干細胞培養技術范文
時間：2023-05-04 13:09:18
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篇1
目的： 利用簡化無血清培養基和連續傳代法，從成體小鼠腸管分離培養腸神經嵴干細胞(GNCSCs)，觀察細胞體外培養過程中增殖、分化的特點. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標志來鑒定GNCSCs及其分化的細胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養基中貼壁培養，連續傳代培養并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養基中，觀察其分化現象. 用免疫細胞化學和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細胞系特異性標志物的表達. 結果： 成體小鼠腸管中有少數細胞在無血清培養基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導下可分化為神經元、神經膠質細胞、平滑肌細胞. 結論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經系統所必須的細胞類型.
【關鍵詞】 腸神經嵴干細胞 小鼠 細胞培養技術 細胞分化 Hirschsprung病
0引言
應用神經干細胞治療某些神經系統的損傷和退行性疾病，經過較長時間的實踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經嵴干細胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經管背側，具有干細胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結腸癥及腸神經系統干細胞疾病的研究已引起人們的關注，本實驗著重進行GNCSCs的基礎研究，為臨床應用建立理論基礎.
1材料和方法
1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質量不拘，西安交通大學醫學實驗動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養基組成：DMEM/F12完全培養基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).
1.2方法
1.2.1取材、克隆球的培養頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復吹打制成單細胞懸液，用200目，400目的濾網過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預先配置的無血清完全培養基重懸細胞，臺盼藍染色計數活細胞，以 6×108個/L接種到25 mL培養瓶中，添加培養基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養箱中水平放置，貼壁培養. 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細胞，以2/3量換液，孵育3 d后進行傳代，以6×108個/L接種到25 mL培養瓶中，繼續孵育40~48 h后再次傳代，如有細胞團塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.
1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養皿內，每皿2 mL，動態觀察克隆球的分化情況.
1.2.3克隆球及其分化細胞特異性標志物的染色應用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細胞系的性質，封片后分別用光學顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.
轉貼于
2結果
2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細胞和一些呈半球狀或不規則的細胞團. 孵育24 h后，貼壁細胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細胞胞體增大，折光性增強，出現分裂相，形成2～5個細胞的細胞團，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數十個細胞構成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細胞索，形成較小的次級克隆，這些克隆球形態完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細胞結構 （圖1B）. 重新傳代培養，可觀察到細胞胞體增大，出現分裂相的克隆球數量逐漸增多，雜質細胞減少，在連續傳代過程中克隆球逐漸純化.
2.2克隆球的分化接種含血清培養基12 h后，可見有細胞從克隆球中遷出，遷出的細胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態；48 h后貼壁細胞數量明顯增加，逐漸形成單細胞層且細胞形態多元化.
2.3克隆球及其分化細胞系的免疫染色免疫細胞化學方法進行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.
3討論
許多研究表明GNCSCs在ENS的發生和發育起關鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發生障礙，受累腸道的相應神經節出現缺失，表明先天性巨結腸可能是一種干細胞疾病. 由于HSCR及腸神經系統干細胞性疾病在手術治療后仍遺留有嚴重的并發癥，因此用干細胞來進行臨床治療已成為研究的熱點和重點. 鑒于胚胎干細胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗提供新契機.
GNCSCs的培養方法建立在中樞神經干細胞的基礎上. 依據神經干細胞經典的培養方法，再結合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點，聯合應用簡化的特殊培養劑和神經干細胞培養方法進行體外培養. 連續傳10代后，GNCSCs的相對比例明顯增加，這種體外培養的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細胞. 如果繼續傳代，其純化程度越高，后續的試驗效果將更佳. 連續傳代不僅純化了GNCSCs，還證實了干細胞的自我更新特性. 在體外培養干細胞時，培養條件稍有變化可導致分化機制的啟動，因此采用血清促分化法誘導GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實了GNCSCs分化細胞的類型，同時顯示了分化的亞型神經元及神經膠質細胞的形態，并表明了成體干細胞的多向分化能力.
參考文獻
［1］ 楊帆，楊樹源. 神經干細胞研究進展及臨床應用前景［J］.醫學綜述， 2002；8(8):491-493.
［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.
［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.
篇2
“細胞懸浮培養技術是在傳統的轉瓶培養基礎上發展而來的大量培養動物細胞的新興技術，目前，該技術在歐美國家僅用于小規模生產人用禽流感疫苗。”此前，山東信得有關負責人說，作為一家同時擁有生物制品、生化制藥、獸藥制劑、飼料添加劑及獸藥原料藥五大產品線的高科技公司，山東信得首次實現了細胞懸浮培養技術在動物用禽流感疫苗研發生產中的規模化應用，而這一研發生產過程持續了7年之久，從“十一五”期間就開始了。產技術研究與開發項目引起了業界關注，并得到國家科技部門的支持，作為我國獸藥行業加快提升行業生產技術水平的代表項目。
為此，在2010年，山東信得專門成立動物疫苗有限公司，并投資1.5億元建成了國內首家大規模細胞懸浮培養工藝生產高致病性禽流感滅活疫苗的GMP車間，并于次年初通過了農業部的GMP動態驗收，獲得GMP證書和獸藥生產許可證。2012年，山東信得獲得農業部頒發的禽流感細胞苗新獸藥證書。
“此次獲得重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗的生產文號，標志著山東信得研發生產的產品將由此進入規模生產階段，并能面向市場供應。”山東信得有關負責人表示，同時也說明了細胞懸浮培養技術已經打破多年來動物疫苗生產行業一直采用雞胚生產禽流感疫苗的技術瓶頸，標志著我國在禽流感疫苗的研發和生產方面，已經走到了世界技術前沿，具有極大的引領和示范作用。
據了解，采用細胞懸浮培養技術生產高致病性禽流感疫苗，基本上能夠克服雞胚孵化生產工藝的缺點，是我國動物疫苗生產的發展趨勢。具體來說，該技術避免了雞胚培養中由于含有大量雜蛋白而存在的安全隱患問題，以及由于雞胚廢棄物處理不當而存在的散毒危險。同時，由于各種技術參數由電腦程序統一操控，整個生產過程更加可控，無外源病毒污染和母源抗體影響，疫苗質量批間差異最小化，產品更加穩定。“簡單來說，就是技術更先進、質量更可控。”山東信得這位負責人認為，該工藝的改進，給我國乃至世界動物疫苗產業帶來了技術升級，將提升疫苗的工業化生產水平，為養殖戶提供安全、優質、高效的疫苗。
篇3
【關鍵詞】間充質干細胞；大鼠
【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）03-0044-02
引言
研究表明，骨髓含有造血干細胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、內皮祖細胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多種成體干細胞。EPCs主要分化為血管內皮細胞，有助于血管疾病組織的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潛力的特點，研究表明，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化為成骨、軟骨、心肌、肌腱、上皮、內皮等幾乎所有三胚層類型細胞的能力[1-3]，基于這個特性使BMMSCs成為了中藥誘導、臨床移植及一些分子生物學實驗的種子細胞源。因此，本實驗采用最簡單普通貼壁培養法分離、培養大鼠BMMSCs，若能得到較為純凈BMMSCs，在節約了培養BMMSCs成本基礎上，提供了一種既簡單又能穩定獲得純凈BMMSCs的方法，為相關的實驗提供豐富的BMMSCs。
1 材料和方法
時間及地點：于2009-09/2011-02在遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室完成。材料：清潔級SD大鼠，購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心[許可證號：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的動物實驗操作程序經遵義醫學院實驗動物倫理委員會審議批準。主要試劑：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）
實驗方法：
大鼠BMMSCs的分離、培養：頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無菌條件下手術取下兩側完整股骨（連同肌肉），浸入0.1%新吉爾滅15 min；剝離股骨附著肌肉，并用含雙抗的D-PBS反復清洗。剪開股骨兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔，收集含骨髓細胞的洗脫液，1000 g離心5 min，棄上清，細胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培養基重懸浮，每只大鼠分離的骨髓細胞接種兩個T25培養瓶，置37 °C、5% CO2飽和濕度培養箱培養。每2 d換液1次，同時洗脫未貼壁的血細胞，倒置相差顯微鏡下每日觀察細胞生長情況并照相。當BMMSCs生長匯合度達60～70 %時，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105個/ml細胞密度進行傳代培養。
