和伏爾加河的野生鯽魚利用D-loop區(qū)全序列獲得獨特的3種單倍型；而Mabuchi等[24]在日本鯉魚中發(fā)現(xiàn)有兩個D-loop區(qū)單倍型與Zhou等報道的歐洲發(fā)現(xiàn)的單倍型非常相似。Klaus等[21]的研究結(jié)果指出歐洲和中亞所有的鯉魚品種有一個共同的祖先，而且有可能是在后冰河時期傳播到中亞或者歐洲。對于這種現(xiàn)象，可能是由于在育種過程中，沒有進行規(guī)范的養(yǎng)殖記錄，導(dǎo)致各種群出現(xiàn)雜交現(xiàn)象。而且，養(yǎng)殖戶挑選具有優(yōu)勢性狀的品種進行，容易導(dǎo)致其他稀有單倍型的消失，從而使得種質(zhì)資源慢慢下降。

1.4個體內(nèi)異質(zhì)性分析同一個體內(nèi)存在多種重復(fù)序列數(shù)目不同從而表現(xiàn)為異質(zhì)。高祥剛等[25]采用克隆技術(shù)，在我國海域隨機采集了3頭斑海豹（Phocalargha），每尾個體任選14個克隆菌，對它們的線粒體DNAD-loop區(qū)的終止序列區(qū)進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)其個體內(nèi)存在多種不同的串聯(lián)重復(fù)單位，即存在異質(zhì)現(xiàn)象，說明我國的斑海豹種質(zhì)資源保護較好，進化狀態(tài)比較積極。張四明等[26]在野生的中華鱘種群種間和個體體內(nèi)檢測線粒體DNA的長度變異情況，發(fā)現(xiàn)中華鱘有較多個體的異質(zhì)性，表現(xiàn)出良好的遺傳多樣性。由此可見，個體的異質(zhì)存在是導(dǎo)致線粒體DNA中控制區(qū)D-loop長度變化的主要原因，而個體的線粒體DNA長度異質(zhì)性是直接推動動物物種遺傳多樣性的重要途徑。綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)線粒體D-loop區(qū)的序列分析已經(jīng)在水產(chǎn)行業(yè)取得大量進展，D-loop區(qū)基因的插入、突變和替換都是影響多樣性的關(guān)鍵，而個體內(nèi)的異質(zhì)和串聯(lián)重復(fù)的高頻率變化不僅存在于水產(chǎn)動物個體中，也存在于種群內(nèi)，甚至在不同物種之間都對野生水產(chǎn)動物的起源、親緣關(guān)系、遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和動物進化程度起著重要的作用。在養(yǎng)殖群體中，D-loop區(qū)的分析正在漸漸起到重要的作用，若結(jié)合微衛(wèi)星、RFLP等其他分子標記技術(shù)，將來對人工育種和對親魚、親蝦的選育工作有重大意義。

2細胞色素b序列（cytb）

線粒體DNA中編碼蛋白質(zhì)的基因有還原型輔酶I的亞基、ATP合成酶的亞基、細胞色素c氧化酶的3個亞基和細胞色素b[27]。Zardoya等[28]研究認為，cytb的進化速度適中，適合進行種內(nèi)和種間的遺傳分析。現(xiàn)今利用cytb序列多數(shù)用于種內(nèi)和種間的遺傳分化分析、遺傳圖譜建立和遺傳多樣性調(diào)查，并輔以其他標記技術(shù)進行組合分析。王曉梅等[29]獲取中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)cytb序列的PCR產(chǎn)物后，利用DGGE技術(shù)分析了溫州、儀征、江都、南京、盤錦和合浦地區(qū)的中華絨螯蟹的遺傳多樣性，并與合浦絨螯蟹(E.japonicahepuensis)對比，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹與合浦絨螯蟹遺傳距離較大，在親緣關(guān)系上具有顯著的差異，但是仍有部分遺傳標記相同，說明存在一定的基因交流。

黃小彧等[30]利用cytb序列檢測了長江支流貴定與干流合江和宜都的中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)群體的遺傳多樣性，分析群體的遺傳距離，結(jié)合地理因素分析了該物種的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)合江的遺傳多樣性最好，而支流群體與干流群體的遺傳分化較大，地理隔離使同一物種的基因交流程度降低。夏月恒等[31]利用cytb序列對中國近海3個地區(qū)的鮸魚（Miichthysmiiuy）的遺傳多樣性進行分析，通過對地理環(huán)境和歷史因素的解釋，認為中國鮸魚基因型的單倍型多樣性高和核苷酸多樣性低可能是因為種群在某個時期突然擴張，使單倍型突變大量產(chǎn)生，但這段時間對于提高核苷酸多樣性時間不足，所以產(chǎn)生了如此差別；且Fst結(jié)果極低，說明該地區(qū)遺傳分化程度很低，加上不同地理的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖交錯呈現(xiàn)，有可能是因為種群由于擴張之后還未達到平衡，需要對該地區(qū)進行保護。鐘立強等[32]調(diào)查了長江中下游5個湖泊的黃顙魚，利用cytb序列分析了不同地區(qū)遺傳多樣性和遺傳分化的程度，60尾個體檢測出37個單倍型，F(xiàn)st分析顯示這5個種群的變異大部分都來自群體內(nèi)，說明各個種群間有一定的基因交流，系統(tǒng)樹顯示它們沒有分化成譜系。司從利等[33]從長江貴定和樂山兩個群體的泉水魚cytb序列分析其遺傳狀況、結(jié)構(gòu)和多樣性程度，發(fā)現(xiàn)這兩個群體由于三峽大壩的地理因素，已明顯受到嚴重的影響，出現(xiàn)高度的遺傳分化，建議對該物種進行分區(qū)保護，提高遺傳多樣性，豐富種質(zhì)資源。

