佛手的產(chǎn)地分析論文

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1材料

1.1藥物收集17批不同產(chǎn)地佛手藥材(主產(chǎn)地或商品，藥材來源見表1)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)程怡教授鑒定;對(duì)照品檸檬油素、67二甲氧基香豆素、5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素、6羥基7甲氧基香豆素均為作者從川佛手植物中提取分離得到，橙皮苷由生物藥品制品檢定所提供(將它們依次編號(hào)為化合物1～5)，經(jīng)波譜分析鑒定結(jié)構(gòu)，歸一化法計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%以上。

1.2主要試劑與儀器美國(guó)DIONEXSUMMITP680高效液相色譜儀(四元梯度泵，CHROMELEONTM數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng));甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Dikma公司，色譜用);水為自制超純水;乙酸乙酯、甲醇、乙醇(廣州化學(xué)試劑廠，提取用)均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1流動(dòng)相及梯度洗脫條件的選擇化合物3～5結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基，化合物1、2中含有含氧基取代，因而它們?cè)诜治鰰r(shí)很容易產(chǎn)生拖尾，使峰變寬，分離度下降，因此要選擇偏酸性的流動(dòng)相，這樣才能減少色譜峰的拖尾，改善峰形,提高峰形的對(duì)稱程度。在比較了甲醇-冰醋酸水系統(tǒng)和乙腈-冰醋酸水洗脫系統(tǒng)色譜分離效果后，最終選擇乙腈-冰醋酸水洗脫系統(tǒng)，并通過多次對(duì)比試驗(yàn)確定了最佳的梯度洗脫系統(tǒng)。在乙腈-冰醋酸水梯度洗脫系統(tǒng)中，樣品中化合物1～5能得到基線分離，而且色譜的對(duì)稱性都很好。表1佛手藥材的來源

樣品號(hào)樣品來源產(chǎn)地采收期規(guī)格購(gòu)買日期F1吉林省片2005.05.04F2天津市絲2005.04.29F3昆明市云南片2005.04.25F4浙江金華市尖峰大藥房連鎖有限公司淅江金華(廣東苗)片2005.04.18F5秦皇島市唐人醫(yī)藥商場(chǎng)廣西2004.03.10片2005.05.08F6秦皇島市唐人醫(yī)藥商場(chǎng)廣東2004.07.05片2005.05.08F7河北祺新中藥顆粒飲片有限公司廣東2004.7～8片2005.03.20F8河北祺新中藥顆粒飲片有限公司廣西片2005.03.20F9河北祺新中藥顆粒飲片有限公司河北2004.7～8片2005.03.20F10四川樂山市中藥材市場(chǎng)四川洪雅2004.7～8片2005.04.20F11四川樂山市中藥材市場(chǎng)四川沐川2004.7～8片2005.04.20F12四川成都市荷花池市場(chǎng)四川滬縣片2005.04.26F13四川成都市荷花池市場(chǎng)四川合江片2005.04.26F14黑龍江三棵針?biāo)幉氖袌?chǎng)廣東片2005.03.15F15黑龍江三棵針?biāo)幉氖袌?chǎng)廣西片2005.03.15F16廣州清平藥材市場(chǎng)廣東肇慶片2005.05.08F17廣州清平藥材市場(chǎng)廣東德慶片2005.05.17

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇化合物1、2、4、5均為簡(jiǎn)單香豆素類化合物，其中化合物1、4于217nm及315～330nm(loge4.2)處可見2個(gè)強(qiáng)吸收峰，同時(shí)在250～270nm(loge3.8～3.9)處有1個(gè)弱吸收峰(見圖1)。但化合物2、5為6，7二氧代香豆素，它們有230nm、340～350nm2個(gè)強(qiáng)吸收峰，同時(shí)有260nm、300nm2個(gè)相等強(qiáng)度的次強(qiáng)峰，它們表現(xiàn)出了類似的紫外吸收曲線，在230nm附近有1個(gè)最大吸收峰。化合物1和2在210nm附近有最大吸收，但因?yàn)槭悄┒宋眨饰詹ㄩL(zhǎng)分別確定為327nm、230nm。化合物3為二氫黃酮苷，所以呈現(xiàn)出典型二氫黃酮類化合物的2個(gè)吸收帶(帶Ⅰ和帶Ⅱ)，即具有強(qiáng)的帶Ⅱ吸收(270～295nm)，而帶Ⅰ以肩峰或低強(qiáng)度吸收峰出現(xiàn)。結(jié)果見圖1。

