胃痞消萎縮性胃炎癌病變改變研究論文

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【摘要】觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎(CAG)癌前病變大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖周期分布及凋亡基因表達(dá)的影響。【方法】選用SD大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，模型組，胃痞消高、中、低劑量組(劑量分別為15、75、375g·kg-1·d-1)，維酶素組(劑量為027g·kg-1·d-1)。除正常對(duì)照組外，其他組均采用N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)液自由飲用結(jié)合饑飽失常加耗氣瀉下法復(fù)制脾虛型CAG胃癌前病變模型,觀察胃痞消各劑量組連續(xù)治療4周后對(duì)大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖周期分布、凋亡率、凋亡基因p53、Bcl2和Bax表達(dá)的影響。【結(jié)果】胃痞消各劑量組可顯著增加胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率，增加G0/G1期、減少S期細(xì)胞分布,促進(jìn)p53表達(dá),抑制Bcl2表達(dá)(均P<001),胃痞消高劑量組可顯著促進(jìn)Bax表達(dá)(P<005)。【結(jié)論】胃痞消可抑制CAG癌前病變大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與其能促進(jìn)p53和Bax表達(dá),抑制Bcl2表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】：胃痞消/藥理學(xué);癌前狀態(tài)/中藥療法;胃腫瘤;細(xì)胞周期;基因表達(dá)調(diào)控;疾病模型，動(dòng)物;大鼠

胃癌同其他腫瘤一樣,很少?gòu)恼＝M織發(fā)生癌變,單純的慢性萎縮性胃炎(CAG)與胃癌的發(fā)生可能無直接關(guān)系,而在CAG基礎(chǔ)上發(fā)生的腸上皮化生及異型增生,則是胃癌發(fā)生的組織學(xué)基礎(chǔ)[1]。因此CAG胃癌前病變(PLGC)大鼠模型均采用長(zhǎng)期CAG法進(jìn)行復(fù)制。本文擬通過觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消對(duì)脾虛型CAG模型大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡和增殖周期分布,以及凋亡基因表達(dá)的影響,探討中藥逆轉(zhuǎn)CAG并阻斷CAG癌變的分子機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠77只,體質(zhì)量60～80g,雌雄各半,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：SCXK(粵)20030001;飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)環(huán)境合格證號(hào)：0008252。

12藥品、試劑及儀器N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)由日本東京株氏會(huì)社提供,藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記抗大鼠p53單克隆抗體、PE標(biāo)記大抗鼠Bax單克隆抗體均為美國(guó)Dako公司產(chǎn)品,PE標(biāo)記抗大鼠Bcl2單克隆抗體為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品,PE標(biāo)記的二抗羊抗鼠異硫氰酸熒光素標(biāo)記IgG抗體(FITCIgG)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定,維酶素由張家港制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H46020296)。Facstarplus型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BectonDickinson公司產(chǎn)品。

13分組及脾虛型CAG模型復(fù)制將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)，模型組(15只)，維酶素組(13只，劑量為027g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量[2],下同)，胃痞消高劑量組(13只,劑量為15g·kg-1·d-1,2倍成人臨床等效劑量)、中劑量組(13只,劑量為75g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量)和低劑量組(13只,劑量為375g·kg-1·d-1,05倍成人臨床等效劑量)。除正常對(duì)照組予以正常飲食外，其他組均采用MNNG液自由飲用法[3]復(fù)制CAG大鼠模型：先用滅菌自來水將MNNG配制成10g/mL濃度的儲(chǔ)存液,避光冷藏保存,臨用時(shí)將其配成150μg/mL的飲用液,裝入200mL的飲水瓶中,外貼黑色避光紙,整個(gè)配制過程全部避光操作。在此基礎(chǔ)上結(jié)合經(jīng)典的饑飽失常加耗氣瀉下法復(fù)制脾虛證[4],連續(xù)12周。

14給藥方法于實(shí)驗(yàn)第8周末,從模型組中隨機(jī)取2只大鼠,取胃組織,常規(guī)蘇木素—伊紅(HE)染色,光鏡下觀察到2只大鼠均有胃黏膜萎縮性病變,確認(rèn)模型復(fù)制成功后,所有治療組于第9周開始灌胃給藥,正常對(duì)照組和模型組均灌服等容積滅菌自來水,1次/d,連續(xù)4周。于第12周末,禁食禁水12h后處死,取外周抗凝血10mL,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