司從利等[34]在廣東、廣西等地基于cytb序列分析了華南居氏銀魚（Salanxcuvieri）的遺傳現(xiàn)狀，從鄰接樹上可發(fā)現(xiàn)有一定的分支，認為地理因素正在逐漸影響遺傳結(jié)構(gòu)，推測瓊州海峽的地理位置可能影響廣東、廣西種群間的遺傳交流；中性檢測結(jié)果表明在更新世晚期發(fā)生擴增，地球當時的氣候影響了該種群的遺傳多樣性；根據(jù)現(xiàn)狀，建議分地區(qū)對該種群進行人為保護，避免出現(xiàn)種質(zhì)退化。李偉文等[35]兩年中在7個遠洋捕撈點采集了黃鰭金槍魚（Thunnusalbacares），擴增了cytb部分序列得到663bp，108尾個體僅有24個單倍型，且單倍型多樣性和核苷酸多樣性都處于較低水平，群體的遺傳多樣性較差；Fst分析得到變異大多發(fā)生在群體內(nèi)部，表明其遺傳分化程度較低，并且基因交流非常強烈，種質(zhì)資源正在衰退，這與人類破壞環(huán)境和大面積捕殺有密切關(guān)系。謝楠等[36]利用cytb對魴屬（Megalobrama）4種魚類及長春鳊（Parabramispekinensis）進行了系統(tǒng)分類。但在結(jié)果分析過程中僅靠cytb的信息難以準確將不同品種進行區(qū)分，仍需要配合其他標記進一步研究。

3其他標記與組合分析

16SrRNA序列、12SrRNA序列和COI序列在線粒體基因組中變異速度較慢，保守性較高，因此很難由其單獨作為驗證工具來進行遺傳分析，往往需要結(jié)合其他的基因片段，才能同時作為鑒定種內(nèi)親緣關(guān)系和物種遺傳多樣性程度的工具。劉萍等[37]選取了山東青島中華虎頭蟹（Orithyiasinica）野生群體的16SrRNA和COI基因片段研究其遺傳多樣性，但是發(fā)現(xiàn)16SrRNA變異程度較小，效果不佳；在遺傳距離和系統(tǒng)進化研究中，兩種技術(shù)檢測了不同蟹之間的親緣關(guān)系以及它們的進化分化時間，利用NJ系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)中華虎頭蟹與梭子蟹類的親緣關(guān)系最近，并采用“分子鐘”對4個蟹類的分化時間進行計算。吳玲等[38]對沿海6個群體的白氏文昌魚（Branchiostomabelcheri）和日本文昌魚（B.japonicum）分別進行COI和16SrRNA序列的研究，發(fā)現(xiàn)兩種魚種內(nèi)遺傳多樣性較高，但還沒有明顯的遺傳分化；其中茂名群體和威海群體具有最高的核苷酸多樣性，很有可能為這兩類魚的祖先。

翁朝紅等[39]對近江蟶（Sinonovacularivularis）、縊蟶（S.constricta）、小刀蟶（Cultellusattenuatus）、尖刀蟶（C.scalprum）和大竹蟶（Solengrandis）的COI和16SrRNA部分序列進行測序和分析，在進行遺傳距離和系統(tǒng)演化分析后，結(jié)果表明近江蟶已進化至獨立為一個種，并且通過聚類分析推斷近江蟶應(yīng)歸屬于竹蟶超科，解決了這幾種蟶分類歸屬。郁建鋒等[40]結(jié)合12SrRNA和16SrRNA的序列為太湖流域河川沙塘鱧的分類提供了重要的幫助，發(fā)現(xiàn)了大量的變異位點和簡約位點，而且在兩種標記的驗證下，比較得出太湖流域河川沙塘鱧與福建流域河川沙塘鱧已經(jīng)存在一定的遺傳差異。同時，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，太湖流域河川沙塘鱧與其他鱧已存在遺傳分化差異。王慶容等[41]對長江中上游舞陽河、烏江、雅礱江、岷江和金沙江5個野生鲇(Silurusasotus)群體的親緣關(guān)系和遺傳差異進行了分析，對比了核苷酸和單倍型多樣性，發(fā)現(xiàn)舞陽群體與其他群體的親緣關(guān)系較遠。楊慧榮等[42]同時利用D-loop和cytb的序列對長江水系的赤眼鱒（Squoliobarbuscurriculus）進行了遺傳多樣性的分析，通過遺傳變異率、單倍型多樣性等指標發(fā)現(xiàn)長江赤眼鱒遺傳多樣性較高，種質(zhì)狀況較好；同時，根據(jù)Fst和分子變異等級差異分析發(fā)現(xiàn)，不同水系的群體存在明顯的遺傳分化；系統(tǒng)發(fā)育樹證明了珠江水系赤眼鱒與長江水系赤眼鱒正在逐漸分化為兩類群體，并提出cytb序列在變異顯著的群體間更能發(fā)揮作用。

