龍川草骨痛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)論文
時(shí)間：2022-12-21 03:43:00
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【摘要】目的制定龍川草骨痛顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)處方中乳香、沒(méi)藥、延胡索、牛膝、桂枝進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對(duì)綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，用以控制其質(zhì)量。結(jié)果HPLC法測(cè)定綠原酸可達(dá)基線(xiàn)分離，在濃度1.62～21.60μg時(shí)線(xiàn)性良好,回歸方程:A=2516409C-2979，r=1.0000，5次測(cè)定平均加樣回收率為98.7%,RSD為2.29%。結(jié)論該法可準(zhǔn)確地進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。
【關(guān)鍵詞】龍川草骨痛顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；綠原酸
StudyonQualityStandardofLongchuancaogutongGranule
Abstract：ObjectiveToestablishastandardforthequalitycontrolofLongchuancaogutongGranule.MethodsRamulusCinnamomi,RadixAchyranthisBidentatae,RuXiang,MoYaoandRhizomaCorydaliswereidentifiedbyTLC,andthecontrolofChlorogenicacidinCortexEucommiaewasdeterminedbyHPLC.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof1.62～21.60μg(r=1.0000).Theaveragerecoveryofthemethodwas98.7%,RSDwas2.29%(n=5).ConclusionThismethodisreliableandaccurate,andcanbeusedforthequalitycontrolofthispreparation.
Keywords：LongchuancaogutongGranule;TLC;HPLC;Chlorogenicacid
龍川草骨痛顆粒是由杜仲、乳香、沒(méi)藥、延胡索、牛膝、桂枝等15味藥材組成的復(fù)方制劑。具有補(bǔ)益肝腎、舒筋活絡(luò)、養(yǎng)血斂陰、止痛消淤等功能，臨床上用于治療腰間盤(pán)突出、骨質(zhì)增生、頸椎病、風(fēng)濕以及類(lèi)風(fēng)濕癥，療效滿(mǎn)意。處方中杜仲藥材所含的主要成分為綠原酸，綠原酸的含量測(cè)定方法，文獻(xiàn)報(bào)道有薄層掃描法［1］、紫外分光光度法［2］、高效液相色譜法［3］等。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)處方中桂枝、牛膝等五味藥材進(jìn)行定性鑒別；采用了檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度及精密度好的高效液相色譜法，對(duì)處方中的綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，用以控制其質(zhì)量。
1儀器與試藥
1.1儀器LC4A高效液相色譜儀；SPD2A紫外檢測(cè)器；CR3A積分儀；UV260紫外分光光度計(jì)（日本島津制作所）。
1.2試劑與藥品甲醇為色譜純；磷酸、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、正己烷等其它試劑均為分析純。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)7539406中國(guó)藥品生物制品檢定所）。龍川草骨痛顆粒（由沈陽(yáng)軍區(qū)沈陽(yáng)制劑中心提供，批號(hào)20010612，20020620，20020623，20030314）。
2方法與結(jié)果
2.1鑒別
2.1.1桂枝定性鑒別桂枝其有效成分為脂溶性和水溶性?xún)刹糠郑谜麴s法提取揮發(fā)油，以桂皮醛作對(duì)照品，參考桂枝薄層色譜鑒別項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行薄層鑒別，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙紅色斑點(diǎn)，分離效果好，經(jīng)陰性對(duì)照，陰性樣品無(wú)干擾，證明此方法具專(zhuān)屬性與可行性。
對(duì)照品溶液制備：取桂皮醛對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含1μl的溶液，作為對(duì)照品溶液。
陰性對(duì)照液制備：取去桂枝的本品細(xì)粉5g，加乙醇10ml，浸泡20min，時(shí)時(shí)振搖，濾過(guò)，濾液作為陰性對(duì)照液溶液。
供試品溶液制備：取本品細(xì)粉5g，加乙醇20ml，加熱回流40min，濾過(guò)，濾液加入鹽酸2ml，加熱回流1h，后濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚（60～90℃）20ml提取，提取液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。
測(cè)定法：照薄層色譜法［4］，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照液各10μl、對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（17∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。
