線粒體分子標記技術下的水產養殖論文

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1D-loop區

線粒體DNA非編碼區由兩個tRNA基因分離，D-loop區域就處在這個非編碼區中[2]。在線粒體DNA中，D-loop區是重鏈和輕鏈的復制起點，也稱之為“控制區ControlRegion”，其進化壓力較小，是線粒體DNA基因組序列和長度變異最大的區域，Horai等[3]發現該區域的基因變化速度比細胞核DNA和其他細胞器的基因快5倍，同時也是進化最快的部分。因此，選擇D-loop區作為鑒定種群遺傳狀況的分子標記直接有效。利用D-loop的序列在群體遺傳學上進行分析的工作在20世紀70年代就已經展開了，那時候僅僅用于分析區域內種間的親緣關系。現今，D-loop區已經廣泛被用作非常高效的工具來推斷不同區域內種間或種內的親緣關系和遺傳狀況。D-loop區中仍然細分為3個部分，中央保守區、終止序列區和保守序列區。其中終止序列區包含了線粒體DNA終止復制的相關序列，是變異最大的部分[4]，最具研究和分析價值。在進行數據結果分析時，由D-loop序列分析得到的單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性是兩個評價群體遺傳資源或者群遺傳多樣性的重要指標。

1.1野生群體遺傳多樣性分析

1.1.1D-loop部分序列分析D-loop序列分析中，由于并不是整個D-loop序列都發生堿基的插入或者替換，可以采取對保守序列區或者終止序列區的部分區域進行擴增。由于這兩個部分的進化比中央保守區迅速得多，只對這一區段的序列進行分析也能代表物種的遺傳多樣性和進化過程。張仁意等[5]對青海4個不同湖水采集的155尾裸鯉（Gymnocyprisprzewalskii）個體的線粒體DNA的D-loop區中部分序列進行擴增，得到754bp的序列長度，分析發現155個樣本中有34個單倍型，但4個群體中可魯克湖群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性遠低于其他種群；進一步的遺傳分化系數的分析表明，該地區已經產生一定的遺傳分化，但由于地理隔離的原因，系統發育樹結果還沒有發展出明顯的單枝，加之該區域群體的遺傳多樣性偏低，需要進行重點保護。

鄭真真等[6]對全球大青鯊（Prionaceglauca）進行了D-loop區中694bp擴增分析，采集了來自中東太平洋、中西太平洋、中東大西洋、西南大西洋和印度洋5個海域的165尾個體，分析發現145個單倍型，變異程度非常大。進一步分析后發現5個區域的大青鯊種群的單倍型和核苷酸都處于較高水平，種質資源較好；但是遺傳分化指數顯示5個區域存在強烈的基因交流，種群遺傳分化水平較低。鄒芝英等[7]采集了8尾長鰭鯉（Cyprinuscarpiovar.longfin），擴增得到600bp的部分序列，找到了與終止區域相關的6個特征序列；對這些特定的區域分析得到6個單倍型，13個變異位點，顯示了較好的種質資源狀況，核苷酸多樣性數值與其他魚類接近，遺傳狀況中等，由于該物種稀有且僅存在偏遠地區，保護珍惜水產動物資源已經迫在眉睫。向燕等[8]為了了解3種鱘魚：達氏鱘（Acipenserdabryanus）、中華鱘（A.sinensi）和史氏鱘（A.schrencki）親魚的遺傳狀況和遺傳背景，對線粒體D-loop區部分序列進行分析，擴增得到400bp的序列，49尾親魚個體一共得到僅18個單倍型，并且對于單倍型系統發育樹分析后，發現集中在6個單倍型中，說明這些群體很有可能來自同一母親；不過各單倍型遺傳距離較遠，說明父本來自不同的個體；其結果提示，在生產中仍要采用不同單倍型進行人工繁育，以避免近親而導致種質退化。

Kumazawa等[9]研究發現，D-loop的5＇端和3＇端有串聯重復序列，這段的變異速率較快。Abinash等[10]在北美不同區域采集淡水扁頭鯰（Pylodictisolivaris），對35bp的串聯重復區進行分析檢測，從美國35個水系采集了330尾樣本，分析結果發現，在東南墨西哥灣的70%樣本出現串聯重復的變異，而采自密西西比河95％的樣本和墨西哥灣西南沿岸的扁頭鯰沒有出現這個區域的變異；系統發育的計算結果表明，在70萬年和205萬年左右出現群體分流；從地理位置上看，密西西比河的支流進入墨西哥灣西南沿岸流域，而東南墨西哥灣為另一條流域；該結果表明種群的遺傳結構受到地域特殊性的影響。D-loop區部分序列的結果分析能滿足一定程度的遺傳多樣性和遺傳狀況分析，可以得到可靠的結果數據幫助人們進行資源保護和簡單的育種工作。隨著科技進步和測序水平的改善，進行全序列的測序漸漸進入研究者的視野，全長序列將獲得更加完整和正確的結果。

