微透析技術(shù)在藥學及其他研究的應用

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摘要:微透析作為一門新興的生物活體采樣技術(shù)，具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等優(yōu)點。目前微透析技術(shù)多用于藥學領(lǐng)域的藥動學(PK)和藥動學－藥效學(PK－PD)研究方向，其可以直接有效地監(jiān)測靶組織中內(nèi)源性或外源性藥物動態(tài)變化。本文對微透析技術(shù)在藥學及其他領(lǐng)域中的應用和發(fā)展現(xiàn)狀進行綜述，以更全面的了解該技術(shù)。

關(guān)鍵詞:微透析;活體取樣;藥學;其他領(lǐng)域;應用進展

微透析(Microdialysis)取樣的基本過程是物質(zhì)通過半透性中空纖維透析膜的被動擴散，它是對動物模型和人類患者進行近實時組織內(nèi)化學監(jiān)測的強大技術(shù)。其最早用于研究腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［1］，隨后發(fā)展至對各個組織細胞外液的成分分析中，現(xiàn)如今可被用于監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)、肽、氨基酸、代謝物和激素等。微透析探針經(jīng)溶液灌注后，小分子通過被動擴散進入探針并被掃到探針出口。出口可以直接連接分析系統(tǒng)，如液相色譜、毛細管電泳或質(zhì)譜儀，用于在線分析;也可以收集并儲存離散的透析液樣本，用于以后的離線分析。微透析的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是其廣泛的應用范圍，它可被用于藥理學、神經(jīng)學、生物學和醫(yī)學等研究領(lǐng)域。在藥學領(lǐng)域，許多研究都依賴于對血液、活體組織中藥物濃度的測定，其中游離藥物發(fā)揮真正的藥效作用，但傳統(tǒng)的檢測方法測得的卻是結(jié)合藥物和游離藥物的總和，所以之前的檢測方法測得的結(jié)果無法代表具有藥理活性的藥物濃度。而利用微透析技術(shù)可以直接檢測血液或組織中的游離藥物濃度，操作簡單且可實時觀察。微透析是一種研究藥代動力學的工具，可在獲取組織的藥代動力學信息時發(fā)揮重要作用。

1關(guān)于微透析的概述

微透析技術(shù)以半透膜的透析原理為基礎(chǔ)，在非平衡條件下對插入組織中的探針進行灌流，待測物質(zhì)便可經(jīng)被動擴散進入透析管內(nèi)，并被管內(nèi)的灌流液所帶出，以一定時間間隔將其有序收集起來就可得到透析液［2］，而后可對透析液進行檢測分析，這就是微透析活體取樣的過程。微透析與其他取樣方法相比，它最大的優(yōu)點［3］是可在基本保證機體正常生命活動的條件下進行活體連續(xù)取樣，準確測定游離藥物濃度，顯示藥物在特定時間內(nèi)濃度變化趨勢。而且具有特定分子量的半透膜使透析液中不含有蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，省略了樣品前處理的步驟，避免了樣品污染和操作誤差，提高了實驗結(jié)果的準確性，同時也提高了科研人員的工作效率。其次微透析技術(shù)可在同一動物的不同器官連續(xù)同時采樣，大大減少了實驗動物的數(shù)量。除了可以測定機體內(nèi)的藥物濃度，微透析還可以作為一種給藥途徑，將藥物運送至特定靶點發(fā)揮藥效，這為現(xiàn)代新型給藥系統(tǒng)的研究提供了重要方法。但微透析技術(shù)也并不是沒有缺點，較低的時間分辨率經(jīng)常被認為是微透析的局限性。但隨著時間的推移，各種工作人員通過開發(fā)具有較低檢測限的精細分析方法來提高微透析的時間分辨率。它還存在其他局限性，如探針的植入會對局部組織造成輕微損傷，影響機體正常生理活動;探針回收率受探針、灌流液、灌流速度以及藥物理化性質(zhì)等因素的影響;取樣樣品濃度低，體積小，通常需與靈敏度高的檢測儀器聯(lián)用;只適用于水溶性、小分子的物質(zhì);成本較高等。如果這些問題得到解決，微透析的應用范圍將更為廣泛。

