山茱萸多糖提取工藝試析論文

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1器材和方法

1.1材料

供試山茱萸干燥果實(shí)產(chǎn)于安徽,購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房有限公司中藥飲片廠，將山茱萸原料粉碎,置干燥器中備用。

1.2試劑

濃硫酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚(分析純重蒸餾試劑),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,氯仿,正丁醇,葡萄糖,氯化鈉等,以上試劑均為分析純。

1.3儀器

核酸蛋白測(cè)定儀,德國Hettich公司；自動(dòng)收樣器,美國Whaters公司；AlphaI-2型真空凍干機(jī),德國Christ公司；電熱恒溫水槽(DK8D型),上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī),德國Hettich公司。

1.4方法

1.4.1粗多糖樣品的制備

山茱萸干粉,不同條件加熱(攪拌)浸提,離心,上清液加熱濃縮至體積的1/4,95%乙醇沉淀至75%(V/V)，4℃靜置過夜,離心,取沉淀,丙酮乙醚無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)沖洗,真空冷凍干燥得到粗多糖樣品。

1.4.2山茱萸多糖含量測(cè)定［4］

采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.0077X+0.0257,R2=0.9995［多糖的量（μg）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)］。

準(zhǔn)確稱取粗多糖樣品6mg,加蒸餾水至50ml,配成120μg/ml的樣品溶液。吸取樣品液1.0ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

1.4.3得率的計(jì)算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖樣品中總糖含量(g)/山茱萸原料質(zhì)量(g)×100%。

1.4.4單因素分析及正交實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取溫度、時(shí)間、料液比、pH值這4個(gè)因素進(jìn)行分析,并從中選取3個(gè)因素水平根據(jù)單因素分析結(jié)果,采用L9(34)表做正交實(shí)驗(yàn),以多糖提取率作為衡量提取效率的客觀指標(biāo)，以確定最佳提取工藝。

1.4.5山茱萸多糖的分離純化

按最佳提取工藝流程,將提取的紅褐色山茱萸粗多糖(ZA)復(fù)溶于水,用Sevag［5］法除蛋白,重復(fù)3次,加95%乙醇至30%,離心,得到粗多糖(ZB),上清液繼續(xù)加95%乙醇至60%,4℃靜置過夜,丙酮-乙醚-無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)沖洗,真空冷凍干燥,得到粗多糖樣品(ZC)。稱取樣品AC200mg,溶于100ml蒸餾水中,然后加到DEAE-cellulose-52離子交換柱洗脫(2.6cm×26cm)上,依次用蒸餾水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0mol/L的NaCl水溶液洗脫,多功能電子蠕動(dòng)泵控制流速為1ml/min,用自動(dòng)收集儀收集,苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖,合并各吸收峰的洗脫液,蒸餾水透析3d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,冷凍干燥,得到山茱萸多糖的兩個(gè)分離產(chǎn)物S1和S2。

1.4.6純度測(cè)定

凝膠色譜法:用0.05mol/LNaCl溶液充分溶脹葡聚糖凝膠SephadexG200,超聲脫氣,攪拌均勻,沿玻璃棒小心緩慢地加入到柱中,同時(shí)用洗耳球敲擊柱壁,使填料沉降均勻、緊密。柱型(2.6cm×33cm)，裝柱完成后,用0.05mol/L的NaCl溶液平衡48h。稱取經(jīng)DEAE柱分離得到的多糖樣品20mg,溶于0.05mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝膠柱中,洗脫液控制流速為0.1ml/min,用自動(dòng)收集儀收集洗脫組分,2ml/管,苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖,觀察吸收峰形狀,若峰對(duì)稱,說明樣品較純,若峰形不對(duì)稱,說明樣品不純,需要進(jìn)一步分離純化,方法同上。

1.5山茱萸多糖理化性質(zhì)

1.5.1物理性質(zhì)

山茱萸多糖的顏色、形狀、水溶性、有機(jī)溶劑的溶解性等。

1.5.2化學(xué)性質(zhì)［6］

Molish反應(yīng),硫酸-苯酚反應(yīng),Fehling試劑反應(yīng),碘-碘化鉀反應(yīng)，三氯化鐵反應(yīng)。

1.5.3蛋白含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法:以牛血清白蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，以O(shè)D595值為縱坐標(biāo),蛋白的量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。

1.5.4多糖基本元素分析

通過CHNS/O元素分析儀來確定純化后山茱萸多糖中基本元素的組成。

2結(jié)果

2.1山茱萸多糖提取條件的單因素分析

2.1.1乙醇添加量山茱萸多糖得率隨乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍數(shù)達(dá)到3倍時(shí)，多糖沉淀完全,所以本研究以下的實(shí)驗(yàn)均選用3倍體積乙醇沉淀多糖。見圖1。