大鼠BMMSCs表型鑒定：取第3代BMMSCs進行CD45、CD29和CD90表型分子的流式細胞儀檢測，具體步驟如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成單細胞懸液，1000 g離心5 min；棄上清，加入D-PBS振蕩混勻，1000 g離心5 min；棄上清，加入適量D-PBS振蕩混勻；向預先加入各表型分子抗體的流式檢測管內加入100 ?l細胞懸液（細胞數不少于100 000個），各管分別含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同熒光素標記的流式細胞儀檢測抗體，振蕩混勻，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振蕩混勻，1000 g 離心5 min；棄上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振蕩混勻，4 ?C保存待此后上機檢測。
篇4
關鍵詞：IPS細胞；分化；造血干細胞
0 引言
目前，臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發生免疫排異會危及患者生命。現有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數量供不應求，使其在疾病中的臨床應用中受到限制。隨著誘導性多能干細胞（IPS）提取技術的出現，使分化自身細胞變為了現實，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細胞的數量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下：
1 材料和方法
1.1細胞株的來源
小鼠骨髓基質細胞OP9購于美國ATCC，誘導性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫藥與健康研究院提供。
1.2試劑和儀器
小鼠骨髓基質細胞OP9的培養基為α-MEM，內含20%的胎牛血清，OP9細胞誘導干細胞分化培養基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司。抗體為APS-TRA-1-85，半固體培養基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。
1.3方法
在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細胞的未分化狀態，OP9用細胞培養液培養，培養時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。
OP9細胞進行傳代培養4天后，將OP9的培養液換成誘導干細胞分化的培養液，將UC013細胞洗兩遍后，再對邊緣部位細胞進行消化，將細胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細胞后，將其轉移到加有分化培養液的細胞盤中搖勻，在與上述培養的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養，培養的第二天將培養液換為共培養液，第四天開始每隔一天半換一次培養液，第九天收樣品。
免疫磁珠法分選CD34+細胞，將細胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，再將細胞收集到離心管中進行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標記細胞，30秒后加入流式細胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離，通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞，即得到CD34+細胞。
用流式細胞術進行檢測，將共培養9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細胞儀進行檢測。
集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養基中，放于培養皿中進行培養，每孔接種1萬個細胞，培養14-16天。然后，在顯微鏡下根據集落成的血細胞形成特征，對集落細胞進行分類和計數。同時，提取共培養2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。
2 結果
2.1細胞培養與觀察
觀察培養的細胞，結果顯示，對照組未分化的人體細胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實驗組培養2天后的細胞，表面布滿細胞集落，已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長，細胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細胞排列規則，生長迅速，培養4天后細胞鋪滿了培養皿底。
2.2誘導造血干細胞分化
通過在本實驗組的誘導分化條件下，對實驗組和對照組細胞的培養，實驗組細胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細胞的形態也發生了分化，接著，OP9細胞開始出現老化跡象。
2.3流式細胞術檢測
共培養9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況，用流式細胞儀分析培養細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況，結果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。
2.4 4RT-PCR檢測
運用RT-PCR對共培養的細胞進行基因表達檢測，結果顯示，IPS細胞發生造血分化時，Oct-4基因的表達慢慢消失；造血轉錄因子基因表達緩慢升高；Runx-1基因在造血干細胞分化12天當中的表達呈波浪式變化，其中分化第二天表達量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。
2.5 CD34+細胞集落實驗
CD34+細胞在半固體培養基中進行培養，根據造血干細胞的形態特征，對細胞集落進行分類和計數。結果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落數量持續升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數量逐漸降至最低。
3 討論
隨著干細胞技術的發展，通過誘導分化得到造血干細胞已經成為事實。相對于多能干細胞而言，IPS通過導入轉錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩定，避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應用于細胞替代性治療，并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。
在本文的研究中，沒有外加細胞因子，直接將IPS細胞誘導分化為造血干細胞，結果獲得了20%的CD34+細胞，即造血干細胞，CD34是表達于造血干細胞的表面標志物，表明IPS可以分化為造血干細胞，但是轉化率比較低。Runx1是調控造血干細胞分化的轉錄因子，期基因的表達量在分化過程中呈現波浪式的變化，Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養基中成集落狀態，說明IPS可以向各細胞系進行分化。
現在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進行誘導生成造血干細胞；二是基質細胞與多能干細胞共培養；三是形成EB后與OP9進行共培養；四是單層誘導ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養，可以模擬體內的造血微環境，為研究細胞定向分化為造血干細胞創造了可能性，OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化，并協助B淋巴細胞增殖。基質細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導方法分化時間短，為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導分化過程中不用添加細胞因子，比較經濟。但該誘導方法也存在著一定的缺點，即存在鼠源性污染細胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應用。
目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞，而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內，可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內造血系統差異較大，需要進一步優化體外誘導多能干細胞分化為造血干細胞的過程，才能滿足該實驗需求
4 小結
通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究，成功誘導了造血干細胞，分化得到的細胞在體外培養中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應用提供一定的實驗依據。
參考文獻：
[1]張坤等.體外誘導人類誘導性多能干細胞分化為造血干/祖細胞的研究，中國實驗血液雜志，2014.01.
篇5
一、分子水平的克隆—PCR技術
該科技技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。
PCR由三個基本反應步驟：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈 DNA解旋，使之成為單鏈，以便它與引物結合;②模板DNA與引物的低溫退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。
二、細胞水平的克隆—動物細胞培養技術
動物細胞培養是用酶解法將組織碎塊分離成單個細胞，用培養液制成細胞懸浮液，在體外適宜條件下使細胞生長繁殖，并保留一定的結構和功能特性。
(一)細胞培養所需的條件
1.培養液
現多用合成培養液。合成培養液有多種，不同培養液適用于不同細胞。可根據培養細胞的特殊要求進行添加：抗生素、有機補充物(如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等)、促細胞分裂因子(生長因子類的FGF等)、貼壁和鋪展因子(如膠原蛋白，纖粘蛋白等)。
2.血清
在細胞培養液中必須添加一定量的血清方能獲得成功。血清中除了含有細胞生長的部分氨基酸外，還有促進細胞生長和貼壁的成分。不同動物血清的作用差別很大，即使同一種動物的不同個體間的差異也很顯著。不同種細胞要求血清量也不同，大部分細胞生長液中加入10%血清已可滿足細胞生長要求。目前國內外正在研制無血清培養液，以避免血清中某些物質對細胞生長和病毒復制的影響。
3.PH
細胞生長的PH為6.6-7.8，但最適PH 7.0-7.4。培養液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和血清。
4.溫度
細胞培養的最適宜溫度應與細胞來源的動物體溫一致。
此外，成功的細胞培養還需要嚴格的無菌操作及潔凈的培養器皿。
(二)細胞生長的三個階段
1.潛伏期
細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。
2.指數生長期
指數生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數量適宜情況下，指數生長期持續3-5d后，隨細胞數量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現接觸抑制。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區分正常與癌細胞標志之一。