2.1.2牛膝定性鑒別牛膝含皂苷和脫皮甾酮、牛膝甾酮、鉀鹽和黏液質(zhì)等。有散淤活血、消腫痛、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓等效用。其有效成分三匝皂苷，水解后皂元齊墩果酸，以齊墩果酸為對(duì)照品。使用乙醇，加熱回流提取并在鹽酸條件下，加熱回流將提取物水解，用甲醇制成供試品液，另使用氯仿∶甲醇（40∶1）為展開(kāi)劑。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果好，經(jīng)陰性對(duì)照，陰性樣品無(wú)干擾，證明此方法具專(zhuān)屬性與可行性。
對(duì)照品溶液制備：取齊墩果酸對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
陰性對(duì)照液制備：取去牛膝的本品細(xì)粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對(duì)照液溶液。
供試品溶液制備：取本品細(xì)粉5g，加乙醇20ml，加熱回流40min，濾過(guò)，濾液加入鹽酸2ml，加熱回流1h，后濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚（60～90℃）20ml提取，提取液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。
測(cè)定法：照薄層色譜法［4］，吸取供試品溶液10～15μl、對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿：甲醇（40∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。
2.1.3乳香定性鑒別乳香中含樹(shù)脂、樹(shù)膠、揮發(fā)油。樹(shù)脂的主要成分為游離α、β-乳香脂酸、結(jié)合乳香脂酸、乳香樹(shù)脂烴；樹(shù)膠含阿糖酸、西黃芪膠粘素；揮發(fā)油呈淡黃色，有芳香，含蒎烯、消旋檸檬烯及α、β-水芹烯。采用水蒸氣蒸餾收集揮發(fā)油，以藥材作對(duì)照，以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，進(jìn)行二次展開(kāi)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果好，經(jīng)陰性對(duì)照，陰性樣品無(wú)干擾，證明此方法具專(zhuān)屬性與可行性。
對(duì)照品溶液制備：取乳香對(duì)照藥材0.5g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照品溶液。
陰性對(duì)照液制備：取去乳香的本品細(xì)粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對(duì)照液溶液。
供試品溶液制備：取本品細(xì)粉10g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。
測(cè)定法：照薄層色譜法［4］，吸取供試品溶液10～15μl、對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)3cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。
圖1桂枝的薄層色譜圖（略）
圖2牛膝的薄層色譜圖（略）
圖3乳香的薄層色譜圖（略）
2.1.4沒(méi)藥定性鑒別沒(méi)藥中含樹(shù)脂、樹(shù)膠、揮發(fā)油。樹(shù)脂的主要成分大部分為脂溶性，小部分為水溶性，含α，β-罕沒(méi)藥酸，沒(méi)藥尼酸，α，β-罕沒(méi)藥酚；揮發(fā)油在空氣中易樹(shù)脂化，含丁香油酚、枯醛、蒎烯、桂皮醛等；樹(shù)膠水解得阿拉伯糖、半乳糖和木糖。采用水蒸氣蒸餾收集揮發(fā)油，以藥材作對(duì)照，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，進(jìn)行二次展開(kāi)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果好，經(jīng)陰性對(duì)照，陰性樣品無(wú)干擾，證明此方法具專(zhuān)屬性與可行性。
對(duì)照品溶液制備：取沒(méi)藥對(duì)照藥材0.5g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照品溶液。
陰性對(duì)照液制備：取去沒(méi)藥的本品細(xì)粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對(duì)照液溶液。
供試品溶液制備：取本品細(xì)粉10g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。
測(cè)定法：照薄層色譜法［4］，吸取供試品溶液10～15μl、對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)3cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖4。
2.1.5延胡索薄層色譜鑒別延胡索主要含生物堿，有延胡索甲素、乙素、丙素、丑素等。藥理實(shí)驗(yàn)已證明，均有顯著的鎮(zhèn)痛、安定作用。有行氣活血、散淤止痛之功效。用于心腹腰膝諸痛、跌打損傷、淤血作痛等癥。以延胡索藥材為對(duì)照，使用氯仿提取，用甲醇制成供試品液，另使用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板，以正己烷∶氯仿∶甲醇（7.5∶4∶1）為展開(kāi)劑。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果好，經(jīng)陰性對(duì)照，陰性樣品無(wú)干擾，證明此方法具專(zhuān)屬性與可行性。
對(duì)照品溶液制備：取延胡索對(duì)照藥材0.5g，按供試品制備方法，依法操作，作為對(duì)照品溶液。
陰性對(duì)照液制備：取去延胡索的本品細(xì)粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對(duì)照液溶液。