2.3色譜條件KromasilC18分析柱(250mm×4.0mm，5μm);流動(dòng)相為A(乙腈)5g/L冰醋酸水溶液。線性梯度洗脫時(shí)間程序：0～3min，A的比例為5%;3～8min，A的比例由5%升高到10%;8～48min，A的比例由10%升高到27%;48～63min，A的比例由27%升高到55%;63～68min，A的比例由55%升高到100%;68～75min，A的比例為100%。體積流量：1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬油素為327nm，6，7二甲氧基香豆素為230nm，橙皮苷為290nm，5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素為212nm，6羥基7甲氧基香豆素為229nm;柱溫30℃;分析時(shí)間為75min。對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖2。

2.4樣品溶液的制備

2.4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取檸檬油素、6，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素、6羥基7甲氧基香豆素對(duì)照品適量，溶于甲醇配制成濃度依次為2.04、0.60、0.64、0.62、0.30mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.4.2供試品溶液的制備精密稱取佛手藥材粉末(過80目篩)1.5g于索氏提取器中，加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇70mL，提取4h，濾過，蒸干，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，微孔濾膜濾過，備用。

2.5線性關(guān)系的考察

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

2.6精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定5個(gè)對(duì)照色譜峰的峰面積，并計(jì)算其sR值，測(cè)得sR在0.47%～2.69%范圍內(nèi)。

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)供試品5份，按2.4.2表2樣品線性關(guān)系項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各色譜峰峰面積的sR值，測(cè)得sR在1.21%～4.47%范圍內(nèi)。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、10h進(jìn)樣，結(jié)果測(cè)得各色譜峰峰面積的sR范圍在0.36%～3.17%。

2.9加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知檸檬油素、6，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素、6羥基7甲氧基香豆素含量的供試品粉末(80目)，定量加入檸檬油素、6，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素、6羥基7甲氧基香豆素對(duì)照品適量，按2.4.2項(xiàng)下方法進(jìn)行制備操作，測(cè)定各化合物的加樣回收率，測(cè)得加樣回收率范圍為95.47%～103.69%。

2.10含量測(cè)定精密吸取樣品溶液20μL連續(xù)進(jìn)樣2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算化合物1～5的含量，測(cè)定結(jié)果見表3。表3佛手樣品中化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果

2.11主成分分析

在數(shù)據(jù)分析工作中，常常需要將很復(fù)雜的數(shù)據(jù)集簡(jiǎn)化，即將P個(gè)指標(biāo)所構(gòu)成的P維系統(tǒng)簡(jiǎn)化為一維系統(tǒng)。主成分分析能設(shè)法將原來眾多具有一定相關(guān)性的指標(biāo)(比如P個(gè)指標(biāo))，重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)。若從主成分的觀點(diǎn)來討論這個(gè)問題，主成分分析所構(gòu)成的第一主分量正是這一問題的答案，它提供了自身的權(quán)重系數(shù)。

主成分分析(principalcomponentanalysis)是一種將多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)重要變量的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，又稱主分量分析。在實(shí)際課題中，為了全面分析問題，往往提出很多與此有關(guān)的變量(或因素)，因?yàn)槊總€(gè)變量都在不同程度上反映這個(gè)課題的某些信息。但是，在用統(tǒng)計(jì)分析方法研究這個(gè)多變量的課題時(shí)，變量個(gè)數(shù)太多就會(huì)增加課題的復(fù)雜性。人們自然希望變量個(gè)數(shù)較少而得到的信息較多。在很多情形，變量之間是有一定的相關(guān)關(guān)系的，當(dāng)兩個(gè)變量之間有一定相關(guān)關(guān)系時(shí)，可以解釋為這兩個(gè)變量反映此課題的信息有一定的重疊。當(dāng)變量較多時(shí)，在高維空間中研究樣本的分布規(guī)律就更復(fù)雜。主成分分析采取一種降維的方法，找出幾個(gè)綜合因子來代表原來眾多的變量，使這些綜合因子盡可能地反映原來變量的信息量，而且彼此之間互不相關(guān)，從而達(dá)到簡(jiǎn)化的目的[10～12]。