1.1.2D-loop全序列分析D-loop的多態性一種是來源于堿基的突變、插入和替換形成的不同單倍型，不僅種間有差異，種內個體間也存在差異，只是重復的差異小于種間的差異。而且在個體中D-loop一旦發生差異，線粒體DNA會穩定地將這種差異遺傳下去，這種差異在個體間表現為線粒體DNA分子的長度變異，因此對D-loop全長進行分析研究更能體現整體的變異程度。肖明松等[11]在淮河淮濱段、鳳臺段、蚌埠段、洪澤湖段采集84尾野生烏鱧（Ophicephalusargus）進行種群資源的研究，分析發現33個單倍型，檢測了單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（Pi）、遺傳分化指數（Fst）、遺傳距離以及中性檢驗、錯配分析和NJ樹，發現其h和Pi較高，表明種群平均多態性相對較好；但在遺傳距離的分析中發現所有群體的差異都較小，這可能是由于在淮河流域中不同支流的種群交流程度較高造成的，所以變異發生在種內，而種群之間的分化較少。董志國等[12]對大連、東營、連云港、舟山、湛江和漳州6個地區的野生三疣梭子蟹（Portunustritubercatus）進行D-loop全基因組區的遺傳多樣性及群體遺傳結構的分析，選擇單倍型多樣性和核苷酸多樣性作為重要指標，并加入了群體遺傳分化指數的分析，進行Tajima’sD中性檢驗和單倍型間的分子變異分析，發現不同地區梭子蟹的遺傳多樣性很高，產生一定的遺傳分化；不過在系統發育關系分析中，地理距離對遺傳距離沒有顯著的關系，原因仍需要進一步研究。趙良杰等[13]在千島湖汾口、富文、臨岐3個大眼華鳊（Sinibramamacrops）主要繁殖區域采集了115尾個體，對樣品進行了形態學和D-loop序列測定后，分析形態主成分和各個基因遺傳學分析指標，發現千島湖各地的大眼華鳊之間有豐富的基因交流，并沒有形成容易滅絕的小種群，表明各個地理群體仍然有豐富的遺傳多樣性，面對一定的災害時有一定的彈性，不過這樣的良好狀況仍然需要政府和漁民對該區域的種質資源進行保護。高志遠等[14]對海南松濤水庫南豐鎮、番加鄉、白沙群體的長臀鮠（Cranoglanisbouderius）的D-loop序列全場進行分析，44尾個體中發現11個單倍型，但在分析中發現單倍型較高，而核苷酸多樣性較低，認為是由于海南島偏僻的地理位置難與大陸長臀鮠進行基因交流，推斷在歷史中可能出現過嚴重的瓶頸效應；中性檢測也表明沒有任何整體或局部的種群擴張，數據皆表明該地域長臀鮠正處在較危險的境地，需要進行種群的保護措施。

1.2養殖群體遺傳多樣性分析目前，國內對水產動物養殖過程中出現的生長不良與病害頻繁大多歸結于飼料與環境的問題。誠然，營養和免疫是養殖的關鍵，但是由于人工育種和繁育雜交造成的種質資源下降也是重要因素之一。養殖戶往往在育種過程中，沒有考慮到育種群體的遺傳狀況，導致近親雜交，子代產生各種問題。徐鋼春等[15]對灌江納苗養殖刀鱭（Coilianasus）的子三代品種與在淡水生活環境下湖鱭（C.nasustaihuensis）兩個群體的遺傳多樣性進行了比較和分析，進行單倍型和核苷酸分析后，發現養殖刀鱭的遺傳多樣性要優于湖鱭，這可能是由于刀鱭僅是子三代，還未經歷大量的人工繁殖和育種，保留了較好的遺傳狀況；而湖鱭由于其陸封型的特點，導致其種質資源漸漸下降，需要進行放流等活動保證種質資源。姚茜等[16]對來自浙江湖州某公司的養殖群體、緬甸引進的群體和兩者雜交的“南太湖1號”群體的羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）的D-loop區進行分析，共16尾群體分析得到14個單倍型，結果表明緬甸引進的群體核苷酸多樣性最高，浙江湖州人工養殖群體的多樣性最低，說明人工育種對遺傳多樣性有較大的影響。通過遺傳距離和遺傳分化指數分析發現，雜交群體更加偏向本地種群。在今后的育種工作中，可在雜交代中選取優秀性狀的沼蝦，與緬甸種群雜交，以獲得更優秀的品種，為今后的人工繁育打下基礎。李勝杰等[17]將珠江水產研究所養殖品種大口黑鱸（Micropterussalmoides）與北方和佛羅里達兩個野生群體進行D-loop區的遺傳分析，在23尾采集的樣品中，5尾個體含有兩種單倍型，北方11尾個體發現9種單倍型，而佛羅里達僅有1種單倍型。在遺傳距離分析上發現，珠江水產研究所的養殖群體與北方群體更加接近。對于單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析，結果表明養殖群體與國外種群相比，其遺傳多樣性處于較低水平，需要開展種質的保護工作，應引入國外品種進行雜交，改善國內養殖群體的遺傳結構，提高遺傳多樣性，豐富大口黑鱸的種質資源。