2微透析在藥學領(lǐng)域中的應用

2．1微透析在PK中的研究進展

微透析技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢獲得了國內(nèi)外科研人員在研究藥代動力學這方面的青睞，目前該技術(shù)已在腦部、皮膚、血液、關(guān)節(jié)及其他部位得到廣泛研究和應用。2．1．1基于腦部PK的微透析研究微透析在腦組織中的應用最為廣泛和成熟，腦微透析技術(shù)已在實驗室和各種臨床研究使用了幾十年。作為臨床神經(jīng)監(jiān)測常規(guī)的一部分，腦微透析是一種可以測量腦間質(zhì)液中多種生物能量代謝物濃度的工具。在腦內(nèi)藥動學方面，是一種能夠準確測定游離藥物濃度的高靈敏技術(shù)。腦間質(zhì)液中大型治療分子如單克隆抗體(mAbs)的濃度測定，是神經(jīng)退行性疾病治療從臨床前物種向人類轉(zhuǎn)化的基石之一。微透析和腦開放血流微灌注是目前唯一可用于提取腦間質(zhì)液的方法，其用于嚙齒類動物大分子物質(zhì)收集的研究和表征才剛剛起步。LePrieultFlorie等［4］首次從技術(shù)和性能層面比較了這兩種方法在清醒和自由運動小鼠體內(nèi)測定非靶結(jié)合mAb曲妥珠單抗的腦間質(zhì)液濃度。王圣鑫等［5］利用腦部微透析結(jié)合LC－MS法，對補陽還五湯中的有效成分在中腦動脈阻塞大鼠腦脊液中的濃度變化進行了藥動學研究，該實驗其他中藥復方的藥動學研究提供了依據(jù)。此外，腦微透析技術(shù)在毒品腦局部藥動學研究中也有所應用。冰毒即甲基苯丙胺(MA)，是一種強效中樞神經(jīng)興奮劑，主要作用于腦多巴胺能和5－羥色胺能系統(tǒng)。單胺氧化酶、兒茶酚O－甲基轉(zhuǎn)移酶和醛脫氫酶2(ALDH2)是多巴胺(DA)和5－羥色胺(5－HT)代謝的重要酶，但ALDH2在MA成癮中的作用尚不清楚。KimSeungju等［6］為考察ALDH2抑制MA引起的反應，他們首先給予大鼠MA和/或CVT－10216(一種選擇性ALDH2抑制劑)，評價其運動活性，然后采用衍生化輔助LC－MS/MS法同時定量大鼠腦透析液中DA、5－HT及其代謝產(chǎn)物。分析結(jié)果顯示，CVT－10216可顯著降低DA水平，且隨MA染毒劑量的增加而升高。此外，CVT－10216與MA共同給藥后3－甲氧基酪胺水平升高，可能在拮抗MA引起的反應中發(fā)揮潛在作用。所有這些發(fā)現(xiàn)均提示ALDH2的抑制對MA誘導的高情緒具有保護作用，在MA成癮中具有治療潛力。2．1．2基于皮膚PK的微透析研究真皮微透析直接對靶部位皮膚組織液進行采樣分析，可以測量局部給藥的活性藥物成分(API)在真皮中的釋放速率和程度，得到的藥動學參數(shù)可更真實地反映藥物透皮性能及其在皮膚的代謝情況。在同一受試對象上使用多個測試點，每個測試點重復探針，用此技術(shù)平行比較同一受試對象上不同外用皮膚科藥物產(chǎn)品的一種API的皮膚藥代動力學是可行的，并且有助于減少變異性。為了解局部劑型在用藥后的累積效應，評價微針輔助芍藥苷載藥醇質(zhì)體(TGP－E)的治療效果，探索藥物深度滲透的潛力，HuangJiayi等［7］建立微透析結(jié)合UPLC－MS法研究大鼠TGP－E經(jīng)皮藥動學。結(jié)果表明，微針可以促進醇質(zhì)體進入皮膚發(fā)揮作用，這大大提高了水溶性芍藥苷深層滲透的可能性。該發(fā)現(xiàn)為實現(xiàn)藥物新穎、安全、更有效的劑型和給藥途徑的開發(fā)提供新的見解。LubdaMarkus［8］等為了解不同的理化特性是否會影響活性成分的皮膚滲透及其深度滲透。他們利用微透析技術(shù)來比較豬皮膚中淺層和深層植入的微透析膜的經(jīng)皮滲透，使用組織學切片結(jié)合顯微鏡、超聲和新型計算機斷層掃描方法確定精確的微透析膜深度。最終結(jié)果表明，精確的微透析真皮定位和物理化學特性(如親脂性)會影響活性成分的滲透率，并且該研究為創(chuàng)建優(yōu)化的透皮給藥系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。王偉等［9］應用微透析技術(shù)結(jié)合UPLC－MS/MS來研究鹽酸去甲異波爾定乳膏大鼠經(jīng)皮給藥的藥代動力學。2．1．