孫希福等[43]利用cytb序列和D-loop序列分析了江豚（Neophocaenaphocaenoides）在鼠豚類及一角鯨類的分類地位，系統(tǒng)發(fā)育樹表明，江豚的遺傳距離與一角鯨科較為接近，并確定棘鰭鼠海豚、太平洋鼠海豚及黑眶鼠海豚3種群有較近的親緣關(guān)系，否定了之前僅憑借形態(tài)學(xué)的分類方式。畢瀟瀟等[44]在某一水產(chǎn)品公司采集了來自美國與荷蘭的狹鱈（Theragrachalcogramma）、太平洋鱈（Gadusmacrocephalus）、藍鱈（Micromesistiuspoutassou）和遠東寬突鱈（Eleginusgracilis）4種不同屬的鱈魚，利用16SrRNA、cytb和COI序列比較了它們的序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)核苷酸分歧速率以及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，將太平洋鱈、狹鱈和寬突鱈歸為一支，也顯示了它們較接近的遺傳距離，給分類學(xué)提供了非常重要的理論基礎(chǔ)。

4展望

線粒體分子標記技術(shù)主要用于物種的遺傳多樣性分析、親緣、親權(quán)分析和物種進化程度分析。該基因組功能重要且能穩(wěn)定遺傳，是物種個體基因組中變化速度較快且保留較好的部分。對D-loop區(qū)的序列進行測序、比對、計算和分析后能得到物種的種屬分類、遺傳結(jié)構(gòu)、歷史發(fā)育情況和遺傳多樣性狀態(tài)。而且，D-loop區(qū)穩(wěn)定的母系遺傳，使得分析起源有較好可靠性，聚類分析結(jié)果準確。同時，細胞色素b和16SrRNA等序列雖然進化速度較慢，但其穩(wěn)定性的特征可以得到較好保留，獲得的插入、替換和缺失等突變可以持續(xù)遺傳，以作為數(shù)據(jù)分析的可靠依據(jù)。在進行不同情況的分析時，可以結(jié)合一到兩種分子標記技術(shù)，作為重要的輔助參考標記。

綜上，在水產(chǎn)行業(yè)的遺傳分析中，野生群體的遺傳多樣性是將來進行育種和引進的關(guān)鍵，通過線粒體分子標記技術(shù)對野生經(jīng)濟水產(chǎn)動物的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析是高效、準確和可靠的。其中單倍型多樣性和核苷酸多樣性表現(xiàn)了分子結(jié)構(gòu)的變異程度，體現(xiàn)了野生群體種質(zhì)資源的現(xiàn)狀；遺傳分化特征能表現(xiàn)群體的基因交流狀況，表明了群體間自由的自由度；分子變異等級分析可以讓我們了解不同地域群體突變的來源，表現(xiàn)了群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異；中性檢測等分析從分子層面揭示了魚類的系統(tǒng)發(fā)育狀況。

篇9

【關(guān)鍵詞】 變應(yīng)性鼻炎 基因 遺傳性疾病

【Abstract】 Becoming to relate to heredity factor in response to allergic rhinitis， it be a kind of hereditary disease of complicated many gene hereditary disease， but still have no concrete heredity mode and characteristic. There were reports confirm， inherit factor can also cause lower breath tract mucosa respond that allergic increases a heighten or inflammation disease to turn worse but causes asthma. Obtaining in response to the disease house especially through epidemiology inquisition in recent years， to positive gender inpidual of the DNA carry on tiny satellite marking the catena of the analysis， already at this there aren’t a few gene areas on the foundation， such as some candidate for election genes and IgE level related 11q13 areas and 12 q， and detection relevant of the pit factor NF-B activated protein AP-1， histamine receptor and related gene， 5-lipoxygenase (ALOX5)， anti-angiotensin-converting enzyme(ACE)， endothelin gene ET-1 etc.，participate allergic reaction. In the meantime， discover the mutation for having something to do with that disease in some genes. But currently didn’t yet report the particularity that should get sick with the result that the gene of disease， this article makes progress to discuss a evolvement with philosophy in recent years.

【Key words】 allergic rhinitis；gene；hereditary disorders

變應(yīng)性鼻炎又稱過敏性鼻炎， 是特應(yīng)性個體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的介質(zhì)(主要是組胺)釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病，是世界范圍內(nèi)常見病，且不易被治愈。我國的變應(yīng)性鼻炎患者由于人口眾多，與其他國家相比，患者絕對數(shù)是驚人的，冷空氣刺激、氣候變化等是變應(yīng)性鼻炎的危險因素，且大部分患者有家族史，家系和一級親屬患病率明顯高于普通人群，說明變應(yīng)性鼻炎有遺傳性。同時提出了包括哮喘、鼻炎、過敏性皮疹在內(nèi)的特應(yīng)癥的概念。近年來分子遺傳學(xué)的研究表明，由于哮喘、變應(yīng)性鼻炎、過敏性皮疹相同的特點，可能受相同的易感基因控制，同時，流行病學(xué)的資料也表明哮喘和變應(yīng)性鼻炎是相關(guān)的上呼吸道炎癥疾病，只是基因表現(xiàn)的不同而出現(xiàn)嚴重程度不一的癥狀。熊伯華［1］等2004年在對一男性變應(yīng)性鼻炎患者詢問家族史過程中，發(fā)現(xiàn)其家族連續(xù)5 代都有變應(yīng)性鼻炎患者，進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該家族共五代111 人，Ⅱ、Ⅲ代皆為變應(yīng)性鼻炎患者。患病率均為100 %。Ⅳ代有19人患病，患病率為65.52%。Ⅴ代也有11人患病，患病率為26.83%，患病最小年齡為13歲， Ⅲ、Ⅳ代患病率高達73.53% ，先證者Ⅰ級親屬患病率為50%，比已經(jīng)報道的全球平均發(fā)病率在10%～25%高出很多。現(xiàn)我們收集變應(yīng)性鼻炎的文獻和家系資料，分析遺傳特征及遺傳相關(guān)危險因素。