1.3親緣與起源分析D-loop區串聯重復的現象雖然豐富，但是不同動物的重復位置不一致，重復的序列和重復的單元也不一致，所以相近物種之間對比分析有助于明確不同物種的關系。郝君等[18]對烏克蘭鱗鯉（Cyprinuscarpio）、鯽（Carassisauratus）、鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）、鳙（Aristichthysnobilis）、草魚（Ctenopharyngodonidellus）和烏蘇里擬鲿（Pseudobagrusussuriensis）6種不同魚的線粒體D-loop區進行測序，分析了種內、種間遺傳結構差異，發現作為分子標記對系統分化效果的差異，6種不同魚的堿基含量、堿基差異、遺傳距離和系統發育都有顯著的差異，構建的D-loop序列的NJ系統樹展示了6種魚的分類地位，肯定了D-loop區比鄰近區段的tRNA和12sRNA在魚類識別、分類、種類鑒定和遺傳多樣性分析上更加可靠。侯新遠等[19]對5種蝦虎魚類進行了系統進化關系的研究，分析了河川沙塘鱧（Odontobutispotamophila）、鴨綠沙塘鱧（O.yaluensis）、中華沙塘鱧（O.sinensis）、葛氏鱸塘鱧（Perccottusglenii）及尖頭塘鱧（Eleotrisoxycephala）這6種蝦虎魚類同源長度約為830bp的D-loop序列，通過系統發育樹和遺傳距離分析，得到6種魚類的親緣關系即河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、平頭沙塘鱧聚為一支，尖頭塘鱧、葛氏鱸塘鱧和褐塘鱧等聚為另一支，為魚類資源的分類和利用提供了基礎。馬波等[20]在額爾齊斯河采集了兩種類型的銀鯽（C.auratusgibelio），對幾種鯽魚的可量性狀和D-loop區進行分析，得到了優勢種群的生長性狀，確定了它們的遺傳學特征和分類學地位，同時通過D-loop區的單倍型共享率研究了兩種鯽的起源和遺傳特征，這些結果對我國將來進行銀鯽育種有很大幫助。Klaus等[21]利用D-loop序列對歐洲鯉魚（C.carpio）137的起源進行研究。在此之前對于歐洲鯉魚也有過很多關于起源的研究：Zhou等[22]發現一些歐洲養殖的鯉魚起源可能在德國和歐洲，而俄羅斯主要養殖的鯉魚起源在亞洲。Zhou等[23]在德國鏡鯉和伏爾加河的野生鯽魚利用D-loop區全序列獲得獨特的3種單倍型；而Mabuchi等[24]在日本鯉魚中發現有兩個D-loop區單倍型與Zhou等報道的歐洲發現的單倍型非常相似。Klaus等[21]的研究結果指出歐洲和中亞所有的鯉魚品種有一個共同的祖先，而且有可能是在后冰河時期傳播到中亞或者歐洲。對于這種現象，可能是由于在育種過程中，沒有進行規范的養殖記錄，導致各種群出現雜交現象。而且，養殖戶挑選具有優勢性狀的品種進行交配，容易導致其他稀有單倍型的消失，從而使得種質資源慢慢下降。