3基于血液PK的微透析研究血液是最常見的生物檢測樣本，傳統(tǒng)的血液采集方法都會使動物受到不同程度的損害，造成體液損失嚴重，生理狀態(tài)與正常機體存在一定差異;并且由于血液成分復雜，內(nèi)源性物質(zhì)存在干擾，導致前處理過程復雜，這些問題很大程度上影響了藥物研究的準確性和效率。而血液微透析技術(shù)可以攻克這些難關(guān)，因此其被廣泛應用于血液藥動學的研究中。FeiYibo等［10］建立了快速、高靈敏度的LC－MS/MS－微透析聯(lián)用測定全腸外營養(yǎng)(TPN)輸注血漿中美羅培南的方法。在優(yōu)化條件下，將該驗證方法應用于同時輸注TPN的膿毒癥(盲腸結(jié)扎和穿刺誘導)家兔體內(nèi)美羅培南的藥代動力學研究，以模擬臨床實踐。結(jié)果表明，微透析輔助的LC－MS/MS法可成功用于TPN輸注血漿中美羅培南的測定。劉加瑤等［11］應用微透析結(jié)合HPLC研究四逆湯活性成分在大鼠血液和心臟部位的動態(tài)變化情況。近些年來，隨著微透析技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，基于血液及其他部位的雙位點、多位點的微透析應用也越來越廣泛。Mi等［12］采用血腦雙位點微透析技術(shù)，結(jié)合UPLC－MS法考察了以血瘀型偏頭痛患者為研究對象，不同濃度天麻素和天麻苷元對川芎嗪和阿魏酸藥代動力學行為的影響。顧清等［13］應用經(jīng)體外和體內(nèi)回收率校正后建立的皮膚血液雙位點微透析系統(tǒng)，結(jié)合LC－MS來研究苦參堿凝膠在體內(nèi)的藥代動力學。YangChaoNan等［14］為研究均可以治療和改善帕金森病患者運動功能的氨溴索和遠志這兩種藥物可能在血液和大腦中具有中草藥協(xié)同作用的假設(shè)，他們建立了大鼠血液和腦樣品的多微透析系統(tǒng)結(jié)合UPLC－MS/MS方法。研究結(jié)果顯示，該給藥方案不存在藥動學相互作用，將遠志提取物與氨溴索聯(lián)合使用是安全的。2．1．4基于關(guān)節(jié)PK的微透析研究關(guān)節(jié)疾病在人類疾病中越來越常見，因此研究治療關(guān)節(jié)疾病的藥物十分重要，微透析在這方面發(fā)揮了很大的作用。與傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)局部藥動學的分析方法相比，微透析技術(shù)更便捷且更有效。歐詠［15］應用微透析－UPLC－ESI－MS/MS法對大鼠頸靜脈，肝臟和膝關(guān)節(jié)透析液中的小檗堿進行藥動學研究。張衡等［16］使用微透析采樣技術(shù)收集佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腔透析液，并結(jié)合UPLC－Q－TOF/MS技術(shù)探究牛膝總皂苷干預類風濕關(guān)節(jié)炎的代謝相關(guān)機制，結(jié)果證明微透析結(jié)合代謝組學這種方法可行，有利于下一步深入探討牛膝總皂苷的作用機制，并且推動了關(guān)節(jié)靶部位其他藥物的發(fā)展。2．1．5其他部位PK的微透析研究張強［17］利用微透析技術(shù)結(jié)合UPLC－MS/MS研究通竅散疲組分方制劑經(jīng)鼻遞藥的藥代動力學進程。蔣阿梅等［18］應用微透析技術(shù)對鹽酸倍他洛爾眼藥水在兔眼房水的藥動學進行評價。馮晉等［19］為研究天麻成分對羥基苯甲醛的胃腸吸收動力學特征，應用HPLC結(jié)合微透析取樣技術(shù)，采用大鼠在體胃腸原位灌注模型考察不同濃度的對羥基苯甲醛在大鼠胃、腸內(nèi)吸收量的差異，為受試物進一步開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。為了更好地了解抗結(jié)核藥物的藥代動力學，縮短新藥和新組合的臨床試驗所需時間，LanniFaye等［20］建立了優(yōu)化利福平在豚鼠體內(nèi)的微透析方法，以更好地了解利福平在肺部的藥代動力學。在測定探針回收率并確定肺和骨骼肌中利福平濃度之間的相關(guān)性后，采用微透析技術(shù)測定豚鼠骶棘肌中利福平，利福平肺濃度由在骶棘肌測定的利福平濃度估算。這項研究表明微透析對確定抗結(jié)核藥物的藥物濃度具有潛在的可用性，以支持新型結(jié)核病藥物的開發(fā)。