1 相關(guān)IgE相關(guān)的候選基因

在變應(yīng)性鼻炎的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，其血清IgE水平增高，所以認為可能是鼻炎及特應(yīng)癥的一種基因表型，其中就有一些學(xué)者認為高IgE表達是常染色體顯性遺傳并有多種臨床表現(xiàn)，但是Meyer［2］在42個核心家系中選了278例陽性個體作研究，雖認為就IgE遺傳模式存在一個主要的明顯的IgE調(diào)控基因，但卻主要是通過常染色體隱性遺傳，而其他的學(xué)者［3］或是認為有一個單基因，或是認為是多個基因相互影響，這些沖突的結(jié)論可能是由于所取樣本不一，也可能受到種族或環(huán)境的影響。因此，臨床醫(yī)師或者研究員都不能局限在熟悉的狹小圈子里，或局限在有限的種族和環(huán)境中，應(yīng)該跳出思維慣性和思維狹窄范疇，顧及環(huán)境的變化，對人體基因和環(huán)境的相互作用、相互聯(lián)系等多方面因素考慮，在研究中選取精確的樣本，進行數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析用SPSS13.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，患病率用χ2檢驗，理論頻數(shù)< 5 時，計算Fisher’s 精確概率，遺傳度用Falconer 法計算［4］。然而目前要想在研究中嚴格控制環(huán)境的影響是比較難的。近年來，IgE基因定位的研究進展很快，其中最廣的是11q13相關(guān)區(qū)域，1989年Wocm在7個特應(yīng)癥家族進行遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)該區(qū)連鎖的LODS人高達5.58，提出的鼻炎和哮喘相關(guān)的IgE基因位點很可能位于11q13上，認為該區(qū)域調(diào)控IgE的表達，并由于存在突變或其他因素而影響患者的IgE水平，導(dǎo)致一定環(huán)境下患者產(chǎn)生過敏。隨后英國和日本也進行了大規(guī)模的群體研究，在肯定此種連鎖基礎(chǔ)上，同時定位相關(guān)基因于該染色體上高親和的IgE受體β鏈（FcεRI-β），并報道發(fā)現(xiàn)該區(qū)有ILE181LEU和GLU237GLY突變［5］，并推測該變異可能增加受體的信號傳遞能力，增加肥大細胞釋放IL-4，并相應(yīng)刺激高水平的IgE合成，從而引起炎癥反應(yīng)。然而另外很多研究卻發(fā)現(xiàn)，該相關(guān)性只存在于一定的人群而不具有普遍性，如Clause［6］在Freiburg地區(qū)調(diào)查了463個家族，以皮膚抗原測試。并經(jīng)IgE測定陽性為過敏體質(zhì)，選取302個家族做以FcεRI-β基因引物對標本進行PCR擴增、電泳、TDT連鎖不平衡分析，在該區(qū)卻未發(fā)現(xiàn)這兩個突變，也未發(fā)現(xiàn)其他突變，對此發(fā)現(xiàn)不持肯定態(tài)度。所以就目前的研究看來，相應(yīng)的特應(yīng)癥IgE候選基因的定位上還是存在較大差異的觀點。