本研究對(duì)不同產(chǎn)地佛手中5種生物活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，并采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，其結(jié)果見表4～6、圖3、4。表4特征值(λ)表由表4和圖3得知，從特征值的大小來看，λ1=1.856，λ2=1.341，λ3=1.135，而其他遠(yuǎn)小于1;從貢獻(xiàn)率來看，λ1的貢獻(xiàn)率最大為37.111%，而λ2、λ3的貢獻(xiàn)率相差不大，約為20%多，其他的貢獻(xiàn)率較小;從累積貢獻(xiàn)率來看，取前3個(gè)特征值時(shí)，累積貢獻(xiàn)率為86.629%，大于80%，故取前3個(gè)為主成分(因子)。由表5可以看出，第1主成分(因子1)主要反映了來自原始指標(biāo)化合物1(檸檬油素)和化合物4(5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素)的信息，第2主成分(因子2)主要反映了來自原始指標(biāo)化合物3(橙皮苷)和化合物5(6羥基7甲氧基香豆素)的信息，第3主成分(因子3)主要反映了來自原始指標(biāo)化合物2(6，7二甲氧基香豆素)的信息。表5公共因子載荷矩陣表對(duì)佛手進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)λ1對(duì)確定最佳產(chǎn)地貢獻(xiàn)度最大，達(dá)到37.111%，是主要因子。從表6可看出，F(xiàn)16最佳，包含了5種主要化學(xué)成分的最佳綜合信息。

綜上所述，根據(jù)各個(gè)主成分的得分進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)，可以把F16(廣東肇慶)確定為最佳產(chǎn)地樣品，這樣就為多指標(biāo)確定最佳產(chǎn)地提供了新的模式。表6公共因子得分表注：Y(i，1)代表樣品的主成分得分，i代表原始指標(biāo)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，1代表因子1。如果Y(i，1)數(shù)值大，就說明i產(chǎn)地的因子1所體現(xiàn)的原始指標(biāo)的含量就高，反之則低。

3討論

3.1樣品中化合物1～5色譜峰的確定從圖2可以看出樣品的色譜峰數(shù)目比較多，加上測(cè)定的化合物數(shù)量較多而且有的相隔很近，如化合物2和3的色譜峰及化合物1和4的色譜峰，因此，除采用保留時(shí)間對(duì)比和加入對(duì)照品觀察強(qiáng)度變化這些常用的方法外，還進(jìn)一步通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和樣品相應(yīng)色譜峰的紫外吸收曲線來進(jìn)一步確定了化合物1～5所對(duì)應(yīng)的色譜峰。我們分別對(duì)比了對(duì)照品和樣品中化合物1～5的紫外吸收曲線(見圖1)，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照品中各化合物分別與樣品中相對(duì)應(yīng)色譜峰有相同的紫外吸收曲線，據(jù)此就可以更加準(zhǔn)確地判斷最終確定的色譜峰是要檢測(cè)的化合物。圖1化合物1～5的紫外吸收曲線

3.2含量直觀分析本研究采用HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定佛手藥材中4種香豆素類化合物和1種黃酮類化合物含量的方法，該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于大批量佛手藥材的質(zhì)量評(píng)定。