2．2微透析在PK－PD中的研究進展

PK－PD結(jié)合模型的研究在闡明藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制上具有十分重要的地位。而微透析取樣技術(shù)在PK－PD研究領(lǐng)域的應用，可實現(xiàn)幾乎所有組織的取樣，且可以同步測定透析液中藥物濃度及藥效指標含量，更加準確有效地反應藥物濃度與效應的關(guān)系，為靶部位PK－PD的研究打開了一扇新的大門。Wang等［21］建立微透析－UPLC－QQQ－MS法測定清醒缺血性卒中大鼠血漿和海馬中刺五加含有的藥效活性成分和內(nèi)源性神經(jīng)活性物質(zhì)，并將所得數(shù)據(jù)從PK－PD角度進行分析，建立腦缺血區(qū)海馬內(nèi)PK－PD關(guān)系的可視化表達方法。DěrgelMartin等［22］為更深入地了解塌陷肺內(nèi)抗生素的分布對于其有效預防肺炎是必要的。他們在10頭麻醉豬經(jīng)雙腔氣管插管通氣后，采用頭孢呋辛(20mg/kg)單次靜脈滴注30min來給藥，經(jīng)微透析采樣技術(shù)收集到的血液和肺透析液，應用超濾、體內(nèi)反滲透、HPLC－MS法測定游離藥物在血漿和間質(zhì)液濃度，濃度采用非房室分析和房室模型檢查，并比較肺塌陷和通氣時血漿和肺間質(zhì)液中頭孢呋辛的PK/PD。

3微透析在其他研究領(lǐng)域中的應用

微透析技術(shù)因其具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察等獨到的優(yōu)點，已被廣泛運用于腦、皮膚、血液、關(guān)節(jié)、肺、心肌等PK和PK－PD研究，近年來該技術(shù)涉及的領(lǐng)域越來越廣，其在生物學、神經(jīng)學、臨床醫(yī)學及土壤元素含量測定等研究領(lǐng)域也有所應用。

3．1微透析在生物學領(lǐng)域中的應用

臨床萬古霉素(Van)治療需要長時間給藥以達到持續(xù)的治療效果。準確、快速、持續(xù)的Van檢測可以為醫(yī)生在現(xiàn)實環(huán)境中調(diào)整劑量和治療計劃提供基于數(shù)據(jù)的指導，但這種醫(yī)療監(jiān)測需求尚未得到滿足。因此MuFangya等［23］創(chuàng)建了一種Van特異性熒光生物傳感器，結(jié)合微透析采樣技術(shù)開發(fā)了一種快速、簡單、準確和靈敏的檢測方法，并在體內(nèi)對Van進行了驗證。Van特異性探針是通過分別將Van結(jié)合肽L－Lys－D－Ala－D－Ala的二聚衍生物的兩條肽鏈中的每一條與熒光丹磺酰氯基團綴合而產(chǎn)生的。在正常家兔和腺嘌呤誘導的慢性腎功能衰竭(CRF)家兔中記錄了Van的受試者特異性藥代動力學，這表明體內(nèi)治療藥物監(jiān)測的可行性。他們建立的該方法有利于臨床治療中Van的持續(xù)監(jiān)測，并且為臨床治療各種疾病時監(jiān)測血藥濃度的其他有效方法提供科學依據(jù)。

