青霉素結合蛋白檢測技巧

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當前,細菌耐藥性問題日趨嚴重,給臨床治療帶來困難,對卜內酞胺類抗生素而言,某些菌青霉素結合蛋白(PBps)改變造成的耐藥性,是卜內酞胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質,是細菌致死的靶位。它的數目、位置、親和力的變化造成與卜內酞胺類抗生素不易結合而產生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜,以便了解敏感菌和耐藥菌的區別。

所以,PBPs測定技術是研究壓內酸胺類耐藥性的重要手段。的穿透力弱,用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜,需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國內有關PBps測定技術報道甚少,以3H標記者更少,本文介紹這一技術。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種肺炎鏈球菌31003,30301(北京藥品生物制品檢定所;Pen08.R6本室保存菌種。

1.1.2培養基C+Y培養基。

1.1.3僅器及藥品

垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠);NG一l型真空凝膠干燥器(太倉電視機廠);TGLL一1a型臺式高速冷凍離心機(中科院上海生物化學研究所);8438一超低溫冰箱(FormaSclentifi。,美國);電泳儀DY一1型(上海醫用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide,臨海止學廠產);甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產品);N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED,上海前進農場制劑廠);3H標記青霉素乙酞呱陡鹽(NewEngiandNuclear,美國);x光底片(天津感光材料廠;KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em);2,5一二苯基嗯哇(PPO,閃爍純,上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl,Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs,上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso,北京旭東化工廠)。

1.2方法

1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養基37℃過夜培養,次日再移種新鮮培養基中,37℃培養2~3h至對數生長期,菌數約為個/ml(CFU/ml),菌液分裝試管,每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標記青霉素37℃保溫10min,在冰浴中加入5非標記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml,冷凍離心5000:/minlom仇,棄去上清,菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液,然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保溫10min使細胞溶解,加入30協一樣品緩沖液,煮沸3min,置室溫備用。

1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm),凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/l)5ml,10%SDS0.2ml,蒸餾水8.1ml,真空攪拌10一15min除去氣體,再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。先配制分離膠,灌注直立式電泳槽后,使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠,放入加樣梳,靜置2h。在加樣槽內依次分別加入PBps樣品。接通電流,第一小時維持電壓在60v,至染料前沿到達分離膠和濃縮膠交界處調高電壓至120v,走完全程約需3一4h,用考馬斯藍R250染色30一45min,過夜脫色。

1.2.3關光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min,再用新鮮DMSo再次處理30而n,20%即。處理2一3h,l%甘油和1%乙酸處理lh,將凝膠片貼附在厚濾紙上,使用凝膠真空干燥器進行真空干燥,將凝膠片和x光底片貼緊,置于x光射線暗匣內,放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Zwr,將x光底片顯影,定影,沖洗得到PBPs的放射自顯影圖譜。x光底片預曝光條件:(1)國產x光底片用照相閃光燈紅色濾光片,加6層紅色玻璃紙濾過,x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙,距離50cm,閃光燈閃二次;(2)進口x光底片預曝光用x光機最小功率100mA40kV,距離40em,每張x光底片曝光0.04s。

1.2.4竟爭性結合試驗定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min,然后加入飽和量的氛標記青霉素,37℃保溫10min,再按上述方法繼續進行實驗。

2結果與討論

本法測定肺炎鏈球菌全細胞中pBps的含量,首先需要分離菌體蛋白,為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上,必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜,它能選擇性地作用于胞漿膜(3),使胞漿膜破裂,菌體蛋白釋放出來,與此同時,已經與青霉素結合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來。樣品制備完畢,煮沸3min,以便除去某些蛋白質的干擾,青霉素與PBPs結合較牢固,不會被破壞。

本實驗采用SDS一PAGE方法(4-5),SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%。

氖標記物穿透力較弱,用一般放射自顯影方法不能得出圖象,本實驗采用熒光放射自顯影法(6-8)(Fluoro,aphy),檢測聚丙烯酞胺凝膠片上3H標記的蛋白質,有一定的優點。PPO是熒光增效劑,其作用原理不是直接依賴sH放射出來的日射線,而是藉助3H上的日粒子與PPO相互作用發射出的光,造成x光底片的局部發黑得到深淺不同的暗線,從而獲得青霉素結合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區帶,即p即;(a,b),pBpZ和pBp3。一般情況下,青霉素濃度越大,親和力越強,顏色越深,在競爭性試驗中,甲氧西林濃度越大,親和力越強,顏色越淺。

據報道(7-9),x光底片預曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度,.因為預曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖象吸收值之間的非線性關系,所以,經預曝光的x光底片上所得到的圖象可以正確反映出樣品的放射性分布情況。

用國產x光底片不經預曝光時,無圖象出現,經預曝光則有圖象出現(見圖1),用進口x光底片未經預曝光者,圖象的暗線區別不大(見圖2)。預曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖象(見圖3)。國產x光底片與進口x光底片比較,國產片敏感性較低,預曝后的x光底片上出現的暗線普遍較淺且細,PBPI。不可見。