3.停滯期
即細胞數量達到飽和密度后，細胞與營養液的交換面積減少，代謝產物積累，PH下降細胞停止增殖，進入停滯期。
(三)動物細胞的培養
1.原代細胞(primary cell)
動物組
織經胰蛋白酶等消化、分散、獲得單個細胞，在培養皿中大多數組織均可制備原代細胞，但生長的快慢及難易程度不一。原代細胞一般對病毒較易感染，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細胞。
2.二倍體細胞株(diploid cell strain)
將長成的原代細胞消化分散成單個細胞，繼續培養傳代，其細胞染色體數與原代細胞一樣，仍為二倍體。此種細胞數量可擴大，對病毒的易感性則基本無變化。
3.傳代細胞系(establishell cell line)
與上述兩類細胞不同，這類細胞在傳代過程中染色體發生異常變異，在體外可無限制分裂。
三、個體水平的克隆—動物細胞核移植技術
所謂細胞核移植技術，就是將供體細胞核移入除去核的卵母細胞中，使后者不經過穿透等有性過程即可被激活、分裂并發育成新個體，使得核供體的基因得到完全復制。
(一)供體核的獲得
供體核可以是早期胚胎細胞、胚胎干細胞和體細胞。早期都采用合子核到64細胞期的胚胎細胞核質體分裂球作供體細胞核，80年代開始，隨著胚胎干細胞(embryo stem cells，ES)的建立和對其研究的深入，人們對胚胎干細胞在核移植方面的應用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。1997年 Dolly羊的出現，開始了體細胞的核移植，并發展很快。
(二)受體細胞去核
作為細胞核移植的受體細胞主要有三類：去核的卵母細胞、受精卵和2-細胞胚胎，其中卵母細胞應用最為廣泛。研究證明，體外成熟培養的卵母細胞核移植成功率不如體內成熟的卵母細胞，其原因可能是卵母細胞在體外成熟過程中，需要合成一些蛋白質來完成第一次減數分裂，其活動有可能受到抑制。
(三)核卵重組
在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細胞的間隙中，根據移入的部位不同，可分為帶下移植和細胞質內注射。在移植針移開后，對移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與卵母細胞接觸。
(四)細胞融合與激活
由于卵細胞去核過程中破壞了卵膜和一部分細胞質，若直接移植，成功率很低，故需對重組胚融合，其采用的方法有仙臺病毒法、物理或化學方法(如電融合法、鈣離子載體、乙醇、蛋白質酶合成抑制劑等)激活受體細胞，使其完成細胞分裂和發育過程，電融合法更常用。
(五)重構胚培養與移植
重構胚需一定時間的培養，方可移植到受體，家兔和豬重構胚在體外培養24h以內，就可通過非手術移植，而羊和牛重構胚所需培養時間較長，一般發育到囊胚或桑椹胚時移植。
篇6
失誤帶來美容技術革命
目前筆者采訪了GSG的研發中心王健教授。王教授向記者談到：我們研發中心其實是研發細胞、基因技術和產品的研發機構。對于GSC產品的出現完全是一次意外的失誤。一名研究人員將GSC液體瓶錯誤地放到了細胞培養皿中。事后發現了，但為時已晚。我們都認為這一批細胞培養的實驗白做了，但經過7天的培養之后，意外情況出現了：培養皿中的細胞不但沒有死掉，反而生長的比以前還要好。特別是培養間充質干細胞的培養皿中，間充質干細胞比其他細胞生長得更好。并且間充質干細胞向成纖維前體細胞分化，而成纖維前體細胞最終發育為成纖維細胞。大家都知道，成纖維細胞是延緩皮膚衰老的最關鍵的生物物質。
自我調控細胞生長代謝
談到GSC產品恢復皮膚健康年輕態王教授說道：維持皮膚中各種細胞新陳代謝青春水平不是隨心所欲的，有兩個關鍵環節：一是細胞代謝不是越快越好，而是要將細胞代謝的周期調節到年輕時的節奏。二是調節細胞恢復代謝節奏，只能通過自身生理功能來完成。大家都知道，人是無法直接吸收細胞的，皮膚上直接涂抹的細胞也是無法進入人體的，包括一些大分子的蛋白。所謂細胞美容或干細胞美容，都是一種宣傳上的噱頭。真正意義上的細胞美容是通過小分子的細胞因子通過透皮吸收后，進入人體，與自身細胞上的受體結合，刺激自身細胞活躍起來，加快增殖分化速度，增加新生細胞的數量，滿足皮膚的生理需要，從而到達美容的目的。GSC活膚液都是小于10～15個氨基酸的小分子，我們稱之為生物細胞因子群。從細胞生物學角度講，細胞在人體內的生長發育，依賴于一個小環境，也就是“微生態環境”。在這樣一個小環境之中，細胞受到多種細胞因子和營養蛋白的調控，才能使細胞本身正常生長發育。單一的或少量的細胞因子是不能為細胞創造一個最佳“微生態環境”的。這些細胞因子的體積很小，可以在皮膚細胞之間通過。因此，可以透皮吸收，進入到真皮與皮下組織之間，激發那里的間充質干細胞的活力，使之加快增殖分化的速度。使真皮組織中成纖維細胞數量增加、活性增強。細胞因子在表皮的基底層部分，激發了那里的基底層表皮干細胞活力，使表皮干細胞加快增殖分化的速度，通過真皮和表皮新生細胞加快生長，使皮膚細胞新陳代謝恢復到年輕狀態。
延緩皮膚衰老的法寶
GSC產品首席科學家陸敏醫學博士告訴筆者：GSC活膚液能夠增加真皮組織中成纖維細胞的數量和活性，這是一場美容界的革命。真皮組織的衰老、塌陷，是造成皮膚暗啞、粗糙、皺紋的主要原因。而真皮組織中膠原蛋白的保有量隨著年齡的增加而逐漸減少是造成皮膚衰老的最重要的生理原因。因此，膠原蛋白一定要依靠自身生理功能來補充，真皮組織中的膠原蛋白主要來源于成纖維細胞的分泌。真皮組織中成纖維細胞數量和活性，決定了真皮組織中膠原蛋白數量的多少。GSC活膚液通過增加自體成纖維細胞的數量和活性，達到增加皮膚內膠原蛋白數量的方法，完全是一種生理性調節、依靠自身生理功能提高而達到延緩皮膚衰老的方法，是純天然、無損傷、保健型的美膚方法。
篇7
[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞 光感受器細胞 誘導分化
骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潛能的均質性成體干細胞，它具有兩項干細胞最顯著的生物學特性：自我更新 (self-renewa1)能力及多向分化潛能。1968年, Friedenstein[1]等學者首先報告骨髓中存在一種細胞具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,他們認為這種細胞可能是間充質細胞的前體。隨著研究的發現，MSC具有向中內外胚層組織細胞分化的能力 ,可以在體外被誘導分化為肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、肝細胞、上皮細胞、神經細胞等[2, 3]。近年來，BMSCs向神經元細胞的分化的研究成為了研究的熱點。可利用抗氧化劑、生長因子、維甲酸、共培養等將骨髓間充質干細胞誘導成神經樣細胞[4-6]。本文探索了利用視網膜光感受器培養上清液體外誘導BMSCs分化為視網膜光感受器樣細胞的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
清潔級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司； DMEM培養基(美國Hyclone公司) ，Neurobasal培養基（美國Invitrogen公司），B27(美國Invitrogen公司) ，胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美國sigma公司），多聚賴酸（美國sigma公司），小鼠抗大鼠單CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相應同型對照單抗小鼠IgG1-FITC, IgG1-PE和IgG2a PE（Beckman-Coulter公司），神經元特異性標志小鼠抗大鼠醇化酶（美國 Fisher Scientific公司），光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(Rhodopsin)（RET-P1，美國Millipore公司），星形膠質細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經膠質酸性蛋白(GFAP)（美國 Fisher Scientific公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），總抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培養箱（美國），OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本），OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式細胞儀（美國），臺式高速冷凍離心機（上海），Gene Amp 9700型PCR 擴增儀（美國），Bio-Rad凝膠成像分析系統（Gel DOC2000）（美國），AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）。
1.2 方法
1.2.1骨髓間充質干細胞的分離培養和鑒定
取清潔級SD大鼠，4mL／kg水合氯醛 (100g/L)進行腹腔麻醉。碘伏消毒，無菌條件下取出大鼠的雙側脛骨和股骨， 分別剪斷股骨干和脛骨中間及兩端的干骺剪斷，用含有肝素的培養液10mL進行反復沖洗骨髓腔，沖洗液經200目不銹鋼標準篩網過濾組織塊以及已凝血塊后，進行離心后用20%FBS的DMEM培養基制成單細胞懸液接種于25cm2 培養瓶中，24h后首次換液去除未貼壁細胞，以后每2d換液一次，換液前PBS洗去部分未貼壁細胞，當70％～80％細胞達到融合時用0.25%胰蛋自酶消化傳代，進行擴增培養。用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達[7]。
1.2.2視網膜光感受器細胞的分離培養和鑒定
在暗環境下無菌取下清潔級SD大鼠的眼球，游離出完整的視網膜神經上皮層。利用木瓜蛋白酶進行消化分離出光感受器細胞，用Neurobasal培養基A 1mL（加入1:50的B27和0.5mM L-glutamine）進行避光培養，兩天換液一次，將視網膜光感受器細胞培養換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，通過0.22um過濾篩過濾后按2:3比例與DMEM培養液混合后備用。分別把消化前和消化后的視網膜片進行HE染色,在顯微鏡下觀察，同時對分離的光感受器細胞進行免疫細胞化學鑒定。
1.2.3對大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導以及鑒定
將3代的rMSCs接種在6孔板中。分為2個對照組，4個實驗組。實驗組加入光感受器細胞上清液與10%FBS的DMEM培養基（2:3）進行誘導，對照組用Neurobasal培養基A與10%FBS的DMEM培養基（2:3）進行培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況，誘導后14天，行免疫細胞化學和Rt-PCR鑒定，免疫細胞化學：PBS洗滌3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，過氧化酶阻斷，非免疫動物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200) ,GFAP(1:100) 抗
體，4℃過夜，加入生物素標記的第二抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，DAB溶液顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。RT―PCR法檢測實驗組和對照當中的GFAP，NSE， Rhodopsin的表達。Rhodopsin引物上游引物ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCA
GCCGATG 3’，擴增長度為107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGC
GGTGTAAC 3’，擴增長度為156bp；GFAP引物上游引物：5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACC
AGGAATAGACCTTCACAA 3’，擴增長度為482bp；內參Rat GAPDH 為5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110為5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴增長度為595bp。參照TRIZOL試劑說明書對誘導的MSC分別提取總RNA，進行反轉錄、PCR擴增，將 PCR產物電泳后進行圖像分析儀采集圖像。
統計學處理：采用SPSS13.0統計軟件包(statistical package for the social science)分析，采用t檢驗。
2 結果
2.1骨髓間充質干細胞的鑒定
培養的大鼠的BMSCs接種后24小時開始貼壁，前3天細胞增殖慢，數量比較少，第3開始細胞的增長速度明顯增加，7天后就達到融合狀態，呈現漩渦狀、狀。第三代時，細胞仍呈梭形，生長旺盛。BMSCs標志鑒定結果表明，培養的第三代BMSCs干細胞表面標志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質細胞表面標志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）（見圖1）。
圖1 大鼠MSC流式細胞儀檢測結果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)
2.2 視網膜光感受器細胞的鑒定
取下來的視網膜在消化前后分別進行HE染色，消化前可以很清楚地觀察到九層細胞，說明取下來的是完整的視網膜神經上皮層，不含有色素上皮，消化后的視網膜片，光感受器層的細胞變少，其它層細胞完整，光感受器細胞的免疫細胞化學示，光感受器細胞的特異標志物視紫紅質的表達率達95%以上。
2.3 大鼠骨髓間充質干細胞的誘導
實驗組BMSCs誘導后的第4天細胞形態開始變化，可見小的突起。隨后細胞便圓，突起增長，出現少量神經樣細胞的形態，到14天最為明顯，出現一、二級分支，相互之間連接呈網狀。對照組也有少量的細胞呈神經樣的形態。誘導后的神經元樣細胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈強陽性。非神經元樣細胞呈多邊形或梭形，上述抗體染色呈弱陽性。陰性對照未見染色。
免疫細胞化學鑒定，共培養2周后，陽性細胞計數結果顯示： rMSC的Rhodopsin表達率實驗組為35.1%±6.2 %（圖2A）,而對照組中無Rhodopsin陽性的細胞（圖2B）， rMSC的NSE表達率實驗組為33.6%±4.0 %（圖3A），對照組為10.6%±5.0%（圖3B）, rMSC的GFAP實驗組的表達率為9.6%±1.5 %（圖4A），對照組為：13.7%±3.0 %（圖4B）； 對照組與實驗組進行兩樣本的t檢驗NSE：F =0.09，方差齊，P < 0.001，有統計學意義，GFAP：F =1.726，方差齊，P ＞0.05，無統計學意義。
A:實驗組大量表達Rhodopsin(×100)；B:對照組未表達Rhodopsin(×100)
圖2 免疫細胞化學rMSCs表達Rhodopsin結果
A:實驗組大量表達NSE(×100)；B:對照組少量表達NSE(×100)
圖3 免疫細胞化學rMSCs表達NSE結果
A:實驗組表達有GFAP(×100)；B：對照組表達有GFAP(×100)
圖4 免疫細胞化學rMSCs表達GFAP結果
RT-PCR鑒定結果分析顯示，實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達，其中GFAP表達比較弱；而對照組的只表達GFAP和NSE，且均較弱，未見Rhodopsin條帶(圖5)。
A:為實驗組，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達；B:為對照組，只表達GFAP和NSE。
圖5 Rt-PCR檢測GFAP、NSE、Rhodopsin
3 討論
本實驗模擬視網膜體內發育的微環境誘導骨髓間充質干細胞成為視網膜細胞，利視網膜光感受器細胞培養上清液對骨髓間充質干細胞進行向視網膜樣細胞誘導。本實驗關于視紫紅質的檢測，實驗組表達率高達35.1 %±6.2 %，對照組沒有表達，說明其光感受器條件培養基能使MSC向光感受器細胞方向轉化。從而驗證了大鼠MSC確實可以在體外被誘導為表達視紫紅質的光感受器樣細胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或與視網膜片共培養，均未發現表達Rhodopsin的證據。Anthony等[5]對BMSCs向視網膜光感受器細胞誘導分化進行了體內外實驗。利用維甲酸、牛磺酸和EGF體外將小鼠 BMSCs成功誘導為視網膜光感受器樣細胞，誘導后的細胞可以表達視網膜光感受器細胞特異性標志物：視紫紅質、視蛋白和恢復蛋白，最近國內學者單純用EGF也可以誘導rMSC表達Rhodopsin[9]。本實驗當中NSE表達率也明顯高于對照組，而GFAP，兩組表達并無差異，說明，光感受器條件培養基促進rMSC向神經元細胞方向分化，而對于膠質細胞方向分化并無誘導作用。本實驗的對照并未加誘劑的rMSC也能表達神經元特異性標志，Tomita M[8] 研究說明沒有生長因子誘導的MSC沒有向神經方向分的證據，強調生長因子在神經分化中的重要地位，但是也有許多學者提出了在未誘的條件下仍發現神經特異性標志物的表達，Tondreau T等[10]發現未誘的的MSC也可以表達神經特異標記物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羥化酶等。Deng J[11]研究中也證實，體外培養大鼠的MSC具有自發表達早期的神經標記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細胞表達成熟神經細胞的標記物，如神經微絲M（FNM），這些跟本實驗對照組仍能誘導的MSC能表達NSE相一致。
我們的實驗利用光感受器細胞上清液模擬視網膜體內發育的微環境誘導骨髓間充質干細胞成為視網膜光感受器樣細胞，視網膜神經細胞培養上清液可能在骨髓間充質干細胞的存活與分化方面起重要作用。盡管BMSC向神經細胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結果，但是還面對了許多待進一步解決的問題：（1）對于BMSC的鑒定一直都沒有一個統一的說法，對BMSC的細胞學特點和分化各階段細胞標志物的進一步研究；（2）光感受器細胞在體外的外節容易脫落變性，如何進一步保持其完整性以及存活時間；（3）體外BMSC向視網膜樣細胞誘導分化模式和分子調控機制還不甚清楚，其誘導的微環境還比較復雜，有的學者直接采用雞尾酒式的加入好幾種生長因子進行誘導，對于其中各生長因子具體作用以及相互間的作用仍不清楚；（4）對于本實驗誘導出來表達視紫紅質的MSC細胞的與真正的光感受器細胞之間不管是從形態上還是都有很大的差距，縮短這一差別，將MSC真正應用于眼科臨床，還需進一步深入的研究探索。
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篇8
【摘要】 ［目的］探討骨髓基質干細胞移植對股骨頭缺血性壞死的治療作用和修復機理，為臨床應用提供依據。［方法］24只新西蘭大白兔隨機分為兩組，A組為髓芯減壓組，B組為干細胞移植組。采用液氮冷凍法造模。A組鉆孔后植入空白明膠海綿，B組鉆孔后植入復合有骨髓基質干細胞的明膠海綿。術后每組分別于2、4、6、8周各處死3只動物，做X線及組織學檢查。［結果］（1）X線結果：2周時A、B組鉆孔區均呈低密度，4周時A組鉆孔邊緣密度增加，B組整個鉆孔區密度增加，8周時A組鉆孔區均呈低密度，邊緣形成硬化線，B組鉆孔區形成骨小梁結構。（2）組織學結果：2周時A組鉆孔區出現少許炎癥細胞，邊緣出現較多成骨細胞并有骨組織形成，至8周時，鉆孔區內形成骨髓組織，只在邊緣形成骨小梁結構。2周時B組鉆孔區有大量的成骨細胞，邊緣有較多骨組織形成，4周時鉆孔區內充滿新生骨小梁結構，8周時鉆孔區內骨小梁成熟，小梁有骨髓組織填充。［結論］骨髓基質干細胞對兔股骨頭缺血性壞死有良好的修復作用。
【關鍵詞】 股骨頭缺血性壞死； 動物模型； 骨髓基質干細胞； 細胞培養； 移植
Experimental study on treatment of femoral head necrosis in rabbit with transplantation of bone marrow stromal cells∥
Abstract：［Objective］To investigate the repairing effect and mechanism for treatment of femoral head necrosis on transplantation of bone marrow stromal cells.［Method］Twenty-four Newzland rabbits were pided into two groups randomly，Group A as core decompression group and Group B as Bone marrow stromal cells autograft group.Animal femoral head neorosis model was made by freezing method with liquid nitrogen.After freezing and drilling，The drilled necrotic cavities of Group A was implanted with gelatin sponge，while of Group B was with gelatin sponge combined by bone marrow stromal cells.Three animals in every group were sacrificed respectively at 2，4，6，8 weeks and subjected to radiograph and microscope examination.［Result］（1）Radiograph examination:At 2 weeks，the drilled holes in Group A and B all presented low density images.At 4 weeks，the density in the drilled holes increased in group B and the density around the drilled holes increased in group A.At 8 weeks，sclerotic line formed around the drilled holes in Group A and trabeculae appeared in the drilled holes in group B.（2）Microscope examination:in group A，at 2 weeks，a few inflamatory cells appeared in the holes with many osteoblasts and ostoid appeared around the drilled holes.At 8 weeks，marrow formed in the drilled holes in group B，at 2 weeks，there were a large amount of osteoblasts in the drilled holes and some ostoid formed around thc drilled holes.At 4 weeks，the drilled holes were full of trabeculae.At 8 weeks，the trabeculae matured with the marrow appeared in the intertrabecular space.［Conclusion］Bone marrow stromal cells autografting may be an effective way to treat rabbit femoral head necrosis.