供試品溶液制備：取本品細(xì)粉5g，加氯仿30ml，濃氨試液1ml，超聲處理30min，濾過(guò)，用硫酸（3→10）提取2次，15ml/次，合并酸提取液，用濃氨試液調(diào)pH9～10濾液作為供試品溶液。用氯仿提取2次，10ml/次，合并氯仿提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。
測(cè)定法：照薄層色譜法［4］，吸取供試品溶液10～15μl、對(duì)照藥材溶液2μl，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正己烷∶氯仿∶甲醇（7.5∶4∶1）為展開(kāi)劑，置已用展開(kāi)劑飽和的層析缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖5。
圖4沒(méi)藥的薄層色譜圖（略）
圖5延胡索的薄層色譜圖（略）
2.2龍川草骨痛顆粒中杜仲所含綠原酸的含量測(cè)定
2.2.1色譜分析條件
測(cè)定波長(zhǎng)選擇：取綠原酸對(duì)照品，加50%甲醇溶解，制成每毫升含10μg的溶液,紫外分光光度法掃描，光譜見(jiàn)圖6。從圖6中看出綠原酸在321nm處有最大吸收，故選擇321nm為測(cè)定波長(zhǎng)。
圖6綠原酸對(duì)照品UV圖譜（略）
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18柱（4.6mm×250mm,7μm）；流速1ml/min；柱溫28℃;進(jìn)樣量20μl。
流動(dòng)相的選擇：參照有關(guān)文獻(xiàn)，選擇甲醇-0.4%磷酸溶液(15∶85)為流動(dòng)相，保留時(shí)間約為17min。
對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5mg（實(shí)際稱(chēng)樣為5.4mg）,置100ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲波處理10min，使對(duì)照品溶解，再加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（54μg/ml）。
供試品溶液的制備：取本品裝量差異項(xiàng)下的粉末約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入氯仿液30ml，超聲處理2次，30min/次,棄去氯仿液，揮干，加甲醇30ml，超聲處理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。
2.2.2方法學(xué)考察
空白實(shí)驗(yàn)：按處方量制備缺杜仲的陰性對(duì)照溶液，照文中所述含量測(cè)定方法操作，結(jié)果空白溶液與綠原酸對(duì)照品相同保留時(shí)間處，未顯示明顯色譜峰，認(rèn)為無(wú)干擾，見(jiàn)圖7。
圖7龍川草骨痛顆粒的HPLC圖（略）
樣品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將待測(cè)樣品溶液，置室溫下貯存，分別于0，0.5，1，2，3，5h,定期測(cè)定含量。結(jié)果6次含量的RSD為0.48%,表明樣品溶液基本穩(wěn)定。
儀器的精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液（54μg/ml）20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD為0.41%，精密度實(shí)驗(yàn)符合要求。
重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一批號(hào)的供試品，分別進(jìn)行供試品溶液的制備、測(cè)定，重復(fù)5次，結(jié)果RSD為1.34%。
線(xiàn)性關(guān)系的考察：精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.30，0.50，1.00，1.50，2.00和4.00ml，分別置于10ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。取20μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，線(xiàn)性方程：A=2516409C-2979，r=1.0000。
加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的同一批龍川草骨痛顆粒（20010612）1g,精確加入綠原酸對(duì)照品適量,按文中供試品溶液的制備方法操作,測(cè)定其含量,并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)（略）
2.2.3樣品測(cè)定取本品裝量差異項(xiàng)下的粉末約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入氯仿液30ml，超聲處理2次，30min/次,棄去氯仿液，揮干，加甲醇30ml，超聲處理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5mg,置100ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲波處理10min，使對(duì)照品溶解，再加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
本品每袋含杜仲以綠原酸（C16H18O9）計(jì)，不得少于1mg。
取本品樣品3批，按上法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2龍川草骨痛顆粒樣品測(cè)定結(jié)果（略）
3討論
3.1提取方法、提取溶劑的選擇分別選用甲醇、乙醇為提取溶劑，超聲波處理30min，結(jié)果甲醇提取量大于乙醇。因此選擇甲醇為提取溶劑。
3.2色譜條件的選擇在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們參考文獻(xiàn)，采用了甲醇與磷酸水的配比，而沒(méi)有采用緩沖液作為流動(dòng)相，有利于色譜柱的長(zhǎng)期使用。
【參考文獻(xiàn)】
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