2 相關(guān)細胞因子基因簇的研究

變應(yīng)性鼻炎主要為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)， 臨床和實驗研究主要著重于IgE所導(dǎo)致的臨床相關(guān)癥狀，遺傳方面也主要研究與IgE有關(guān)的基因。隨研究深入， 許多癥狀難以僅用IgE所導(dǎo)致Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)完全解釋，隨后發(fā)現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)性炎癥中有很多細胞因子的參與， 且相應(yīng)有高水平的表達，所以在相關(guān)的細胞因子及其受體的基因位點尋找特應(yīng)癥的候選基因也是一個途徑，現(xiàn)在研究較多的是5號染色體和12號染色體， 二者都有一個聚集的細胞因子集落基因， 前者含有一些內(nèi)皮細胞表達的細胞因子如IL-1、 IL-4、 IL-5、 IL-6、IL-8、 IL-11、 IL-15及CSF、 集落刺激因子（G-CSF、 M-CSF、 GM-CSF）， 以及相應(yīng)的趨化因子、單核細胞趨化吸附蛋白MCP-1、 嗜酸細胞趨化因子PANTES。Kdppelman［7］在Holland對哮喘核心家系調(diào)查， 表明高IgE與5q細胞因子基因簇的確存在著明顯的相關(guān)性。Marsh［8］通過血緣分析法選取11個Amissh家族， 170個體， 在5q31.1選用5個微衛(wèi)星標記， 發(fā)現(xiàn)該區(qū)與IL-4有明顯相關(guān)。所報道的IL-4基因位于5q31近端部分25kb， IL-4［9］是激活B淋巴細胞使之表達IgE的重要因子之一， 它能導(dǎo)致大量IgE與肥大細胞表面的IgE受體結(jié)合， 激發(fā)肥大細胞脫顆粒， 釋放一系列與炎癥有關(guān)的介質(zhì)， 引起黏膜水腫， 黏液分泌增加， 氣道痙攣，還能通過上調(diào)血管內(nèi)皮VCAM-1表達和上調(diào)嗜酸性細胞趨化因子的產(chǎn)生而促進嗜酸細胞局部的聚集， 促進炎癥發(fā)展， 與IgE存在一定相關(guān)性。 有報道在IL-4引導(dǎo)區(qū)發(fā)5 個變異， 其中一個變異是IL-4引導(dǎo)區(qū)， -590C/T， 已在美國［10］和日本［11］證實與IgE水平相關(guān)。 但是其他的研究卻不能相應(yīng)重復(fù)其相關(guān)性， 所以對其與IE合成的相關(guān)尚還缺乏信服的依據(jù)。從疾病的運動發(fā)展中去把握反映病變基因本質(zhì)的特征 疾病是一個發(fā)展變化著的過程，每地區(qū)性很可能存在較大的差別，要正確掌握各個具體病變的矛盾特殊性，就必須以運動發(fā)展的觀點把握病程演變的規(guī)律。找到基因突變的規(guī)律性或各地區(qū)存在的差異特點。同時還需要另一方面與特應(yīng)癥相關(guān)的基因，如激素受體基因、M-CSF基因、β2腎上腺受點，并認為該基因簇只與氣道高反應(yīng)有關(guān)。由于各種人群采樣的不同，使研究結(jié)果存在明顯的出入，所以對該區(qū)確切的相關(guān)基因位點的結(jié)論尚需進一步的研究。雖然在細胞因子基因簇的研究中發(fā)現(xiàn)了很多可能的基因點，但仍需廣泛的集思廣益。有研究者發(fā)現(xiàn)第12對染色體也是一個典型的候選基因區(qū)，其中包括γ干擾素、NOS、干細胞因子、類胰島素生長因子-1及核因子NFYB和信息因子STAT-6。γ干擾素可以啟動激發(fā)T輔助1型細跑( Thl)的分化，從而產(chǎn)生抑制Th2淋巴細胞分化及IL-4產(chǎn)生的反應(yīng)力，從而達到減少變應(yīng)性疾病和哮喘的發(fā)病率。類胰島素生長因子-1參與B、T淋巴細胞的分化，NFYB亞型參與MHC Ⅱ類和IL-4基因的上調(diào)。Kathleen［12，13］使用17個微衛(wèi)星標記對該區(qū)域進行不平衡連鎖分析，發(fā)現(xiàn)12q15～24.1區(qū)與IgE相關(guān)，認為它可能是特應(yīng)癥的候選基因，推測可能該區(qū)域的多基因單獨或相互作用而參與變態(tài)炎性反應(yīng)。還進一步發(fā)現(xiàn)12q13.12～q23.3還含BTG1（B細胞轉(zhuǎn)化基因1）［14］及相關(guān)的STAT6信號肽，該信號肽參與IL-4的很多生物活性如誘導(dǎo)IgE和Th2淋巴細胞轉(zhuǎn)化，特別發(fā)現(xiàn)其中的IFNGCA和D12S313兩個微衛(wèi)星的連鎖位點與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)分析有統(tǒng)計學(xué)意義。盡管原因尚未闡明。但是多年前做過很多實驗，就證明了變應(yīng)性疾病是遺傳的，并且符合基因的遺傳規(guī)律。然基因是有分離規(guī)律的，Heinzmann［15，16］在特應(yīng)癥狀的核心家系中使用12q13～24中的4個高度多態(tài)的微衛(wèi)心標記作血緣相關(guān)分析和連鎖不平衡試驗，同時使用SSCP-分析和直接測序相結(jié)合分析SPF、LTA4H、TR2和STAT6基因的多態(tài)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該區(qū)與血清IgE水平、吸入物過敏或特應(yīng)質(zhì)相關(guān)，并且雖證實在SCF基因上有3個單核苷酸多態(tài)并含一常見突變，但均與該病無關(guān)。筆者也獨立做過幾個同類的實驗，實驗方法、實驗材料相同，結(jié)果完全相同。這里我們必須分析一下，人對問題認識、對地區(qū)性的認識、對環(huán)境污染和過敏物質(zhì)的認識，在前文講到變應(yīng)性鼻炎問題時，曾提到認識問題，現(xiàn)在需要著重探討一下。

