草珊瑚總黃酮提取研究論文

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【摘要】目的研究草珊瑚總黃酮的提取工藝。方法以草珊瑚為原料，用乙醇為溶劑，利用超聲波輔助提取和水浴法提取草珊瑚總黃酮，利用L9（33）正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化總黃酮提取工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等單因素實(shí)驗(yàn)，考察總黃酮提取率與各因素的關(guān)系。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的顯著條件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，確定最佳工藝條件。結(jié)果超聲波法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時(shí)間45min，根據(jù)確定的最佳工藝條件，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量為69.25mg/g。水浴法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取時(shí)間2h，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量49.60mg/g。結(jié)論超聲波提取不僅在時(shí)間上比水浴提取大大縮短，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程易于控制，黃酮提取率也比水浴提取提高28.38%。

【關(guān)鍵詞】草珊瑚；總黃酮；提取工藝；含量

［Abstract］ObjectiveTooptimizetheextractionprocessoftheflavonoidsfromsarcandraglaber.MethodsUsedsarcandraglaberasrawmaterials，tookethanolextractionmethodsandusedultrasonicwaterbathtoextracttheflavonoids，thenusedL9（33）orthogonalexperimenttooptimizetheextractionprocessofflavonoids.Oneoftheexperimentsisthesinglefactorexperiment.Accordingtothegivenconditionsandmeasuredflavones，whatwewilldoistohavesinglefactorexperimentsaboutdifferentconcentrationsofethanol，feedratio，extractiontimeandtemperature.Accordingtotheremarkableconditionsfromsinglefactorexperiments，wewillhaveanorthogonaldesignandthenselectthebestconditions.ResultsTheoptimumconditionsofultrasonicmethodsarefortheconcentrationof50percentethanol，feedrate1∶15，theextractedtime45minutes，theflavonesin69.25mg/g.Theoptimumconditionsofwaterbathforethanolmethodsareforconcentrationof50percent，feedrate1∶20，theextractedtemperature80℃andtheflavonesin49.60mg/g.ConclusionThetimeusedinultrasonicextractionisgreatlyshorterthanthatofwaterbathandtheexperimentiseasiertocontrolthanthatofwaterbath，andtheextractionrateofflavonoidsalsoraise28.38%thanthatofwaterbath.

［Keywords］sarcandraglaber；flavonoids；extractionprocess；content

隨著草珊瑚在醫(yī)藥、獸藥、保健食品及保健用品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)其有效成分的提取分離顯得越來(lái)越重要。黃酮類化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。目前，對(duì)草珊瑚總黃酮的提取分離工藝技術(shù)研究尚未見有詳細(xì)報(bào)道，本學(xué)位論文擬對(duì)草珊瑚總黃酮提取分離工藝技術(shù)進(jìn)行較系統(tǒng)的研究并篩選最佳新技術(shù)新工藝。采用正交實(shí)驗(yàn)方法考察沸水提取法及乙醇提取法對(duì)草珊瑚總黃酮提取效果的影響；采用中藥高新工程技術(shù)大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮進(jìn)行分離純化研究，以確定草珊瑚總黃酮最佳提取分離工藝條件及方法。以確定的草珊瑚總黃酮最佳提取工藝對(duì)不同季節(jié)采收的草珊瑚中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化，草珊瑚自然存放時(shí)間不同對(duì)總黃酮含量的影響，貴州草珊瑚根、莖、葉中總黃酮的不同含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化研究，以確