15單細(xì)胞懸液的制備取新鮮胃黏膜組織約4g,除去表面黏液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,盡量洗盡組織中的血液,在平面皿上剪成肉糜狀,置300目銅網(wǎng)一邊用眼科鑷手背側(cè)輕輕摩擦組織于銅網(wǎng)表面,一邊將PBS洗搓下的細(xì)胞放入試管內(nèi),在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%相對(duì)濕度下孵育4h。在4℃、1500r/min條件下離心7min,棄上清液,重復(fù)2次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL,制成單細(xì)胞懸液。

16誘導(dǎo)胃癌前病變組織細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將上述制備的單細(xì)胞懸液,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,上機(jī)前離心去除固定液,采用溴化乙啶(EthidiumBromide,EB)一步插入法,DNA定量熒光染色,染液含EB10μg/mL、核糖核酸酶(RNA酶)10μg/mL和曲里通X100(TritonX100)10mg/mL,每份樣品細(xì)胞調(diào)至1×106/mL,4℃染色30min后,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),觀察細(xì)胞周期分布。

17p53、Bcl2和Bax表達(dá)的檢測(cè)采用間接熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),取1mL細(xì)胞懸液,體積分?jǐn)?shù)75%冷乙醇固定,過夜。PBS清洗2次,加單克隆抗體(McAb)p53(第一抗體)、McAbBcl2或McAbBax1μL,4℃反應(yīng)45min。PBS清洗2次,加第二抗體羊抗小鼠FITCIgG50μL(1∶200稀釋),4℃反應(yīng)45min,PBS清洗2次。每組樣品均設(shè)非特異對(duì)照,以PBS代替第一抗體,其余步驟同上。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析,記錄p53、Bcl2、Bax表達(dá)陽性細(xì)胞的百分率,減去非特異對(duì)照值,即為p53、Bcl2、Bax表達(dá)水平。

18統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS150統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以(±s)表示,組間均值的比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)組間均值兩兩比較采用SNK法,方差不齊時(shí)組間均值兩兩比較采用DunnettT3法，檢驗(yàn)水平α=005。

2結(jié)果

21各組對(duì)脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖周期分布的影響表1結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較,模型組胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<001)。與模型組比較,胃痞消各劑量組和維酶素組胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<001);與維酶素組比較，胃痞消各劑量組胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<001)。

與正常對(duì)照組比較，模型組G0/G1、G2+M期細(xì)胞百分率均顯著降低(P<001),而S期細(xì)胞百分率則顯著升高(P<001)。與模型組比較,胃痞消高、中、低劑量組G0/G1期細(xì)胞百分率顯著增加(P<001),S期細(xì)胞百分率顯著降低(均P<001),而胃痞消高、低劑量組G2+M期細(xì)胞百分率比較差異無顯著性意義(P>005),胃痞消中劑量組則顯著增加(P<005)。與維酶素組比較,胃痞消各劑量組G0/G1期細(xì)胞百分率顯著增加(均P<001)，S期細(xì)胞百分率顯著降低(均P<001),胃痞消高、低劑量組G2+M期細(xì)胞百分率顯著減少(均P<001),而胃痞消中劑量組則差異無顯著性意義(P>005)。表1各組脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖周期分布及凋亡率比較(±s)

組別Np凋亡/%p增殖周期/%G0/G1期S期G2+M期正常對(duì)照組101022±2154572±0954720±1201012±151模型組13461±167①3281±125①6280±110①744±168①胃痞消高劑量組132122±242③④7199±168③④2260±170③④753±176④胃痞消中劑量組132063±250③④5960±132③④3219±210③④932±201②胃痞消低劑量組131684±235③④5410±109③④4175±160③④622±184④維酶素組131062±181③3750±114③5497±190③1064±166③①P<001，與正常對(duì)照組比較;②P<005,③P<001，與模型組比較;④P<001,與維酶素組比較