3 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的研究

研習(xí) 2001 年人類基因組計劃、美國塞萊拉遺傳信息公司在美國《科學(xué)》雜志和英國《自然》雜志聯(lián)合宣布，他們繪制出了準確、清晰、完整的人類基因組圖譜。基因組計劃完成后新的難題擺在了科學(xué)家的面前，就是基因功能的研究，以及怎樣提高基因功能研究的效率。轉(zhuǎn)基因技術(shù)較好地繼承了生理學(xué)原有的研究思路，可能成為基因與整體功能聯(lián)系起來的重要研究方法之一，成為今后大規(guī)模進行基因功能研究的有效手段。現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究上述問題的很好工具， 通過它可以對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因， 利用分子生物學(xué)技術(shù)增強或減弱其表達水平， 然后觀察實驗動物整體功能狀態(tài)的變化， 推測相應(yīng)基因的功能。轉(zhuǎn)基因技術(shù)很好地繼承了生理學(xué)的研究思路， 是研究基因功能的有力手段， 是將基因與其整體功能聯(lián)系起來的重要研究方法。轉(zhuǎn)錄因子是能影響基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白，它的重要性在于參與多種生理反應(yīng)，許多疾病的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子水平上的變異導(dǎo)致基因產(chǎn)物的變化而引起疾病的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)有一些轉(zhuǎn)錄因子參與變態(tài)反應(yīng)過程，如核因子NF-κB在免疫刺激物因素作用下可激活而調(diào)節(jié)許多與免疫功能和炎癥有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB本身序列是GGACTTTCC，能與某些基因啟動子區(qū)的固定核苷酸序列位點結(jié)合而啟動基因的轉(zhuǎn)錄，而許多參與變態(tài)炎癥反應(yīng)的物質(zhì)如IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1、MHC-1等均含該固定核苷酸序列，在免疫原的刺激下，NF-κB的活化引起這基因轉(zhuǎn)錄增加、并能進一步反饋，擴大炎癥信息。在對變態(tài)反應(yīng)性的研究中可發(fā)現(xiàn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，同時，糖皮質(zhì)激素、水楊酸鹽及其他免疫抑制劑卻可通過阻止核轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的DNA結(jié)合，而抑制炎癥過程，對此類抗炎藥物的作用提出新的解釋。因此我們在研究變應(yīng)性鼻炎與基因相關(guān)因素時，還發(fā)現(xiàn)一氧化氮的產(chǎn)物也可抑制內(nèi)皮細胞NF-κB的活性［17，18］，抑制血小板粘附和平滑肌增殖，并降低內(nèi)皮白細胞的粘附，這對于新的抗過敏藥物的研究有所啟示。另一個轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白AP-1也是參與體內(nèi)免疫系統(tǒng)調(diào)控的重要的轉(zhuǎn)錄因子，AP-1屬堿性亮氨酸長鏈，AP-1參與T細胞的活化和多種細胞因子基因表達的調(diào)控，和參與B細胞的活化及免疫球蛋白產(chǎn)生的調(diào)控。在過敏原刺激時能迅速誘導(dǎo)AP-1的產(chǎn)生并相應(yīng)與T細胞、B細胞及細胞因子的啟動子調(diào)控區(qū)的AT-1位點結(jié)合，而調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，該調(diào)控過程在變態(tài)反應(yīng)中存在異常［19］。由于轉(zhuǎn)錄因子在炎癥過程中的作用，所以變態(tài)反應(yīng)性疾病很可能存在轉(zhuǎn)錄基因上的變異，通過復(fù)雜的作用機制誘導(dǎo)疾病的發(fā)生，所以現(xiàn)在各國都在尋找控制轉(zhuǎn)錄因子基因上的突變，該方面研究的突破必將對疾病病因及治療帶來新的局面。

4 其他相關(guān)候選基因的研究

在研究其他的候選基因時，應(yīng)該有更廣闊的思維，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，使臨床醫(yī)生研究員確實有了更多的手段來進行疾病病因的準確定位和定性，這無疑使研究及診治水平大為提高，但值得注意的是，對于變應(yīng)性鼻炎既要局部的縱深發(fā)展研究，也要更廣的研究和聯(lián)系。對于其他的候選基因的研究包括對變應(yīng)性炎癥中出現(xiàn)的高組胺的研究，炎癥狀態(tài)時，肥大細胞釋放大量的組胺，血液中組胺含量明顯增高，并出現(xiàn)相應(yīng)的血管擴張，平滑肌收縮，Marianne［20］通過對組胺受體基因進行引物PCR擴增，Northern blot原位雜交定位分析，研究了組胺受體及相關(guān)基因，并通過基因組的比較和cDNA的克隆而將相關(guān)的編碼區(qū)的啟動子區(qū)定位于3p25，進一步的研究還發(fā)現(xiàn)該區(qū)含一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子位點，包括AP1、AP2和NF-κB的DNA位點，所以可能受這些與炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并推測在炎性條件下，因AP1和NF-κB表達增加而使H1受體轉(zhuǎn)錄增多，出現(xiàn)相應(yīng)的組胺表達增多，影響變態(tài)反應(yīng)的炎性過程。Hirata ［21］在11例鼻炎患者的下甲黏膜中使用H2R and betaactin mRNA 進行RT-PCR和H2R cRNA探針雜交，結(jié)果證實在上皮及黏膜二腺體中存在H2R的mRNA，并認為它的增長在鼻炎中起促進作用。筆者重復(fù)同樣試驗，得出相同的結(jié)論。白三烯是重要的炎癥介質(zhì)，能引起局部血管擴張，通透性增加，炎性介質(zhì)滲出等一系列炎性反應(yīng)，對白三烯相關(guān)基因的研究也是特應(yīng)癥研究中的一個熱點。其中5-脂氧合酶（ALOX5）不合成白三烯代謝途徑的關(guān)鍵，有學(xué)者認為，可能在鼻炎及特應(yīng)癥的患者中，相關(guān)的基因區(qū)和蛋白編碼區(qū)存在著突變，并有相應(yīng)的候選基因。Jeffrey［22］使用ABT-761（一種選擇的ALOX5抑制劑），對926例過敏體質(zhì)和235例正常對照作雙盲試驗，分析ALOX5等位基因的頻率，結(jié)果表明在10q11.2位點的ALOX5相關(guān)基因，在特應(yīng)癥患者中該區(qū)變異時能導(dǎo)致ALOX5產(chǎn)物的減少及對抑制ALOX5的藥物治療不敏感，說明ALOX5等位基因在該類病人存在差異，具體突變和致病基因當然還需要進一步的研究。在17q23上的人體抗血管緊張轉(zhuǎn)換酶ACE（Angiotensin-Converting Enzyme）基因也是一個研究熱點，ACE可抑制炎性神經(jīng)肽如速激肽，P物質(zhì)等而阻止第二步的炎癥反應(yīng)。1997年Benessino［23］ACE基因I/D多態(tài)與特應(yīng)癥存在相關(guān)，其DD基因型影響特應(yīng)癥的病理生理，不僅能活化血管緊張素Ⅱ，引起氣道平滑肌的變化，而且能作用于炎性細胞導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放。研究中發(fā)現(xiàn)特應(yīng)癥患者中I/D ACE等位基因與正常對照比有統(tǒng)計學(xué)意義。其他的候選基因如6p23～24上的內(nèi)皮素（ET-1）基因；免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)基因如MHC Ⅰ和 Ⅱ等位基因及T細胞及抗原受體基因［24］。T細胞及抗原受體TCR基因位于14q11～13。TCR可誘導(dǎo)T細胞活化和發(fā)揮免疫效應(yīng)，與特異性IE反應(yīng)有關(guān)，也與T細胞的發(fā)育成熟以及T細胞在胸腺中的克隆排除有關(guān)，并與某些自身免疫病和腫瘤有關(guān)［25］。還有學(xué)者認為beta-2腎上腺素受體基因多態(tài)與特應(yīng)病相關(guān)，推測3.1kb和2.9kb的兩個點可能與哮喘和鼻炎相關(guān)的等位基因［26］。