定草珊瑚原料的最佳利用時(shí)機(jī)。從而為生產(chǎn)中最有效的開發(fā)利用草珊瑚，獲得草珊瑚總黃酮的最大提取率，發(fā)揮草珊瑚的最大經(jīng)濟(jì)效益提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及指導(dǎo)，以達(dá)到提升草珊瑚藥、食用產(chǎn)品的質(zhì)量檔次，使其更具三效（高效、速效、長(zhǎng)效），三小（劑量小、毒性小、不良反應(yīng)小），三便（便于貯藏，便于攜帶，便于服用）的特點(diǎn)，使其產(chǎn)品能走出國(guó)門、出口創(chuàng)匯，有著重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義［1］。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料原料：草珊瑚購(gòu)于貴陽(yáng)花果園藥材市場(chǎng)；NaNO2（固體）（重慶北碚精細(xì)化工廠）；95%的乙醇溶液（分析純）（遵義國(guó)營(yíng)化學(xué)試劑廠）；Al（NO3）3（固體）（匯源化工有限公司）；NaOH（固體）（天津市化學(xué)試劑六廠三分廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)器材HH-S2s型恒溫水浴鍋（金壇市環(huán)保儀器廠）；UV2755B紫外可見分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）；抽濾機(jī)（金宇機(jī)械有限公司）；JY88（96）-IIN型數(shù)控超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；FA1004型電子分析天平（上海天平儀器廠）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1黃酮類化合物的超聲波法提取研究超聲波提取方法：取原料草珊瑚5g按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇，放入準(zhǔn)備好的燒杯中，超聲波提取，抽濾液體，取0.3ml加入25ml容量瓶中，再在25ml容量瓶中加入1ml5%的NaNO2溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入0.5ml5%的Al（NO3）3溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入10ml5%NaOH溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15min后在500nm處檢測(cè)吸光度，然后記錄數(shù)據(jù)［做空白對(duì)比的不加Al（NO3）3］。

超聲波提取過(guò)程：（1）稱取草珊瑚5g分別裝入準(zhǔn)備好了的燒杯中，在燒杯上填上編號(hào)，并記錄好數(shù)據(jù)。（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)搭配裝入對(duì)應(yīng)號(hào)的錐形瓶中。（3）根據(jù)以上配置好的原料，放入超聲波儀器中進(jìn)行提取。（4）將以上提取物過(guò)濾，將濾液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)出吸光度，并記錄好數(shù)據(jù)。

1.3.2黃酮類化合物的水浴提取研究取原料草珊瑚5g按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇，放入錐形瓶中，水浴鍋加熱，抽濾液體，取0.3ml加入25ml容量瓶中，再在25ml容量瓶中加入1ml5%的NaNO2的乙醇溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入0.5ml5%的Al（NO3）3的乙醇溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入10ml5%NaOH的乙醇溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15min后在500nm處檢測(cè)吸光度，然后記錄數(shù)據(jù)［作空白對(duì)比的不加Al（NO2）3］。

水浴提取的實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：（1）稱取草珊瑚5g分別裝入準(zhǔn)備好了的錐形瓶中，在錐形瓶上填上編號(hào)，并記錄好數(shù)據(jù)；（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)搭配裝入對(duì)應(yīng)號(hào)的錐形瓶中，并用保鮮膜密封好；（3）把錐形瓶放入已準(zhǔn)備好的一定溫度的水浴中加熱，2h后取出抽濾液體轉(zhuǎn)入干凈的燒杯中，并用保鮮膜密封好；（4）將以上的提取物過(guò)濾，將濾液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)出吸光度，并記錄好數(shù)據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備見圖1。從蘆丁對(duì)照儲(chǔ)備液中分別吸取1ml，放入1號(hào)、2號(hào)容量瓶中（25ml），各加60%乙醇至5ml，加5%NaNO2溶液1.0ml，搖勻放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.5ml（空白對(duì)照不加），搖勻再放置6min，加4%NaOH溶液10ml，搖勻放置15min，從400～600nm處測(cè)吸光值：可得出蘆丁在500nm處存在最大吸收峰。

回歸方程：A=0.0095C+0.0016,線性范圍為0～59.82μg/ml，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991

圖1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

首先，精密稱取蘆丁對(duì)照品18.6mg，置于100ml量瓶中，加60%乙醇溶解至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。然后，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0、6.0、7.0、8.0ml對(duì)照品溶液置于25ml容量瓶中，各加60%乙醇至5ml，加5%NaNO2溶液1.0ml，搖勻放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.5ml，搖勻再放置6min，加4%NaOH溶液10ml，搖勻放置15min，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以同法配制空白（不加硝酸鋁）對(duì)照。顯色劑的配置：含量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。所用試劑均為分析純，4%NaOH乙醇溶液（200ml）：稱取8gNaOH置入燒杯中，用200ml60%乙醇溶解。10%Al（NO3）3乙醇溶液（25ml）：稱取2.5gAl（NO3）3置于燒杯中，用25ml60%乙醇溶解。5%NaNO2乙醇溶液（50ml）：稱取2.5gNaNO2置于燒杯中，用50ml60%乙醇溶液溶解［2］。

2.2黃酮提取過(guò)程

2.2.1提取方法（1）超聲波提取：精密稱取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5g置于燒杯中，按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇溶液浸泡，然后用超聲波提取。

