脊神經根所致脊髓運動論文

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【摘要目的摘要：探索脊神經根性撕脫傷后脊髓運動神經元中Eta1mRNA表達的意義.方法摘要：首先建立脊神經根性撕脫傷的動物模型，采用原位雜交和免疫組織化學方法檢測損傷前后Eta1mRNA在脊髓運動神經元中表達的變化.結果摘要：損傷前Eta1在脊髓運動神經元中微量表達.損傷后3d，損傷側脊髓運動神經元總數減少31.6%，但表達Eta1的運動神經元數量增加52.5%.結論摘要：脊神經根撕脫后Eta1在脊髓運動神經元內上調表達可能是對神經元本身的一種保護.

【Eta1；脊髓；脊神經根/損傷

0引言

Eta1是一種磷酸化糖蛋白［1］，在中樞神經系統的炎癥［2,3］及創傷愈合過程中起到一定功能.然而，有關脊神經根性撕脫傷后Eta1mRNA在脊髓運動神經元中表達的變化及意義尚無相關報道.我們建立脊神經根撕脫的動物模型，探究脊神經根撕脫是否可以改變Eta1在大鼠脊髓運動神經元中的表達水平.

1材料和方法

1.1材料

雄性Wistar鼠8wk齡，體質量200g，30只.用14g/L氟烷及1.5L/minO2對動物行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，長約2.5cm.沿中線剝離左側最長肌，并用小剪刀剪除L5橫突.將經過L5橫突的L3,L4神經根和四周組織分開，用小鉤將其輕輕提起，并用小血管鉗將其從椎間孔拉出，逐層關閉切口，制成L3,L4神經根的椎管外撕脫模型.術后1，3，7，14或21d處死動物.如文獻［4］所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通過灌注泵用冷生理鹽水及40g/L的低溫多聚甲醛（溶于pH7.4的PBS中）對實驗鼠進行心內灌注.收集含有L3，L4脊髓的組織塊，于固定液中4℃過夜固定，然后低溫保護于含200g/L蔗糖的PBS溶液中過夜.用恒溫切片機(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)切取12μm的切片并放置于多聚賴氨酸包埋的載玻片上.

1.2方法Nissl染色，利用甲酚紫對切片進行染色.原位雜交，依文獻［5］所述進行體外轉錄.用BamHI或XbaI切割含有鼠ETA1cDNA序列（核苷酸從259到1025）的pCRⅡ質粒(Invitrogen)，使之線性化.按照操作說明書，利用digoxigeninRNA標記物（Roche）及SP6,T7的RNA聚合酶（Takara），從線性化的質粒中進行正義、反義RNA探針的體外轉錄.用文獻［6］所述方法的改良法進行原位雜交.以正義探針雜交組作為陰性對照.原位雜交反應后，PBS清洗切片5min，然后和一抗在4℃下反應過夜.一抗為單克隆小鼠抗NeuN抗體(1∶400).切片用PBS沖洗3次以上，每次10min.最后和Alexa熒光488共軛的羊抗小鼠IgG抗體反應并用熒光固定劑(DakoCytomation,Copenhagen)固定于載玻片上.如文獻［5］所述進行免疫組化反應.一抗是鼠抗神經細胞核抗體(NeuN;1∶400;ChemiconInternational,Temecula,Calif).隨機從切片中同側及對側的脊髓前角選取0.147mm2大小的范圍，計數NeuN和Eta1陽性細胞.

統計學處理摘要：采用方差分析評估組間差異，并用LSD法進行均數間的多重比較.P%26lt;0.05為有顯著意義.

2結果

脊神經根撕脫傷可造成脊髓運動神經元的逐漸減少（Fig1A,B）.從傷后3d起，損傷側前角運動神經元數目開始明顯減少，而同期對側前角運動神經元的減少則不明顯.運動神經元的減少隨時間顯著增加，在傷后21d時，傷側已有50%以上的運動神經元降解，傷側運動神經元的數量為對側的45%（Fig2）.此時對側運動神經元的減少和對照組比較也有顯著差異（P%26lt;0.05）.在正常對照組運動神經元細胞內觀察到Eta1mRNA的微弱表達（Fig3A）.損傷后3d，在傷側運動神經元細胞中的雜交信號水平升高（Fig3B）.在21d時，Eta1mRNA的表達恢復到正常水平.NeuN的熒光免疫組化及Eta1的原位雜交（Fig4A，B）兩種方法證實Eta1在運動神經元細胞的表達.傷后3d，比較損傷側及對側的前角運動神經元（NeuN陽性）表達Eta1的細胞數量，雖然傷側NeuN陽性的神經元細胞數量減少31.6%，但表達Eta1的細胞數量增加了52.5%（Fig5）.

3討論

本實驗提示，脊神經根撕脫后，Eta1在脊髓運動神經元中的表達上調.雖然由于神經元的死亡，脊髓前角中NeuN陽性的神經元減少，但Eta1陽性的神經元細胞數量是增加的.這表明撕脫傷引起運動神經元細胞中Eta1表達的上調，以此對運動神經元起保護功能.Chabas等［7］報道，在實驗性自身免疫腦脊髓炎的急性期和復發期，Eta1在腦和脊髓的小神經膠質細胞及神經元細胞中均有表達，而在緩解期無表達.因為脊神經根撕脫傷模型也可被視為中樞神經系統［8］炎性反應的模型，所以這兩個獨立實驗的相似結果，進一步證實Eta1在神經元細胞中可能存在保護功能.另外，在其他一些實驗中發現的結果，如Eta1可以保護腫瘤細胞［9］，還能促進培養細胞的發育，防止培養的皮質神經元缺氧死亡［10］也支持這一論點.］

綜上所述，在脊神經根撕脫傷后的運動神經元中可觀察到Eta1表達的上調.我們認為Eta1在中樞神經系統中可能存在著不同于促進炎癥反應的其他功能，即保護神經元細胞抵御iNOS介導的降解的功能.致謝摘要：大阪大學Dr.ShintaroNomura提供含有Eta1cDNA序列的質粒.

【參考文獻

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