Key words：femoral head necrosis； animal model; bone marrow stromal cell； cell culture; transplantation
近年來一些研究發現骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cell，BMSC）減少與股骨頭缺血性壞死有密切關系。有報道用自體紅骨髓移植治療股骨頭缺血性壞死取得了較好的療效。認為移植于股骨頭內BMSC的數目決定著治療的成敗。本實驗用移植體外增殖的BMSC治療兔股骨頭缺血性壞死，探討BMSC在早期股骨頭缺血性壞死治療中的作用及修復機理，為臨床提供理論依據和合理的治療方法。
1 材料與方法
1.1 動物分組
成年新西蘭大白兔24只，雌雄不限，年齡4～5個月，體重2.5～3.5 kg。由白求恩國際和平醫院動物實驗室提供。隨機分為A、B 2組，每組12只。A組為髓芯減壓組，B組為細胞移植組。
1.2 主要試劑
地塞米松磷酸鈉注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字：H330220827，批號：041105。DMEM細胞培養液，GIBCO公司。胎牛血清，杭州四季青公司。
1.3 BMSC的獲取和培養
從實驗動物髂后上嵴處抽取骨髓。全骨髓培養。用硬膜外穿刺針刺入髂骨1～1.5 mm，以含有100 μ／ml肝素0.2 ml的5 ml注射器，迅速抽取骨髓2 ml，所獲骨髓種植于6孔細胞培養板內，每孔種植1 ml，每只實驗動物種植2個孔。加入含20%胎牛血清DMEM液5 ml，反復吹打，再加入地塞米松10-8 mmol／L，微型震蕩器上震蕩2 min，然后放入細胞培養箱內培養。培養箱溫度37 ℃，含5%CO2，100%飽和濕度。5 d后換液，沖去紅細胞，可見多個成纖維細胞克隆貼壁生長。待細胞長滿培養孔面積一半時，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔傳代，2～3 d可見細胞長滿培養孔，將其按1×106／cm2密度傳入細胞培養瓶內。待第3代細胞長滿后，消化細胞并將細胞配成2×106／ml細胞懸液，復合于3 cm×4 cm的明膠海綿上。每塊明膠海綿含細胞懸液50 μl，共10萬個細胞，在細胞培養箱中孵育4 h備用。
1.4 動物造模及細胞移植
所有動物雙側股骨頭均參加實驗。取俯臥位。硫賁妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉。后側入路，暴露股骨頭后不脫位。用液氮棉球連續冷凍3 min。自然復溫后，用直徑為3.5 mm鉆頭從股骨頸內后側向股骨頭內鉆入4 mm，到達關節軟骨下。A組鉆孔后，植入明膠海綿。B組鉆孔后，植入復合有自體BMSC的明膠海綿，關閉傷口。術后連續3 d臀大肌注入硫酸慶大霉素注射液，2 ml／只，每日1次。兩組各于術后2、4、6、8周各處死3只動物，作大體觀察、X線檢查和組織學觀察。
2 結果
2.1 BMSC的生長觀察及鑒定
骨髓培養到第5 d，沖去表面紅細胞，可見每個孔內有3～7個成纖維細胞樣克隆集落貼壁生長，呈放射狀，直徑大小不等。單個細胞呈長梭形，胞漿豐富，細胞核居中，換液2～3 d后細胞克隆增大，待細胞生長占滿培養孔一半時，消化傳代。消化傳代后細胞首先呈圓形透亮，2～4 h后貼壁生長變成短梭形，2～3 d后細胞長滿培養瓶底，呈長梭形緊密排列。3代細胞接種后2～7 d呈指數生長，倍增時間為48 h。
2.2 動物的一般觀察
術后1周內，動物雙側后肢輕度跛行，運動減少，采食減少。而后采食增加，運動增多，步態轉好。2周后恢復術前狀態，傷口Ⅰ期愈合。
2.3 股骨頭標本大體觀察
術后2周標本，A、B 2組股骨頭外形均圓，關節軟骨呈蒼白色，A組有1個標本關節軟骨面有少許剝脫。4周標本，兩組股骨頭外形均圓，關節軟骨呈蒼白色，所有關節軟骨輕度剝脫。6周時，除A組有1個股骨頭標本輕度塌陷外，兩組其余股骨頭標本外形均圓，軟骨呈蒼白色，關節軟骨剝脫加重。8周股骨頭標本，兩組股骨頭外形均圓，關節軟骨剝脫比6周時加重，部分關節軟骨下骨輕度暴露，軟骨呈蒼白色。
2.4 X線觀察
A、B 2組標本在鉆孔缺損區以外的變化大致相似，術后2周，兩組股骨頭密度有所增加，4周標本，除股骨頭密度略比2周時增高外，其余無明顯變化，6周標本，骨小梁結構出現紊亂，軟骨下囊性變，8周標本，股骨頭密度高，骨小梁結構紊亂加重，軟骨下囊性變明顯。兩組標本在鉆孔缺損內有著不同的變化，術后2周時，2組鉆孔缺損區密度低，4周標本，A組鉆孔缺損區中心密度低，邊緣密度有所增高，B組整個鉆孔缺損區密度增高。6周標本，A組仍呈現鉆孔缺損區中心低密度，邊緣高密度，B組鉆孔缺損區出現骨小梁結構。8周標本，A組鉆孔缺損區中心密度低，邊緣密度增高，形成硬化線，B組鉆孔缺損區有正常骨小梁結構。
轉貼于
2.5 組織學觀察
A、B組缺損區以外的病理變化過程大致相似，都出現了壞死和修復現象，在缺損區內，兩組修復現象有很大不同。A組2周標本，缺損區內有少量炎癥細胞，邊緣有較多成骨細胞，并且有類骨質和骨小梁產生（圖1）。4周與2周比差別不大，缺損區邊緣骨小梁增多。6周缺損區出現骨髓組織。8周缺損區邊緣仍然在修復，缺損區出現大量骨髓組織無骨小梁組織（圖2）。B組2周標本缺損區內有大量的成骨細胞（圖3），缺損邊緣有較多的類骨質和新生骨小梁。4周標本，缺損區內有大量骨小梁及類骨質填充。6周標本缺損區內出現比較成熟的骨小梁，骨髓組織出現。8周標本缺損區內骨小梁成熟，骨髓組織形成（圖4）。
3 討論
股骨頭缺血性壞死與多種致病因素有關，除創傷性股骨頭缺血壞死發病機理清楚外，非創傷性股骨頭缺血性壞死發病機理并不完全明了。治療早期股骨頭缺血性壞死的目的主要是促進壞死股骨頭的修復，避免出現股骨頭塌陷。髓芯減壓是治療早期股骨頭缺血性壞死的常用方法，其有效率在30%～90%之間〔1〕。
有報道〔2〕髓芯減壓可以打開骨質，增加股骨頭血流量，但組織學發現髓芯減壓管道內，充滿著幼稚的骨髓和無骨小梁結構組織，股骨頭修復并不完全。這可能是由于爬行替代過程中BMSC太少所致〔3〕。Hernigou等〔4〕研究了激素和酒精股骨頭缺血性壞死患者髂骨BMSC和造血干細胞數目的變化，通過對骨髓培養形成的粒細胞巨噬細胞先祖細胞（GMP）和成纖維細胞克隆形成集落單位（FCF）計數評價骨髓造血干細胞和BMSC的活性。發現股骨頭缺血性壞死患者GMP和FCF計數與健康骨髓捐獻志愿者相比有明顯下降。表明股骨頭缺血性壞死與BMSC減少密切相關。
嚴軍等〔5〕通過自體骨髓移植治療兔Perthes病模型的實驗研究，發現自體骨髓移植組壞死骨修復較空白對照組活躍，骺板損傷處可見少量軟骨細胞，單純鉆孔組以纖維修復為主。認為由于BMSC數目較少，自體骨髓移植治療兔Perthes病模型能力有限，體外培養增殖BMSC，增加植入細胞數目，結合適當的細胞載體，可能更有利于股骨頭壞死的修復。Valerie等〔6〕運用髓芯減壓加經過離心方法處理的自體紅骨髓移植方法治療13例18個處于ARCOⅠ～Ⅱ期缺血壞死的股骨頭，隨訪24個月，骨髓移植組10個關節只有1個髖關節進入到Ⅲ期，而對照組8個關節有5個髖關節進入到Ⅲ期。
骨髓移植治療股骨頭缺血性壞死可以增加股骨頭內的BMSC數量，增強其修復能力。但是骨髓中含有BMSC數量有限，必然影響到骨髓移植后的修復效果。研究發現骨髓中每10萬個有核細胞中才含有1個BMSC，因此增加BMSC數量仍然是這項技術的焦點。盡管人們采用各種各樣的離心方法處理骨髓，以增加單位體積內有核細胞數目，但是這種方法作用畢竟有限，難以達到臨床要求。因此本實驗采用體外培養增殖的BMSC移植于壞死的股骨頭內，以提高單位體積內移植細胞數目。
本實驗發現單純行髓芯減壓的股骨頭，2周標本缺損處成骨細胞稀少，只在鉆孔邊緣形成少量的類骨質及骨小梁，隨著時間的延長，鉆孔區逐漸形成骨髓組織，這一點與文獻報道一致。而移植骨髓基質干細胞組，2周標本缺損處有大量的成骨細胞，鉆孔邊緣形成較多的類骨質及骨小梁。4周時鉆孔區已經被新生骨小梁填滿。6周標本骨小梁相對成熟，骨髓出現。8周標本形成正常骨小梁和骨髓組織，本實驗每個股骨頭內移植的骨髓基質干細胞數目為10萬個，這表明BMSC數目在股骨頭缺血性壞死修復過程中起著重要的作用。
本實驗在股骨頭缺血性壞死修復過程中出現了膜內化骨和軟骨化骨兩種形式，其規律是在壞死骨小梁周圍以膜內化骨為主，在軟骨面和骺板附近以軟骨化骨為主。這可能與BMSC周邊環境中不同的誘導因子有關。兩組在鉆孔缺損區以外都出現同樣的壞死和修復過程，說明骨傳導在修復過程中并未起明顯作用。
本實驗采用BMSC移植治療兔股骨頭缺血性壞死取得了良好的效果，但干細胞移植的最佳密度和數量以及其與誘導因子及載體結合后對股骨頭缺血性壞死修復的效果都需進一步研究。 【參考文獻】
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〔4〕 Hernigou P，Beaujean F.Abnormalities in bone marrow of iliac crest in patients who have osteonecrosis secondary to cortieosteroid therapy or alcohol abuse［J］.J Bone Joint Surg，1997，79:10471053.