（2）水浴法提取：精密稱取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5g置于錐形瓶中，按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇溶液浸泡并用保鮮膜密封好，然后放在水浴鍋上加熱2h，濾去殘?jiān)?/p>

2.2.2樣品測(cè)定精密吸取黃酮提取液0.3ml于25ml容量瓶中，分別加入60%的乙醇6ml，再加入5%NaNO21.0ml，搖勻放置6min，加入10%Al（NO3）30.5ml（做空白對(duì)照的不加），搖勻放置6min，加入4%NaOH10.0ml，加入60%的乙醇定容至刻度。搖勻放置15min在500nm處測(cè)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出濃度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.0095C+0.0016，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程可以推導(dǎo)出C=（A-0.0016）/0.0095，C為物質(zhì)濃度（單位為μg/ml），提取黃酮的質(zhì)量（mg）=C·25/3·10·V·10-3,提取總黃酮含量=提取黃酮的質(zhì)量（mg）/原料草珊瑚質(zhì)量（g）。

2.3超聲波法提取黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

2.3.1乙醇濃度對(duì)超聲波法提取效果的影響在五個(gè)燒杯中各取5g草珊瑚放入，分別用40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液50ml浸泡后超聲波萃取15min，按以上的含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表1。表1表明：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%的時(shí)候，黃酮的提取率反而降低，是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，黃酮成分含量反而降低。表1乙醇濃度對(duì)草珊瑚黃酮提取的影響

2.3.2料液比對(duì)黃酮提取效果的影響在四個(gè)燒杯中各取5g草珊瑚放入，用60%的乙醇，料液比分別1∶5、1∶10、1∶15、1∶20浸泡后超聲波萃取15min，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表2。表2料液比對(duì)草珊瑚黃酮提取的影響表2可見，浸提固液比在1∶10至1∶20的范圍內(nèi)，浸提固液比在1∶15時(shí)提取率最高，但隨后增加溶劑的量對(duì)提取率的變化不大，在實(shí)際操作中，當(dāng)浸提固液比過(guò)小時(shí)，提取液偏少，不利于過(guò)濾分離，因此選擇浸提固液比在1∶15較為合適。

2.3.3超聲波萃取時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響在四個(gè)燒杯中各取5g草珊瑚放入，在料液比1∶10，60%乙醇條件下選擇時(shí)間分別為15min、30min、45min、60min進(jìn)行超聲波萃取，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表3。表3提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響由表3可見，隨超聲波提取時(shí)間15~30min，吸光度增長(zhǎng)0.046，增長(zhǎng)程度一般，而提取時(shí)間30~45min時(shí)，吸光度增加了0.102，幅度大增，而提取時(shí)間45~60min時(shí)，吸光度增長(zhǎng)了0.012，增長(zhǎng)程度大大降低。由此可以看出，再增加超聲波提取時(shí)間，吸光度增速出現(xiàn)先增強(qiáng)再逐漸減緩趨勢(shì)。造成提取物在超聲作用達(dá)到一定時(shí)間后，提取率增加緩慢或呈下降趨勢(shì)的原因可能是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取率增幅降低。同時(shí)超聲作用時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。故45min提取時(shí)間是最好的工藝條件。

由以上單因素實(shí)驗(yàn)可得出幾個(gè)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度50%、60%、70%，料液比1∶10、1∶15、1∶20，提取時(shí)間15min、30min、45min，運(yùn)用這些條件做出提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表（表4），為下面的正交實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備條件。見表5、6。

由表5可看出R料液比＞R乙醇濃度＞R提取時(shí)間，所以本實(shí)驗(yàn)料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數(shù)據(jù)最大者對(duì)應(yīng)的水平為最佳水平，即轉(zhuǎn)化率最高。本實(shí)驗(yàn)的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時(shí)間45min。表4提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表表5L9（33）提取工藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表表6最佳工藝條件提取由表6可看出黃酮含量69.25mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中的A1B2C2（乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時(shí)間30min）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論是合理的。

2.4水浴法提取黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

2.4.1乙醇濃度對(duì)水浴法提取效果的影響在四個(gè)錐型瓶中各取5g草珊瑚放入，分別用50%、60%、70%、80%乙醇溶液75ml浸泡后，水浴提取2h，按以上的含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表7）。表7乙醇濃度對(duì)水浴法提取效果的影響由表7可看出：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但從60%～70%，吸光度增長(zhǎng)幅度變小即提取的黃酮含量增長(zhǎng)幅度變小，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%的時(shí)候，黃酮的提取率反而降低，提取的黃酮含量變小，是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。