3．2微透析在神經(jīng)學領(lǐng)域中的應用

衰老與急性免疫挑戰(zhàn)的神經(jīng)炎癥反應增強有關(guān)，常被稱為“炎癥反應”。然而，關(guān)于炎癥標志物的基線水平是否在老化大腦的環(huán)境條件下升高，或者這種變化是否主要是在對急性挑戰(zhàn)的反應中觀察到的，存在相互矛盾的報道。PerkinsAmyE．等［24］采用兩種不同的方法評估年輕和衰老Fischer344大鼠的炎癥標志物。其中實驗二采用大分子活體微透析技術(shù)測定成年(3個月)和老年(18個月)雄性和雌性大鼠海馬組織中炎癥因子的細胞外濃度。雖然幾乎沒有觀察到與衰老相關(guān)的顯著變化，但CCL3、CCL20和IL－1α的胞外濃度存在著強烈的性別差異。實驗2還通過選擇性激動劑BzATP的反向透析評價P2X7嘌呤能受體參與神經(jīng)炎癥反應。BzATP使IL－1α和IL－1β釋放增加，并迅速抑制CXCL1、CCL2、CCL3、CCL20和IL－6的釋放。在CCL3、IL－1β和IL－6中觀察到了其他值得注意的隨年齡變化的性別差異。這些發(fā)現(xiàn)共同為神經(jīng)炎癥的晚期衰老和性別差異及其P2X7受體調(diào)控提供了重要的新見解。

3．3微透析在醫(yī)學領(lǐng)域中的應用

肝移植術(shù)后急性排斥反應的臨床和生化表現(xiàn)是非特異性的，往往需要進行一次肝臟活檢來驗證診斷，但這可能會延誤治療。為研究通過微透析監(jiān)測肝內(nèi)葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油是否可用于預測肝移植后早期排斥反應，vonPlatenAnna等［25］對71名接受肝移植的患者術(shù)后使用微透析監(jiān)測。首先根據(jù)標準方案確定1個月內(nèi)出現(xiàn)急性排斥反應的患者，其次對實驗對象每隔12h計算葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油和乳酸/丙酮酸比率的曲線下面積(AUC)，比較有無排斥反應的患者的這些參數(shù)，以及標準的肝血檢查和零時間活檢。結(jié)果顯示，肝移植后早期微透析檢測到的代謝模式表明原發(fā)性缺血再灌注損傷和排斥反應之間可能存在聯(lián)系，識別這些模式有助于鑒別有發(fā)生急性排斥反應風險的患者。

3．4微透析在土壤元素含量測定中的應用

磷是作物必需的營養(yǎng)元素，精確時空施用磷肥可以改善植物磷的獲取并減少磷的徑流損失。磷的優(yōu)化施用受益于了解其從肥料顆粒釋放到土壤中的動態(tài)，這需要對磷進行空間和時間分辨測量其在土壤中的含量。PetroselliChiara等［26］結(jié)合微透析和X射線計算機斷層掃描來研究土壤中P的遷移。微透析探針能夠在最小物理干擾的情況下從一個位置重復進行溶質(zhì)采樣，并且它們的小尺寸允許進行空間分辨監(jiān)測。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的測量技術(shù)(例如吸盤)相比，微透析測量提供了一種侵入性較小的替代方案。

4結(jié)語

微透析作為一種新型的取樣技術(shù)，擁有相當廣闊的應用和發(fā)展前景。雖然有一些局限，但在近年來的應用中，微透析技術(shù)也在不斷改進和完善，并逐漸走向成熟?？梢灶A見，隨著其廣泛應用和技術(shù)的不斷發(fā)展，將會改變藥學及其他領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，加速各個研究領(lǐng)域的研究進程并開創(chuàng)它們的新面貌。

作者：楊濘琪 單位：中國刑事警察學院