〔5〕 嚴軍，董天華，楊照耀，等.自體骨髓移植治療兔Perthes病模型的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2002，10：790792.
篇9
這個名為SCLGL實驗室的主人是日本東京大學醫學助教授、圣釋（北京）生物工程有限公司首席科學家郭鐳。郭是世界首例成人活體肝移植手術的實施者、東京大學名譽教授幕內雅敏（Makuuchi Masatoshi）的學生，并曾榮獲美國臟器移植學會青年研究學者獎。
但在反對者眼中，干細胞研究早已臭名昭著。它總是與人類胚胎、克隆人或者是電影《弗蘭肯斯坦》中那些奇丑無比的人形怪物聯系起來。自從 1998 年“干細胞研究之父”美國科學家詹姆斯·湯姆遜（JamesThomson）成功分離出人類胚胎干細胞以來，圍繞干細胞展開的拉鋸戰就從未停止過。
體積微小的干細胞可令人了解生命如何從一個單一細胞發展而來，但這項研究目前在很多國家尚處禁地。在郭鐳眼中，這是一項令人振奮而且大有前途的研究，其重要性不亞于基因排序研究。孟山都公司前CEO理查德·馬奧尼（Richard Mahoney）說：“生物學是下一波引發巨變的科學浪潮，而干細胞的早期開發則是孕育這些變化的源泉。”
解凍期或即將很快到來。2011年，韓國食品藥品管理局準許由FCB-Pharmicell公司開發的心臟病治療藥物Hearticellgram-AMI自7月1日起投放市場銷售。它的問世標志著世界首例干細胞治療藥物在韓國正式誕生。
按所處發育階段劃分，干細胞可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。這種細胞可分裂、轉變成為各種器官、組織，因此或將被用于修復、治療損傷、病變的組織，這一技術被稱為再生醫療。來至人類胚胎的全能干細胞，可以增殖并分化為全身200多種細胞類型，并進一步形成機體的所有組織和器官。
支持者認為干細胞可治療心臟病、肝病、糖尿病等其他疾病。而最有發展前途、效果最好、用途最廣的干細胞則是胚胎干細胞，它只存在于細胞分裂但尚未開始發育的前幾天里。當然，人們對其爭議亦最激烈—它是胚胎的一部分，它們在皮氏培養皿中由體積只及針頭十分之一大小的細胞球培養而成，在提取過程中，胚胎將被摧毀。正因如此，胚胎干細胞研究在道德倫理范疇上產生了嚴重分歧，其反對者包括教皇保羅二世及美國前總統布什。
干細胞對于當今那些藥物無法治療的頑癥患者來說堪稱福音—成熟細胞之間通過數以千計的細小分子實現交流，其中每個分子均包含特定的“細胞語言”，多數頑癥是由分子間語言交流的突然缺失而造成的，而傳統藥物每次僅能對付某一種分子。例如幫助心臟病人打通阻塞血管以暫時遏制心臟病的發作，但不足以阻止所有誘發心臟病的分子病理因素。
而干細胞治療則不然。作為早期發育敏感度極強的細胞，它可熟練地運用“細胞語言”，同時迅速彌補分子缺失信息。例如對于心臟病病人，它的反應是形成血管和心肌。對于神經細胞損傷，則是取代已經死去的神經細胞，從而成為與大腦的對話中毫厘不差的組成部分。美國路易斯維爾大學心臟中心主任Roberto Bolli教授曾利用僅產生心肌細胞的干細胞來修復心臟衰竭患者。治療前，其心臟泵血量平均僅為全身血液量的30%。治療四個月后，這一數字提升至38.5%。一年后則飆升至42.5%。
用人類基因組科學公司（Human Genome Sciences）的首席執行官哈茲爾廷（William Haseltine）的話來說，干細胞似乎是在“提醒身體它知道如何治愈自己”。哈佛大學神經生物學家伊萬·施耐德（Evan Snyder）則稱其為“神奇的種子”。
不過，要想獲得這些神奇的種子卻并非易事。它需要數以億計的實驗室硬件投資—其投資回報周期長達十年甚至更久，政策法律倫理巨大，風險投資家亦躊躇不前。
異度空間
不過，郭鐳卻幸運的多。一場奇遇改變了他的命運。
2008年3月，國家衛生部批準吉林大學第二附屬醫院開展干細胞移植技術臨床應用，郭是這一項目的主要負責人。這是中國首次正式批準干細胞技術進入臨床應用的單位。這可能是全球范圍內接受干細胞臨床診療人數最多的醫院，人數可達數千人之多。
2010年12月，科技部中國生物技術發展中心官方網站的《“863”計劃生物和醫藥技術領域項目申報指南》顯示，干細胞治療技術臨床轉化及應用研究、數字化醫療工程技術開發作為主題項目獲得資助，而體外診斷技術產品開發、重大化工產品的先進生物制造則作為重大項目獲得資助。上述4個項目科研經費高達7.87億元。
郭鐳亦一度是該項目最有力的申請者之一，一路闖入最后評審環節。因郭精湛的醫術，病人中不乏慕名而來者。
2011年5月，一架極致奢華的專機飛抵長春，機上有兩位尊貴的客人—沙特親王·本·圖爾基·沙特和王妃哈娜·雅德。哈娜1991年因交通意外而患有高位脊椎損傷。在來長春之前，哈娜曾在美國馬里蘭州約翰霍普金斯醫院進行診治，后者連續20年名列全美最佳醫院榜首。但哈娜治療效果卻并不理想，需要借助呼吸機，靜脈營養維持生命。
郭鐳為哈娜制定嚴格的干細胞治療方案。經過近80天的診療，哈娜先后接受了十余次干細胞移植，病情得到顯著緩解。離開長春時，她已脫離呼吸機正常呼吸，正常吞咽食物，借助助步器直立行走。
彼時，偉東集團有限責任公司董事長、融銀資本投資管理有限公司董事長王端瑞正在吉林省負責一個基金。王端端所居住的香格里拉飯店亦是沙特王族下榻的飯店，倍感好奇的王端端向郭提出試用干細胞的請求。不久前，王端端曾在美國邁阿密被灼傷眼睛，看東西如墜霧中，后經檢查得知其眼球過早老化，這種病在正常人中只有千分之幾的可逆概率，有失明之憂。郭在三個月內為王端端注射三針干細胞，后者眼睛很快出現好轉。
這一神奇經歷吸引了王端端，由此對干細胞著迷。
提取這些干細胞并非易事。在郭鐳的實驗室內，你能看到如下場景：身穿白大褂的技術人員將營養液從移液管中滴至皮氏培養皿中—數以千計的培養皿被儲存在小冰箱里。要想進入它們的地盤，你必須潔凈全身，身著無菌服。這里的人擔心的是闖入者會讓細胞感染病菌，而不是相反。“這可能是你在地球上能進入的最潔凈的地方。”王端端告訴《環球企業家》。
保證干細胞質量的關鍵因素之一就是實驗室基礎設施的規劃與數據化建設。為了確保質量，郭鐳必須對以下要素進行控制：標準統一的操作程序、極其苛刻的人員管理、科學規范的數據采集，分析，挖掘程序等等。其管理流程全部由云中心數據支持。
從昂貴的電子顯微鏡中看過去，其中一些培養皿中的梭形旋渦狀物質看似假睫毛一樣漂在粉紅色水中，另一些則像被壓扁的蟲卵。其實，粉紅色液體是氨基酸、細胞因子等營養物質，而“蟲卵”則是從“假睫毛”中生長的神經干細胞。這些細胞正在圣釋實驗室中大量培育，以便取代由于病變受損的神經細胞，治療帕金森綜合癥、老年癡呆癥等。
實驗室彷佛一個與世隔絕的容器，內部空氣負壓為8至10兆帕以避免外部氣體溢入。地板用沒有任何接縫的特殊材質制成，用于打掃地面的水需蒸餾凈化兩次，用于清理實驗操作臺面的超純水則還需加入過氧乙酸、新潔爾滅等消毒材料，價值數十萬的制水機占地相當于一輛邁騰轎車的占地面積，其材質亦為316不銹鋼—通常這種材料被用來制作手術刀。
其中，風淋室、細胞培養室可達萬級潔凈，小于0.3微米粒徑的微塵數量被嚴格控制在每立方米1萬個以內，走廊內則是十萬級潔凈，操作臺則是百級。實驗室內的空氣亦經過三層過濾，特制的空氣濾網每45天即會更換一次。周圍則是精密設備。比如熱電CO2培養箱、流式細胞儀、COBE Spectra 血細胞分離機、Millipore Quotation超純水處理系統、Eppendoref微量移液器、尼康倒置顯微鏡等。這些設備價值不菲，僅一臺流式細胞儀其售價就高達數百萬元。