5 結(jié)語和展望

總之，變應(yīng)性鼻炎及特應(yīng)癥是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，其受遺傳和環(huán)境的雙重影響，對其遺傳方式及相關(guān)基因的研究是目前的一個熱點。變應(yīng)性疾病是一個復(fù)雜的免疫和炎癥性疾病，它的病理生理學(xué)過程比較復(fù)雜，包括多種基因的相互作用，遺傳因素與環(huán)境因素的互動以及不同族群的反應(yīng)性差異等。近年來，全球變應(yīng)性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是在生活水平較高的工業(yè)化或發(fā)達國家，患病率大約為10%～25% ，呈現(xiàn)高流行率。目前我國缺乏全國范圍內(nèi)的變應(yīng)性鼻炎流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這提示流行病學(xué)調(diào)查是今后我國該領(lǐng)域研究的一個重要課題。然變應(yīng)性疾病可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可精確地操作單個基因，也可以研究經(jīng)典遺傳學(xué)無法了解的基因的表型效應(yīng)。雖然目前可以做到某些組織中的特異性表達，但并非所有組織都能做到這一點。這樣就出現(xiàn)了在多個組織中的表達或者敲除基因，空間特異性就差一些，這給基因的功能研究帶來了許多不確定性。因此，在今后的研究中應(yīng)該注意組織和時間特異性的控制。另外，基因表型之間的關(guān)系的研究模式過于簡單化，應(yīng)結(jié)合蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，在不同基因、蛋白質(zhì)之間建立聯(lián)系，研究其相互調(diào)控關(guān)系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將出現(xiàn)可調(diào)控多個基因的動物模型，這必將推動基因之間關(guān)系的研究。目前的基本思路是推測某些基因的功能， 然后將其敲除進行驗證。現(xiàn)在還未形成大規(guī)模的研究，這其中存在的問題就是有可能漏掉了發(fā)現(xiàn)這個基因其他功能機會。而且基因敲除可能帶來復(fù)雜的長時程變化，因此僅僅觀察最后的表型或功能還不能從根本上揭示其作用機制。若能建立各種功能的檢測系統(tǒng)，針對某一個基因敲除的動物和人體進行全面的功能研究，利用現(xiàn)代化檢測技術(shù)基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等可以深入研究基因之間的相互影響。所以建立全面檢測系統(tǒng)將是進行大規(guī)模基因功能研究的基礎(chǔ)。

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篇10

關(guān)鍵字：林木常規(guī)育種；生物技術(shù)；應(yīng)用

Abstract: Biotechnology is one of the most important scientific means, in the process of forest breeding, biotechnology will play a very important role, especially the selection of fine varieties of forest tree genetic markers and gene engineering plays an important role in. In this paper, the application of tree breeding technology and biological technology, proposed to correctly handle the relationship between the conventional breeding and biotechnology breeding, ensure excellent tree species, so as to guarantee the sustainable development of the forest.

Keywords: tree breeding; Biotechnology; application

中國分類號：S68文獻標識碼：A 文章標號：2095-2104（2012）03-0001-02

0 引言

林木育種是保證林木持續(xù)發(fā)展的重要途徑，同時也是維持自然平衡的重要調(diào)和手段。在我國林木育種方面發(fā)展仍然相對落后，隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展和科技的進步，生物技術(shù)在林木育種方面逐步發(fā)揮作用，這就使得林木得以持續(xù)發(fā)展和延續(xù)。林木種質(zhì)資源的好壞直接關(guān)系到林木的后續(xù)生長，所以要培養(yǎng)優(yōu)良的林木資源，應(yīng)用林木遺傳因素并配合生物技術(shù)的使用從而克服不良林木種資源的改良，這不僅關(guān)系到我國林業(yè)的發(fā)展，同時是生態(tài)平衡的最終要求。