1.4個體內異質性分析同一個體內存在多種重復序列數目不同從而表現為異質。高祥剛等[25]采用克隆技術，在我國海域隨機采集了3頭斑海豹（Phocalargha），每尾個體任選14個克隆菌，對它們的線粒體DNAD-loop區的終止序列區進行擴增測序，發現其個體內存在多種不同的串聯重復單位，即存在異質現象，說明我國的斑海豹種質資源保護較好，進化狀態比較積極。張四明等[26]在野生的中華鱘種群種間和個體體內檢測線粒體DNA的長度變異情況，發現中華鱘有較多個體的異質性，表現出良好的遺傳多樣性。由此可見，個體的異質存在是導致線粒體DNA中控制區D-loop長度變化的主要原因，而個體的線粒體DNA長度異質性是直接推動動物物種遺傳多樣性的重要途徑。綜上所述，可以發現線粒體D-loop區的序列分析已經在水產行業取得大量進展，D-loop區基因的插入、突變和替換都是影響多樣性的關鍵，而個體內的異質和串聯重復的高頻率變化不僅存在于水產動物個體中，也存在于種群內，甚至在不同物種之間都對野生水產動物的起源、親緣關系、遺傳多樣性、遺傳結構和動物進化程度起著重要的作用。在養殖群體中，D-loop區的分析正在漸漸起到重要的作用，若結合微衛星、RFLP等其他分子標記技術，將來對人工育種和對親魚、親蝦的選育工作有重大意義。

2細胞色素b序列（cytb）

線粒體DNA中編碼蛋白質的基因有還原型輔酶I的亞基、ATP合成酶的亞基、細胞色素c氧化酶的3個亞基和細胞色素b[27]。Zardoya等[28]研究認為，cytb的進化速度適中，適合進行種內和種間的遺傳分析。現今利用cytb序列多數用于種內和種間的遺傳分化分析、遺傳圖譜建立和遺傳多樣性調查，并輔以其他標記技術進行組合分析。王曉梅等[29]獲取中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)cytb序列的PCR產物后，利用DGGE技術分析了溫州、儀征、江都、南京、盤錦和合浦地區的中華絨螯蟹的遺傳多樣性，并與合浦絨螯蟹(E.japonicahepuensis)對比，發現中華絨螯蟹與合浦絨螯蟹遺傳距離較大，在親緣關系上具有顯著的差異，但是仍有部分遺傳標記相同，說明存在一定的基因交流。

黃小彧等[30]利用cytb序列檢測了長江支流貴定與干流合江和宜都的中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)群體的遺傳多樣性，分析群體的遺傳距離，結合地理因素分析了該物種的種質資源現狀，發現合江的遺傳多樣性最好，而支流群體與干流群體的遺傳分化較大，地理隔離使同一物種的基因交流程度降低。夏月恒等[31]利用cytb序列對中國近海3個地區的鮸魚（Miichthysmiiuy）的遺傳多樣性進行分析，通過對地理環境和歷史因素的解釋，認為中國鮸魚基因型的單倍型多樣性高和核苷酸多樣性低可能是因為種群在某個時期突然擴張，使單倍型突變大量產生，但這段時間對于提高核苷酸多樣性時間不足，所以產生了如此差別；且Fst結果極低，說明該地區遺傳分化程度很低，加上不同地理的單倍型網絡圖交錯呈現，有可能是因為種群由于擴張之后還未達到平衡，需要對該地區進行保護。鐘立強等[32]調查了長江中下游5個湖泊的黃顙魚，利用cytb序列分析了不同地區遺傳多樣性和遺傳分化的程度，60尾個體檢測出37個單倍型，Fst分析顯示這5個種群的變異大部分都來自群體內，說明各個種群間有一定的基因交流，系統樹顯示它們沒有分化成譜系。司從利等[33]從長江貴定和樂山兩個群體的泉水魚cytb序列分析其遺傳狀況、結構和多樣性程度，發現這兩個群體由于三峽大壩的地理因素，已明顯受到嚴重的影響，出現高度的遺傳分化，建議對該物種進行分區保護，提高遺傳多樣性，豐富種質資源。

司從利等[34]在廣東、廣西等地基于cytb序列分析了華南居氏銀魚（Salanxcuvieri）的遺傳現狀，從鄰接樹上可發現有一定的分支，認為地理因素正在逐漸影響遺傳結構，推測瓊州海峽的地理位置可能影響廣東、廣西種群間的遺傳交流；中性檢測結果表明在更新世晚期發生擴增，地球當時的氣候影響了該種群的遺傳多樣性；根據現狀，建議分地區對該種群進行人為保護，避免出現種質退化。李偉文等[35]兩年中在7個遠洋捕撈點采集了黃鰭金槍魚（Thunnusalbacares），擴增了cytb部分序列得到663bp，108尾個體僅有24個單倍型，且單倍型多樣性和核苷酸多樣性都處于較低水平，群體的遺傳多樣性較差；Fst分析得到變異大多發生在群體內部，表明其遺傳分化程度較低，并且基因交流非常強烈，種質資源正在衰退，這與人類破壞環境和大面積捕殺有密切關系。謝楠等[36]利用cytb對魴屬（Megalobrama）4種魚類及長春鳊（Parabramispekinensis）進行了系統分類。但在結果分析過程中僅靠cytb的信息難以準確將不同品種進行區分，仍需要配合其他標記進一步研究。