22各組對(duì)脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞p53、Bcl2、Bax表達(dá)的影響表2結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較,模型組p53和Bax表達(dá)顯著減少(均P<001),而Bcl2表達(dá)顯著增加(P<001)。與模型組比較,胃痞消高、中、低劑量組和維酶素組p53表達(dá)顯著增加(均P<001),而Bcl2表達(dá)顯著減少(均P<001),胃痞消高劑量組Bax表達(dá)顯著增加(P<005),而胃痞消中、低劑量組Bax表達(dá)差異無顯著性意義(均P>005)。表2各組脾虛型PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞p53、Bcl2、Bax表達(dá)比較(±s)

組別Np53Bcl2Bax正常對(duì)照組104752±5361144±3024232±1122模型組131236±439①2652±492①2855±961①胃痞消高劑量組133375±819③⑤1426±335③⑤4146±1220②④胃痞消中劑量組132794±627③④1688±345③④3663±1144胃痞消低劑量組132361±842③1959±328③3381±664維酶素組132082±768③2115±343③3127±548①P<001,與正常對(duì)照組比較;②P<005，③P<001,與模型組比較;④P<005,⑤P<001，與維酶素組比較。公務(wù)員之家

3討論

腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病,是增殖與凋亡失平衡的過程[5],表現(xiàn)為細(xì)胞的過度增生和死亡/凋亡減少。細(xì)胞可分為靜止期(G0)和增殖期,增殖周期由G1期、S期、G2期及M期和G0/G1、G1/S、G2/M3個(gè)調(diào)控點(diǎn)組成,化學(xué)物質(zhì)可通過影響增殖周期內(nèi)物質(zhì)代謝,在調(diào)控點(diǎn)作用下,阻滯于G1、S或M期。MNNG作為較強(qiáng)的化學(xué)致癌劑,可導(dǎo)致細(xì)胞DNA甲基化性損傷[6],常用于誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性PLGC。本研究結(jié)果表明,模型組胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡以及G0/G1期、G2+M期細(xì)胞百分率顯著減少,而S期細(xì)胞百分率顯著增加,與胃癌前病變存在細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)紊亂結(jié)果相符[7],提示PLGC大鼠模型復(fù)制成功,胃黏膜上皮細(xì)胞存在細(xì)胞增殖阻滯(阻滯于S期),大鼠胃黏膜從正常胃黏膜細(xì)胞→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型性增生,其凋亡率逐漸升高[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率顯著減少,提示可能存在異型增生。胃痞消各劑量組可顯著增加PLGC大鼠G0/G1期胃黏膜上皮細(xì)胞百分率,減少S期細(xì)胞百分率,表明胃痞消有細(xì)胞增殖抑制作用,可阻滯于G0/G1期,減少S、M期細(xì)胞百分率。

細(xì)胞的凋亡是由凋亡基因進(jìn)行調(diào)控的。p53基因是一種抗癌基因,參與基因穩(wěn)定,p53功能缺失或者發(fā)生突變將導(dǎo)致腫瘤的惡性增生[9]。p53基因表達(dá)產(chǎn)物p53蛋白也能活化p21wafl基因表達(dá),從而抑制細(xì)胞周期蛋白激酶復(fù)合物如cyclinD/cdk4的活性,抑制損傷細(xì)胞由G1進(jìn)入S期,活化的p53蛋白水平增加可降低細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)的閾值,促進(jìn)不能修復(fù)受損細(xì)胞的凋亡[10]。促凋亡基因Bax可以與Bcl2形成異二聚體,決定細(xì)胞凋亡的敏感性[11]。Bcl2可直接調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔的通透性,阻止細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)而抑制細(xì)胞凋亡,而Bax可直接結(jié)合到線粒體膜上,增加線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔膜的通透性,引起細(xì)胞色素C釋放入胞漿,激活Caspases家族,最終引起凋亡[12]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞p53和Bax表達(dá)減少、Bcl2表達(dá)增加,提示PLGC大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞存在增殖與凋亡異常,與增殖周期細(xì)胞百分率結(jié)果一致。胃痞消各劑量組可通過促進(jìn)p53和Bax表達(dá),同時(shí)抑制Bcl2表達(dá),阻止PLGC胃黏膜上皮細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,并通過誘導(dǎo)凋亡,抑制胃癌前病變不典型增生基礎(chǔ)上的癌性惡變。

綜上所述,健脾化瘀解毒中藥胃痞消可抑制PLGC胃黏膜上皮細(xì)胞的不典型增生和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與其能促進(jìn)p53和Bax表達(dá)、抑制Bcl2表達(dá)有關(guān)。

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