在這里，制造干細胞的原料是臍帶組織，由一些合作醫院提供。當孕婦生育完成后，臍帶必須在三個小時以內送至實驗室。超過此時間則被廢棄。為了保持其活性，這些細胞被冷凍在-196℃的液氮中。不過，別指望解凍復蘇后很快就會培養出大量的細胞，即使小心翼翼，亦只有0.1%到1%的細胞能夠存活下來。
實驗室負責人梁素麗博士每天長時間用顯微鏡觀察細胞，熟悉分化前的細胞特征，以預測下一步細胞的變化。實驗人員每天例行的記錄內容林林總總，包括二氧化碳氣泵、耗材使用、儀器設備使用記錄、液氮量、室內壓力、溫度、濕度等等。為了確保實驗室的無菌操作，SCLGL實驗室每天為實驗員提供四套無菌制服。試劑及耗材均為符合醫療人體應用標準的進口一次性材料，例如鑷子、試劑管、槍頭等，每天消耗量高達數百個，僅此一項每日花費就達數千元。“這里的實驗環境是我之前工作的單位沒法比的，你能想象在一棟別墅里做實驗嗎？”梁素麗對《環球企業家》說。
在漩渦中
類似的干細胞培養試驗曾經招致了科學家的尖銳批評。斯坦福大學干細胞研究先驅伊夫林·魏斯曼（Irving Weissman）在《自然》雜志上與人合撰的報告里警告說：“一哄而上搞試驗，可能會給患者造成危險。”魏斯曼認為，對干細胞的臨床應用操之過急的醫生猶如莽撞的牛仔。
郭鐳亦認為上述質疑不無道理。時至今日，臨床醫生們并不知曉干細胞究竟應該如何應用才能讓治療效果穩定，甚至最好，從細胞種類、細胞質量、細胞活性單位、移植周期到病人臨床化驗指標等均不確定。就連哪種移植方式效果最好，亦無公認做法—比如治療肝病，是單純靜脈注射？肝動脈介入？還是門靜脈介入？臨床醫生頗感犯難。最激烈的批評是針對胚胎干細胞的—分離人體胚胎干細胞必須破壞早期胚胎。而臍帶干細胞引發的宗教和倫理問題則小得多。
干細胞療法市場的主角顯然是郭鐳這樣的醫生。越來越多的研究者競相加入這場全球性的科研競賽。全球干細胞醫療領域是一個兩年內有著800億美元發展潛能的“金礦”。而未來5年，中國干細胞產業規模將會從目前的20億元增長到300億元，年均增長率達170%。
長期以來，對這一領域的研究執牛耳者是美國，其論文數量是排名第二的日本的3.92倍，美國專利總數占全球總量的56.77%，而中國專利排名僅為第七名。全球前20位頂級研究機構中，其中16家為美國所有，3家為日本所有，1家為加拿大所有。
現在，中國人試圖扳回一局，亦將干細胞研究上升為國家戰略。僅“十一五”期間，中國通過973計劃、863計劃、發育與生殖國家研究重大科學研究計劃和國家自然科學基金等給予其重點投入。
與西方研究多集中于基礎性研究不同，而中國的獨特優勢在于臨床經驗。頗具諷刺意味的是這“得益”于中國糟糕的醫療監管環境以及管理的滯后。一些醫療機構已經急不可耐地將干細胞應用到臨床治療當中。在嚴謹的西方醫學界，如此草率的應用并不合理。但空白的監管灰色地帶正促使許多病人飛往中國接受干細胞治療，有時甚至演變為徹頭徹尾的醫療欺詐。
早在2007年，國家食品與藥品監督管理局基本停止了干細胞藥物的審評工作，而對于干細胞臨床治療的應用和監管卻并無規定。“國家執業醫師法允許醫院可以進行實驗性治療，許多搞干細胞的就鉆了空子。“說句實話這種情況蠻嚴重的，很多上海地區大醫院都沒有放開，小的醫院卻在隨便做。”上海長海醫院干細胞研究中心副主任付強對《環球企業家》說。 2009年，衛生部將干細胞技術歸入“第三類醫療技術”，指其“涉及重大倫理問題，安全性、有效性尚需經規范的臨床試驗研究進一步驗證”，并要求若用于臨床治療，須經衛生部審批。
2012年1月，中國衛生部下令停止所有未經批準的干細胞臨床項目。
但上述規定并未有效執行。“亂象背后還是利益因素，一方面是病人需求與醫院盈利驅動，另一方面源于中國傳統中醫文化對‘偏方’的容忍度較高，干細胞走的是非正常藥品的開發途徑，用類似中醫驗方手法和氛圍在做。”中科院動物干細胞研究所主任胡寶洋說。
國家干細胞工程技術研究中心主任韓忠朝亦稱中國干細胞之“亂”，最顯著的癥狀就是“被嚴重擴大使用了”。此外，還有費用高昂、資質缺失、質量失控等問題。
此外，學術界對干細胞安全性亦有疑慮，稱其可能會引發致癌基因的活性—在京都大學以老鼠為對象的試驗中，有20%產生了腫瘤。“人與老鼠還是很很大區別的。干細胞質量若規范化控制，幾乎是零風險。”郭鐳對《環球企業家》說。為了驗證這一點，郭鐳則身體力行—他靜脈注射干細胞已超過五年，至今無礙。不過，胡寶洋卻并不這么看。“現有干細胞的安全性都是基于非正常途徑獲得數據，病人治療后的癌癥及癌癥風險尚不好說，畢竟現有的跟蹤研究還不夠的，而風險并不會長期阻止干細胞走向臨床試驗。”胡說。
改變
“若要了解干細胞療法的所有好處，就必須解決一些緊迫問題： 哪些細胞能派上用場？怎樣和何時植入這些細胞效果最好？對哪些患者最適用？除非懂得干細胞療法的臨床醫生們能更好地理解其對病患究竟做了些什么，否則這些疑問無解。”郭鐳說。
郭希望圣釋能改變這一切。“每個養細胞的人都知道，要確保干細質量恒定，養干細胞比養孩子都難。”郭鐳說。首當其沖的是確保原料安全性，即臍帶原料是否攜帶肝病、甲乙丙肝、愛滋病以及基因染色體圖譜是否存在缺陷等。一旦確認合格，醫院會讓孕婦對所有檢查結果簽字確認，告知并簽署臍帶處理同意書。此外，圣釋在干細胞培養傳代過程中、冷凍保存前、移植應用前會進行總計六次安全性檢測。為了確保萬無一失，其中三次為外檢。
其次是細胞形態及質量。區分細胞質量和活性需要諸多數據，涉及分子水平、蛋白水平、基因水平、染色體水平、細胞形態，細胞活性、分化能力等六個方面。研發人員可以鎖定某種細胞治療某種病，并研究出分離及檢驗方法，圣釋會在干細胞培養的每個階段拍攝細胞形態的照片，記錄其生長細節。行業內對細胞功能性檢測通常不到5項，而圣釋則多達42項。“我要求每一步都做數據分析，按照標準化、規范化的流程操作，確保干細胞活性恒定。”郭說。圣釋對細胞活性要求嚴格，其存活率要在95%之上。
干細胞生長周期長短各異，短則兩天，長則一個月甚至更久。期間影響細胞生長質量的要素頗多，若想實現干細胞的安全有效、活性恒定頗為艱難。既要保證細胞的活性，又得阻止它們發育。這是一個障礙重重的世界，
只要在郭鐳的實驗室里待上幾個小時，你就會了解干細胞科學家將要忍受多么大的幽閉恐怖。實驗室里擁擠不堪，你必須從一群實驗人員中擠出一條縫來，還得小心別碰倒旁邊的顯微鏡以及各種試劑。為確保適宜的細胞培養環境，僅空氣處理凈化程序就極為復雜，空氣必須經過氣流—初效空氣處理—空調—中效空氣處理—風機送風—凈化管道—高效送風口—潔凈室—帶走塵埃—回風夾道—新風、初效空氣處理，并輔以臭氧消毒，如此重復以實現空氣凈化。實驗室內，抽風機、過濾空調的噪聲巨大，此外，因為實驗室里空氣溫度恒定，長年維持60-80%的濕度，不見陽光，這種感覺梁素麗將其形容為“西安夏天最悶熱時的感覺”。
通常，每次試驗短則三個小時，長則持續十二個小時。“最忙的時候，你必須沒日沒夜都在實驗室呆著。”梁素麗說，“你必須訓練一個助手在自己生病或休假的時候來培養細胞。一個人單獨做這份工作實在是太費心了。”
在梁看來，郭鐳的最大優勢在于其是臨床醫生與實驗室科學家的混合體。“你在中科院找一個年紀差不多培養干細胞的人，可能比郭厲害，但他做的細胞敢不敢在臨床上用，給什么疾病的用，要注意哪些注意事項，怎么去規避風險？他不知道。”王端端解釋說。