2.1.2提取溫度溫度是影響多糖得率的重要因素。不同溫度(40，50，60，70，80，90℃)對(duì)多糖得率產(chǎn)生影響:多糖得率隨溫度升高而升高,40～60℃升高較慢60～80℃較快,80℃達(dá)到最高值,因此確定正交實(shí)驗(yàn)溫度3水平為60，70，80℃。見圖2。

2.1.3提取時(shí)間提取時(shí)間是影響多糖得率的另一個(gè)重要因素,不同時(shí)間(1，2，3，4，5，6h)對(duì)多糖得率的影響如圖3所示。多糖得率隨時(shí)間升高而升高,1～3h升高較慢,3～5h升高較快,因此確定正交實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間水平為3，4，5h。見圖3。

2.1.4加水量不同加水量(30，40，50，60，70，80倍)對(duì)多糖得率的影響如圖4所示。多糖得率隨加水量增加而增加。30～50倍水升高較慢,60～80倍水升高較快,因此確定正交實(shí)驗(yàn)加水量的水平為60，70，80倍水。見圖4。

2.1.5pH值不同pH值(1～7)對(duì)多糖得率的影響見圖5。在酸性條件下多糖得率明顯降低,pH>3時(shí)對(duì)多糖得率影響不大,可能在強(qiáng)酸環(huán)境下,多糖被降解,并且水提法成本低,所以酸提山茱萸多糖意義不大。

2.2正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上的單因素實(shí)驗(yàn)分析,確定L9(34)表的3個(gè)因素溫度、時(shí)間、料液比的3個(gè)水平。結(jié)果見表1。表1正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平（略）

正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件。結(jié)果見表2。表2正交設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

由表2得知,3種因素對(duì)多糖得率的影響程度為A(溫度)>B(時(shí)間)>C(加水量),水提法提取山茱萸多糖的優(yōu)方案是A3B3C1。由表3方差分析和F檢驗(yàn)得知,在95%可信程度下A和B對(duì)多糖得率的影響顯著,C沒有顯著性影響,三者對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響程度與極差分析結(jié)果一致。表3正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析（略）

2.3山茱萸多糖的分離純化按最佳提取工藝流程,提取的山茱萸粗多糖ZA,經(jīng)Sevag法脫蛋白,由多糖得率看在脫蛋白過程中造成了多糖的同步損失,損失率在8%左右,可能和含有糖蛋白有關(guān)系。脫蛋白后經(jīng)丙酮-乙醚-無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)沖洗后,繼續(xù)分級(jí)醇沉得到ZB和ZC,因預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示ZB抗氧化活性和免疫活性要明顯小于ZC,因此將ZC200mg過DEAE-52纖維素離子交換柱,得到3個(gè)樣品S15.2，S2118.6mg和S311.2mg(S1和S3量少未做研究)。見圖6。采用SephadexG-200對(duì)S2進(jìn)一步純化,洗脫曲線見圖7。經(jīng)濃縮,透析,冷凍干燥,得到進(jìn)一步純化的多糖樣品S21。由圖7看出S11為單一對(duì)稱峰,說明其組分均一。

2.4山茱萸多糖理化性質(zhì)分析

ZA，ZC，S2和S21見表4經(jīng)元素分析儀測(cè)定多糖S21中含C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未檢出。表44種多糖理化性質(zhì)（略）

3結(jié)論

山茱萸多糖經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和L9(34)正交實(shí)驗(yàn),得出其最佳提取工藝條件是:提取溫度80℃，料液比1∶60，提取時(shí)間5h,在此條件下山茱萸多糖得率是13.8%,經(jīng)用Sevag法脫蛋白、丙酮-乙醚-無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)沖洗、分級(jí)醇沉、DEAE-52纖維素離子交換柱層析法和SephadexG-200凝膠柱層析法對(duì)其進(jìn)行分離純化得到組分S21,經(jīng)元素分析儀測(cè)定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未檢出。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山茱萸多糖提取工藝,理化性質(zhì)等進(jìn)行了初步研究,為以后深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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【摘要】通過單因素和正交實(shí)驗(yàn),以多糖得率為指標(biāo),確定山茱萸多糖的最佳提取工藝,同時(shí)對(duì)山茱萸多糖理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果表明，山茱萸多糖最佳水提工藝條件:溫度80℃，料液比1∶60，時(shí)間5h,在此條件下山茱萸多糖得率是13.8%,經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換和SephadexG-200柱層析法得到組分S21,經(jīng)元素分析儀測(cè)定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未檢出。

【關(guān)鍵詞】山茱萸多糖;提取；分離純化；理化性質(zhì)