1 林木常規(guī)育種現(xiàn)狀

林木是關(guān)系到自然協(xié)調(diào)的中堅力量，所以在林木的遺傳育種方面以引起了相當?shù)闹匾暋Ａ帜具z傳改良的工作可以追溯到20世紀40年代，發(fā)展相對滯后。然而，在近半個世紀的發(fā)展中，林木的育種方面有了一定的進步。林木的遺傳和基因改良是一項根本性的關(guān)系到林木培育的重要技術(shù)，這項技術(shù)著眼于選育優(yōu)良品種并進行大量的繁殖，從而保證林木的連續(xù)性。這在一定程度上解決了對木材的需求，同時可以保證優(yōu)良品種的繼續(xù)存續(xù)和發(fā)展。在林木的生產(chǎn)過程中，林木育種方面也以趨于成熟。其中，林木的育種包括選育、遺傳測定和良種繁殖三個階段，在我國，林木的育種已經(jīng)達到了一定的技術(shù)基礎(chǔ)，并取得了些許成就。然而隨著對林木需求的加大和對優(yōu)良品種的偏好需求，就使得林木育種必須找到新的發(fā)展方向并創(chuàng)新新的育種技術(shù)作為支撐。

2 生物技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用

林木不同于其他的生物體，其生長周期較長，而且林木在幼年和成年時期表現(xiàn)出不同的生理性狀，除此之外，林木的遺傳雜合性較高，這在某種程度上影響林木育種的發(fā)展狀況。隨著林業(yè)的不斷發(fā)展和對林木需求的增加，現(xiàn)存的林木品種不能完全滿足人們的需求，所以生物技術(shù)的應(yīng)用就可以彌補這一現(xiàn)狀。生物技術(shù)為林木育種提供強大的動力。

2.1 遺傳標記的應(yīng)用

在遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域中，具有良好性狀和遺傳穩(wěn)定性并且容易識別的遺傳性征，比如形態(tài)特征、細胞學(xué)和分子標記等等，都可以稱為遺傳標記。其中，分子標記把DNA分子多態(tài)性作為遺傳標記，這種遺傳標記可以反映生物體的基因特性。在林木育種過程中，通常采用的分子標記方法包括：限制性片段多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性，擴展片段多態(tài)性和簡單重復(fù)序列等方法。在具體的方法應(yīng)用中，要根據(jù)遺傳基因的具體情況進行合理選擇，除此之外，要考慮基因的識別和檢測的便捷性和應(yīng)用成本問題。近年來，分子標記技術(shù)也有了一定的發(fā)展。遺傳圖譜可以顯示遺傳標記的相對位置，從而可以觀測染色體進而進行相應(yīng)研究。遺傳圖譜的應(yīng)用和發(fā)展是林木育種研究的又一技術(shù)手段，可以在林木的良種選育和培養(yǎng)方面發(fā)揮作用。除此之外，分子標記中的指紋識別技術(shù)也逐步應(yīng)用到林木的育種方面。指紋是一種類比人的定義，是一種區(qū)別于其他種或個體的特異DN段，具有高度的特異性和穩(wěn)定性。指紋識別技術(shù)可以對樹種的基因做出判斷，從而對樹種的個體之間進行親緣關(guān)系判斷，這就可以從根本上對林木做出區(qū)分，防止林木的交叉遺傳。

2.2 基因工程的應(yīng)用

基因工程通俗的來講就是把目標基因通過一定的方式植入到受體植物，從而可以使林木的DNA發(fā)生改變，從而可以創(chuàng)造需求的林木品種。基因工程在林木育種方面的應(yīng)用較為廣泛，其中相關(guān)的技術(shù)包括目的基因分離鑒定、植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的識別等等方面。基因工程在林木育種方面有很大的貢獻，在林木的體內(nèi)植入目標性狀的DNA，從而使受體達到DNA重組，由此可以產(chǎn)生基因的變異，創(chuàng)造出新的生物體。基因工程通常需要的時間不長，而且可以打破林木種間雜交不親和的界限，從而可以打破林木自身性狀的影響，培養(yǎng)出新的林木品種。

3 林木育種的展望

林木常規(guī)育種和生物技術(shù)育種具有本質(zhì)的差別，林木的常規(guī)育種基本上是應(yīng)用雜交來改良品種，所以改良的效果并不顯著，新品種的培育較差，而且常規(guī)育種的方向性較差，難以對生物進行定向的改造和培育，而生物育種就可以打破常規(guī)育種的弊端。生物育種是從生物體內(nèi)部對基因的一種改良，可以通過植入具體性狀的基因?qū)α帜具M行定向培養(yǎng)，同時，生物育種還可以打破種間雜交的障礙，使林木品種得到創(chuàng)新發(fā)展。

在林木育種的發(fā)展中，要不斷完善基因工程的應(yīng)用，要積極開發(fā)導(dǎo)入基因介質(zhì)，同時完善基因性狀，發(fā)展基因?qū)氲挠行裕瑫r要開發(fā)多性狀基因，使導(dǎo)入基因能夠滿足需求。同時由于林木基因組重復(fù)的序列較多，提純方面存在困難，所以在使用基因工程來培育新的林木種資源使，要完善相應(yīng)的提純技術(shù)和林木基因的檢測技術(shù)，從而充分發(fā)揮基因工程在林木育種方面的應(yīng)用。除此之外，要開展空間育種技術(shù)工程，采用種子衛(wèi)星搭載工程，從而可以利用空間環(huán)境創(chuàng)造新的林木品種，在模擬的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)林木的性狀和改善效果，從而可以模擬空間狀況的生物效應(yīng)，為林木的育種提供新的發(fā)展方向。

4 結(jié)語

林木育種是創(chuàng)造新的林木種資源、保證林木可持續(xù)發(fā)展的過程，那么在林木育種的過程中，就要重視生物技術(shù)的應(yīng)用，從而可以改善林木常規(guī)育種中難以達到的技術(shù)要求，更快更好的培育出需要的林木新品種，服務(wù)于林業(yè)的發(fā)展和優(yōu)良品種的傳承和發(fā)展。

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