細胞培養一半靠理論，一半靠經驗。王端端認為若將其產業化，僅憑經驗是不行的，一個頗為大膽的想法是借助計算機控制干細胞的培養周期、質量控制、活性單位等具體生長指標，結合診療者的生理性、病理性檢測指標，用計算機處理海量信息數據，進行數據挖掘，建立干細胞標準數據庫。
對于特殊疾病治療來說，臨床實踐尤為重要。郭鐳選擇與有治療特長的三級甲等醫院進行研究合作，例如北京大學第一附屬醫院、總醫院等。“它們對病人的判斷、積累及治療效果往往更科學。”郭鐳說。
圣釋要求專家組成員必須具備副教授以上的職稱，以便對干細胞治療過程中的反應做出正確判斷。干細胞并非注射后一勞永逸，會被疾病“清洗”，清洗時間長短因人而異，治療時間間隔亦各不相同。經驗豐富的臨床醫生根據患者各項指標判定療效，確定再次注射的時間。只要出現任何異常反應，醫生應將其完整記錄。如遇困難，專家成員則對癥狀、體征及化驗結果進行會診，并確定用藥方法。整個治療過程會被整合到數據庫。以幫助醫生調整治療準確度。
“所謂風險就是認知的風險，”郭鐳估計超過60%的醫生對干細胞并還不了解亦不認可。例如在注射干細胞前是否需要為病人麻醉，外科大夫們并不知曉。
時至今日，郭鐳本人已親身經歷過超過千例臨床治療過程。“針對某些特定疾病，未來干細胞診療也許會替代傳統的藥物治療，成為全新的第三類診療技術。數據化、標準化的實驗室是干細胞臨床應用必要前提。”郭說。
這一構想最終得到王端端的支持。“一個科研項目能與臨床研究結合，并用臨床的數據支持實驗室的數據采集，我認為這個商業模型太好了。”王端端說。
在王端端的支持下，在此后的兩年間，王端端、郭鐳前往世界各地考察各大實驗室。王端端主要觀察實驗室如何服務于企業及商業化，郭則看實驗室標準化管理、數據化的深度挖掘及先進設備儀器。。令王端端印象最深的是以色列的一家實驗室，其實驗設備的人性化程度令人贊嘆不已。例如椅子的大小、高低、寬窄及材料等均依照實驗室人員體型定制。“一個真正頂級的實驗室一定是服務于人的，如果能為人創造出舒適的環境，他就能創造出偉大的作品。”王端端感慨的說。
回國之后，兩人展開了分工。王端端負責搭建IT系統，郭則負責實驗室硬件及標準化流程。圣釋花費巨資邀請德國公司依照全球藥廠的標準進行流程梳理，并請專業設計公司提供實驗室設計并施工。
最棘手難題在建立一套與現有實驗室環境相匹配的運營數據化體系。郭鐳希望將云計算和原材料管理BOM系統軟件引入實驗室的細胞管理，同時開發了干細胞體外分離、培養、凍存管理、干細胞運營管理、公司財務管理、干細胞診療、電子病歷及數據挖掘分析統計等系統軟件。“未來行業的競爭，就是數據化管理、標準制訂和專業服務。最有價值的不是產品本身而是數據和標準。海量的數據和科學的標準就意味著發言權。”王端端說。
不過，若想從疾病治療中賺到真金白銀并非易事。目前干細胞的市場化尚處初期，一些業內人士稱干細胞治療至少需要5至10年才能實現臨床應用。
“我感覺現在是黎明前最黑暗的時候，這個行業的人都很迷茫，不知道下一步該怎么弄。
也許大突破就在最近幾年會發生。“付強說。
歐美的情況亦不樂觀。2011年，干細胞醫療先鋒美國Geron公司曾決定退出對干細胞用于治療脊髓損傷造成的癱瘓者的研究項目。就商業化產品而言，目前尚無干細胞治療藥品獲得美國食品藥品管理局的批準。
這與美國苛刻的醫療監管體系有關。例如Geron若想申請臨床試驗，必須有足夠的動物實驗數據證明其安全性才行，其申請材料厚度可達數尺。而中國的監管寬松程度令人瞠目結舌。“大多數的情況是不做動物實驗，就直接臨床了。”胡寶洋說。
改變或將發生。2011年10月，科技部會同中科院、自然科學基金會等部門在北京召開了第一屆國家干細胞研究指導協調委員會成立大會。胡寶洋透露今年兩會前后，中國有可能出臺干細胞的相關監管條例，并對干細胞醫院臨床資質、實驗要求等實行準入制。
“未來最大的風險就是你管理的不夠嚴格，質量出問題”。王端端說。不過，在紛繁復雜用于治療疾病的臨床試驗之外，亦有最便捷變現之道—將干細胞引入高端人群的保健領域。在圣釋實驗室旁側，一棟別墅已被改建為康復病房，病人在經過仔細檢查之后會被注射干細胞。
這一生意正處于監管盲區之中—國家并未對干細胞保健從業資質有過詳細且可行的限定。“從療效上看確實很明顯，但干細胞到底通過什么途徑實現的，科學家尚不清楚。效果是肯定的，原因和機制不明白，這種情況政府如何監管？我也說不出來，只能走一步看一步。”胡寶洋對《環球企業家》說。
圣釋甚至吸引了超豪華酒店悅榕莊的注意。悅榕莊品牌及創始人何光平、張齊娥夫婦在2011年元旦曾放棄歐洲度假之旅，專程飛往長春。在參觀郭鐳的干細胞實驗項目之后，何光平夫婦與王端端談及將干細胞與SPA產品融合的事宜。當年9月，悅榕莊即與圣釋簽訂正式合作協議，計劃將干細胞診療融入悅榕莊SPA產品中。2014年，吉林悅榕莊將成為第一家引入干細胞診療的酒店，還將擴展到10家。
不過，眼下可不是舉杯慶賀的時候。兩場突如其來的變故差點毀了這一切。在過去一年，圣釋曾不止一次卷入商業間諜案中，實驗流程和數據險些泄密，實驗室電腦及移動硬盤亦兩次被盜。公安機關調查結果顯示此事乃內部員工所為，后者竟是競爭對手安插的臥底。幾名員工因此鋃鐺入獄。
篇10
此前，為了研究未經批準的干細胞系，研究人員不得不建立獨立的、私人融資性質的實驗室，然后還要經過一系列繁瑣的會計程序，以確保聯邦撥款的每一分錢都不會用在干細胞研究中。但這樣的情況不會再繼續下去了。取消禁令“將給這一領域和其他領域的研究人員大開方便之門。”舊金山加利福尼亞大學的干細胞研究人員阿諾德 克里格斯汀作如上表示。
喬治?Q?戴利博士在波士頓兒童醫院研究兒童血液病，他說，他利用私人資金進行研究，已獲得15條人類干細胞株，如今他首次可以向美國國立衛生研究院(NIH)申請撥款來研究這些干細胞。
奧巴馬總統支持胚胎干細胞研究的時機正與世界干細胞研究取得重大進展的背景不謀而合，日本生物學家山中伸彌在2007年發現，成體細胞能夠重新編程回到胚胎狀態，其容易程度令人驚訝。這項技術“有可能最終使得胚胎干細胞用于治療和診斷的技術變得相形見絀。”干細胞用于治療的前景雖然還很遙遠，但如果能用病人自己的身體細胞進行治療，可避免免疫排斥問題。
美國一些國會議員和其他一些倡導與疾病作斗爭人士一直看好人類胚胎干細胞研究，認為它是快速治愈一些頑固性疾病的可靠途徑。
但在私下里，許多研究人員的胚胎干細胞研究目標定得還是比較實際，他們主要的興趣在于從一些特定疾病的患者那里獲得胚胎干細胞系，通過跟蹤觀察這些細胞在試管內的生長情況了解疾病如何發展的基本知識。
盡管美國杰龍生物醫藥公司利用人體胚胎干細胞醫治脊髓損傷病人的試驗已在今年1月獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準，許多科學家還是認為，把干細胞衍生的組織移植到患者體內還有很長的路要走。胚胎干細胞有其自身缺陷，它們易產生腫瘤，從干細胞中分離出來的成體細胞有可能會受到患者自身免疫系統的排斥。此外，無論是什么樣的疾病過程造成了病人組織細胞的死亡，也同樣有可能殺死外來移植的細胞。所有這些問題也許都有可能得到解決，但至今為止還沒有一個得到解決。
克林頓總統曾過允許NI H給研究員提供資金研究人體胚胎干細胞的設想，但一直沒實行這項政策，直到2001年8月才開始有了這方面的研究，當時的美國總統布什尋求以一種不同的方式同避國會對干細胞研究的限制，規定研究人員可以使用在此之前獲得的干細胞系進行研究。
奧巴馬將克林頓當年提議的政策付諸實行，但美舊國會的限制依然存在。研究人員仍然禁止使用聯邦資金來獲得新的人類胚胎干細胞系。不過，他們將被允許對私人投資實驗室里培養出來的新的干細胞系進行研究。