灌注后細胞凋亡分析論文

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【論文關鍵詞】缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述

【論文摘要】細胞過度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發生。我國傳統中藥丹參可在細胞、分子、基因水平調控IRI時細胞凋亡的發生，從而對IRI具有良好的防治作用。

在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細胞死亡形式中，凋亡也是一種常見而重要的形式[1-4]。組織細胞一旦壞死，目前人們尚無辦法干預；但細胞凋亡是受一系列程序控制的過程，人們有可能通過干預死亡程序加以挽救。丹參經現代實驗技術證實，對IRI時細胞過度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內容予以綜述。

1丹參對IRI時細胞凋亡的抑制作用

Wu.W等[5]利用原位細胞凋亡標記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實驗觀察到：左大腦中動脈結扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆狀核缺血區出現大量凋亡細胞，24~48h達到高峰；預先給予丹參則在相應部位只見到少量凋亡細胞；且與對照組比較，24h時間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過減少神經細胞凋亡對腦IRI發揮保護作用。丹參是否對其他器官也有類似作用目前尚未明了。

2丹參抑制IRI時細胞凋亡的作用機制

2．1減少蛋白酶表達

細胞發生凋亡的中心環節是激活以蛋白酶-白介素-1轉化酶(interleukin-1β-convertingenzyme,ICE)組成的級聯反應。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。

目前已發現13個成員，根據其序列同源性分為3個亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三個亞家族分別稱為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過度表達將導致細胞凋亡的發生[6]。

張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發現，前腦IRI后1d，大鼠海馬CA1、CA4區出現明顯的ICE免疫陽性反應，第3天達高峰，第5天后明顯減少；腦皮質也呈現出與海馬區類似的現象，ICE免疫陽性反應細胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達明顯減少，特別是大腦皮層區和海馬CA1區。因此，作者認為ICE在腦缺血中可能發揮重要的凋亡調節作用；丹參能下調腦缺血區ICE表達，從而發揮其神經保護作用。

2．2阻斷誘導細胞凋亡的信號轉導

大多數情況下，來自于細胞外的誘導因素，如自由基、細菌、病毒等作用于細胞后轉化為細胞凋亡信號，并通過胞內不同的信號轉導途徑最終激活細胞死亡程序，導致細胞凋亡。因此，凋亡信號轉導系統是連接凋亡誘導因素與核DN段化斷裂及細胞結構蛋白降解的中間環節[6]。丹參經實驗證實，可干預下列已知的凋亡相關信號轉導通路，從而實現其抗凋亡作用。

2．2．1死亡因子及其受體介導的信號轉導

腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關凋亡誘導性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導細胞凋亡，因此被稱為死亡因子[6]。介導它們誘導凋亡的受體為死亡受體。在體內，TNF主要由巨噬細胞(Mφ)分泌。大量體內外實驗證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過抑制TNF-α的生成和釋放，減少IRI時細胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無文獻報道。

2．2．2第二信使鈣誘導的凋亡

Ca2+是細胞凋亡發生過程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續升高可使核酸內切酶激活，DN段化。應用膜聯蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標記及流式細胞術、全細胞膜片鉗放大系統顯微熒光測定術同步觀察H2O2誘導人類肝細胞(LO2細胞)、內皮細胞(EVC304)凋亡時不同時限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時發現：①H2O2作用后0．5h即出現Ca2+躍升現象；當［Ca2+］i>400nmol/L后1h出現典型的細胞凋亡膜翻轉現象，即磷脂酰絲氨酸從細胞膜內層轉移到外層；此后，［Ca2+］i持續升高，早期凋亡細胞(Annexia-V+)、死亡細胞(PI+)指數均上升；熒光顯微鏡下出現大量綠色熒光的早期凋亡細胞和胞漿或胞核紅染的死亡細胞。同時［Ca2+］i上升了一個數量級；②在Rax處理組H2O2作用8h后［Ca2+］i尚未超過400nmol/L，與對照組比較差異顯著(P<0．01)。其余各指標也相應降低，細胞凋亡數減少[11]。這一實驗表明，H2O2誘導的細胞凋亡可能主要是Ca2+依賴性的，且［Ca2+］i>400nmol/L很可能是細胞凋亡啟動的早期信號。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉運，由此可能減少其在核內促進凋亡基因信號傳遞中的作用及其后引起的細胞凋亡，減輕細胞損傷。分析其機理可能是：①作為咖啡酰縮酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發生氧化反應，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對細胞膜及細胞器膜的損傷，減少Ca2+經細胞膜和內質網滲漏入細胞內；②因肝細胞Ca2+內流由鈣-鈣調蛋白復合物和IP3敏感鈣池共同調節。故Rax對LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調節蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開放所致[11]。

2．2．3由線粒體損傷后啟動的細胞凋亡新近的研究證實，由活性氧(ROS)、細胞內Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發細胞凋亡的重要觸發機制[11,12]。當這些死亡信號到達線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉換并釋放凋亡相關蛋白，包括細胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導致細胞凋亡。IRI時ROS生成過多，細胞內Ca2+超載，線粒體受損，誘導細胞過度凋亡[6]。丹參具有強大的清除自由基、減輕鈣超載、保護線粒體結構和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導因素的產生，阻斷了此通路啟動的細胞凋亡[13-15,17]。

2．3調節凋亡相關基因表達

細胞凋亡是級聯式基因表達的結果。目前已知細胞凋亡相關基因多達數十種，根據功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對Bcl-2的研究最為詳細而系統；促進凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調控基因，如J-myc、Bclk等。正常情況下，促進凋亡基因與抑制凋亡基因處于協調的對立統一狀態，IRI時這種平衡被打破，組織細胞凋亡增多[2]。

張金濤等[7]報道BcL-2在前腦缺血2h就有表達，于6h達高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區最為顯著。說明BcI-2主要在細胞凋亡早期發揮作用。丹參在缺血30min給予后，BcL-2的表達明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進一步證實復方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽性表達數(PEI)明顯增加，還可使心肌細胞凋亡指數及Fas蛋白PEI下降。且隨著復方丹參滴丸的劑量加大而進一步降低(P<0．05；P<0．01),說明丹參可恢復各凋亡基因之間的平衡，從而發揮其保護作用。

綜上所述，丹參作用廣泛，對IRI細胞凋亡各環節都有調節作用，從細胞、分子及基因水平阻斷了IRI發生發展過程中因細胞凋亡引起的一系列“惡性循環”，從而表現出對IRI顯著的保護作用。因此，丹參對減輕IRI來說是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應用前景；同時丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過度引起的疾病提供了一條新思路。

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