通過對(duì)佛手中多種成分進(jìn)行含量分析，不僅了解了相關(guān)化學(xué)成分在不同產(chǎn)地佛手藥材中的含量或分布，還可以借此去控制和評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。本含量分析實(shí)驗(yàn)中，在保證佛手中待測(cè)成分分離度的情況下，通過調(diào)整梯度洗脫條件，使其他色譜峰也得到了較好的分離。從圖2所示的樣品色譜圖可以看出，在文中的色譜條件下，絕大部分色譜峰都得到了基線分離。這為今后佛手指紋圖譜的建立打下了很好的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)不同產(chǎn)地佛手進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明，所測(cè)的5個(gè)化合物在樣品中的含量有較大的差異。從表3所示的含量測(cè)定結(jié)果可以直觀地看出，佛手中檸檬油素含量高于其他成分，且6，7二甲氧基香豆素只在F12樣品中測(cè)得，在其他樣品中均未測(cè)得。佛手中5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素含量低，在F11和F17樣品中未測(cè)得。6羥基7甲氧基香豆素含量極低，在多個(gè)樣品中均未測(cè)得。圖2所示的樣品色譜圖也顯示了上述特點(diǎn)，從該圖中還可以看出62min左右色譜峰(檸檬油素峰)明顯高于其他成分色譜峰。以上分析表明，本實(shí)驗(yàn)條件下建立的色譜圖，能夠反映不同產(chǎn)地的藥材在品質(zhì)上的差別。

3.3主成分分析本文對(duì)不同產(chǎn)地佛手進(jìn)行主成分分析后發(fā)現(xiàn)，λ1對(duì)確定最佳產(chǎn)地貢獻(xiàn)度最大，達(dá)到37.111%，是主要因子，根據(jù)各個(gè)主成分的得分進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)，廣東肇慶產(chǎn)佛手最佳，包含了5種主要化學(xué)成分的最佳綜合信息。

中藥材有效成分含量的高低，即中藥材的內(nèi)在品質(zhì)，直接影響著中藥材、中成藥和中藥飲片的質(zhì)量和臨床療效。以往在中藥材的生產(chǎn)和產(chǎn)地加工過程中，往往只注重中藥材的產(chǎn)量、生產(chǎn)效益和藥材的外形質(zhì)量，而對(duì)藥材有效成分的積累動(dòng)態(tài)和藥材的內(nèi)在品質(zhì)卻很少重視。藥材質(zhì)量包括內(nèi)在質(zhì)量和外觀性狀，所以中藥材最佳產(chǎn)地應(yīng)是能提供有效成分含量最高，外觀性狀如形、色、質(zhì)地、大小等最佳的藥材產(chǎn)地。

佛手中生物活性成分的形成和積累同樣與生物環(huán)境有關(guān)。僅以佛手中的單一成分判斷佛手的優(yōu)劣是不全面的。檸檬油素在佛手藥材中含量較高，而且現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明檸檬油素為佛手藥材的主要有效成分之一[13-14]，所以將檸檬油素與其他成分作為佛手藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，研究和探討影響佛手藥材品質(zhì)的各種因素，對(duì)提高和穩(wěn)定佛手藥材質(zhì)量具有重要意義。因此，中藥材的最佳產(chǎn)地應(yīng)考慮其生物活性成分含量，再結(jié)合其產(chǎn)率及功效進(jìn)行綜合分析，以生物活性成分絕對(duì)最大含量或最大生物效價(jià)為基本原則，確定最佳產(chǎn)地，以保證藥物能發(fā)揮最大的療效。

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【摘要】[目的]分析不同產(chǎn)地佛手中生物活性成分分布規(guī)律，探索佛手最佳產(chǎn)地的優(yōu)選方法，以確定最佳產(chǎn)地。[方法]采用三維高效液相色譜法，梯度洗脫，測(cè)定17批不同產(chǎn)地佛手中5種生物活性成分(檸檬油素、67二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羥基7甲氧基8異戊烯基香豆素、6羥基7甲氧基香豆素)的含量，并對(duì)其進(jìn)行主成分分析。[結(jié)果]所建模式合理，具有一定的可行性和可靠性，為探討佛手最佳產(chǎn)地提供了一種新的方法。[結(jié)論]佛手最佳產(chǎn)地以廣東肇慶為最佳。

【關(guān)鍵詞】佛手/化學(xué)主成分分析色譜法高壓液相