2.4.2提取溫度對(duì)水浴法提取黃酮效果的影響在四個(gè)錐形瓶中各取5g草珊瑚放入，在料液比1∶20，60%乙醇條件下選擇60℃、70℃、80℃、85℃進(jìn)行水浴法提取，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表8）。

由表8可看出在乙醇濃度60%、料液比1∶20的不變條件下，隨著提取溫度的升高，吸光度值也在不斷的增長(zhǎng)，60℃~70℃的增長(zhǎng)程度是最大的，吸表8提取溫度對(duì)水浴法提取黃酮效果的影響光度增長(zhǎng)最大，但隨著溫度的繼續(xù)升高，吸光度的增長(zhǎng)程度越來(lái)越小，是因?yàn)殡S著溫度的增加，提取出來(lái)的黃酮參與了其他的反應(yīng)，故提取的增長(zhǎng)率變小了（溫度也不易太高，體積將會(huì)大量減少）。

2.4.3料液比對(duì)水浴法總黃酮提取效果的影響在四個(gè)錐形瓶中按料液比各取草珊瑚放入，在提取溫度70℃、乙醇濃度60%條件下選擇料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30進(jìn)行水浴法提取，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表9）。表9料液比對(duì)水浴法總黃酮提取效果的影響表9可見，浸提固液比在1∶15至1∶20的范圍內(nèi)，吸光度最高，但隨后增加溶劑的量對(duì)吸光度的變化不大，在實(shí)際操作中，當(dāng)浸提固液比過(guò)小時(shí)，提取液偏少，不利于過(guò)濾分離，因此選擇浸提固液比在1∶20較為合適。

由以上單因素實(shí)驗(yàn)可得出幾個(gè)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度50%、60%、70%，料液比1∶15、1∶20、1∶25，提取溫度60℃、70℃、80℃，運(yùn)用這些條件做出提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表（表10），為下面的正交實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備條件，見表11、12。表10提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表表11水浴法提取黃酮L9（33）實(shí)驗(yàn)表表12最佳工藝條件確定表由表11可看出R料液比＞R提取溫度＞R乙醇濃度，所以本實(shí)驗(yàn)料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數(shù)據(jù)最大者對(duì)應(yīng)的水平為最佳水平，即轉(zhuǎn)化率最高。本實(shí)驗(yàn)的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃。

由表12可看出黃酮含量49.60mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中的A1B2C2（乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取溫度80℃）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論是合理的。

3結(jié)論

本文是通過(guò)對(duì)兩種不同的提取方法對(duì)草珊瑚進(jìn)行總黃酮的提取的研究，以便為以后的提取研究找出合適的實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)計(jì)。兩種不同的方法，同樣的浸提試劑，所提取的黃酮量是超聲波法提取的多于水浴法提取的，實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果：超聲波法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時(shí)間45min，根據(jù)確定的最佳工藝條件，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量為69.25mg/g。水浴法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取2h，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量49.60mg/g。

超聲波輔助提取的優(yōu)點(diǎn)有：（1）所用的提取時(shí)間較水浴法縮短了兩倍多；（2）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不用像水浴法一樣，要注意溫度的控制［3］；（3）所提取的黃酮含量比水浴提取高了28.38%。

提取黃酮量,超聲波法提取的多于水浴法,分析原因可能是：（1）超聲波的空化作用對(duì)細(xì)胞膜的破壞有助于總黃酮的釋放與溶出；（2）超聲波使浸提劑和提取物不斷震蕩，有助于溶質(zhì)的擴(kuò)散；（3）超聲波的熱效應(yīng)使介質(zhì)溫度基本維持在60℃，對(duì)草珊瑚有水浴效果；草珊瑚分布廣泛，資源豐富，成分多樣。藥理作用廣泛、毒性小，用于治療多種疾病，無(wú)明顯副作用。目前已有廠家生產(chǎn)了針、片等劑型，日用化工廠以此為原料，制成草珊瑚牙膏。產(chǎn)生了較好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。從文獻(xiàn)資料［4］看來(lái)，盡管已進(jìn)行了生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥理、臨床等方面的研究，但是仍有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步深入研究。

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