3其他標記與組合分析

16SrRNA序列、12SrRNA序列和COI序列在線粒體基因組中變異速度較慢，保守性較高，因此很難由其單獨作為驗證工具來進行遺傳分析，往往需要結合其他的基因片段，才能同時作為鑒定種內親緣關系和物種遺傳多樣性程度的工具。劉萍等[37]選取了山東青島中華虎頭蟹（Orithyiasinica）野生群體的16SrRNA和COI基因片段研究其遺傳多樣性，但是發現16SrRNA變異程度較小，效果不佳；在遺傳距離和系統進化研究中，兩種技術檢測了不同蟹之間的親緣關系以及它們的進化分化時間，利用NJ系統進化樹發現中華虎頭蟹與梭子蟹類的親緣關系最近，并采用“分子鐘”對4個蟹類的分化時間進行計算。吳玲等[38]對沿海6個群體的白氏文昌魚（Branchiostomabelcheri）和日本文昌魚（B.japonicum）分別進行COI和16SrRNA序列的研究，發現兩種魚種內遺傳多樣性較高，但還沒有明顯的遺傳分化；其中茂名群體和威海群體具有最高的核苷酸多樣性，很有可能為這兩類魚的祖先。

翁朝紅等[39]對近江蟶（Sinonovacularivularis）、縊蟶（S.constricta）、小刀蟶（Cultellusattenuatus）、尖刀蟶（C.scalprum）和大竹蟶（Solengrandis）的COI和16SrRNA部分序列進行測序和分析，在進行遺傳距離和系統演化分析后，結果表明近江蟶已進化至獨立為一個種，并且通過聚類分析推斷近江蟶應歸屬于竹蟶超科，解決了這幾種蟶分類歸屬。郁建鋒等[40]結合12SrRNA和16SrRNA的序列為太湖流域河川沙塘鱧的分類提供了重要的幫助，發現了大量的變異位點和簡約位點，而且在兩種標記的驗證下，比較得出太湖流域河川沙塘鱧與福建流域河川沙塘鱧已經存在一定的遺傳差異。同時，系統發育樹分析表明，太湖流域河川沙塘鱧與其他鱧已存在遺傳分化差異。王慶容等[41]對長江中上游舞陽河、烏江、雅礱江、岷江和金沙江5個野生鲇(Silurusasotus)群體的親緣關系和遺傳差異進行了分析，對比了核苷酸和單倍型多樣性，發現舞陽群體與其他群體的親緣關系較遠。楊慧榮等[42]同時利用D-loop和cytb的序列對長江水系的赤眼鱒（Squoliobarbuscurriculus）進行了遺傳多樣性的分析，通過遺傳變異率、單倍型多樣性等指標發現長江赤眼鱒遺傳多樣性較高，種質狀況較好；同時，根據Fst和分子變異等級差異分析發現，不同水系的群體存在明顯的遺傳分化；系統發育樹證明了珠江水系赤眼鱒與長江水系赤眼鱒正在逐漸分化為兩類群體，并提出cytb序列在變異顯著的群體間更能發揮作用。

孫希福等[43]利用cytb序列和D-loop序列分析了江豚（Neophocaenaphocaenoides）在鼠豚類及一角鯨類的分類地位，系統發育樹表明，江豚的遺傳距離與一角鯨科較為接近，并確定棘鰭鼠海豚、太平洋鼠海豚及黑眶鼠海豚3種群有較近的親緣關系，否定了之前僅憑借形態學的分類方式。畢瀟瀟等[44]在某一水產品公司采集了來自美國與荷蘭的狹鱈（Theragrachalcogramma）、太平洋鱈（Gadusmacrocephalus）、藍鱈（Micromesistiuspoutassou）和遠東寬突鱈（Eleginusgracilis）4種不同屬的鱈魚，利用16SrRNA、cytb和COI序列比較了它們的序列結構，根據核苷酸分歧速率以及NJ系統發育樹，將太平洋鱈、狹鱈和寬突鱈歸為一支，也顯示了它們較接近的遺傳距離，給分類學提供了非常重要的理論基礎。

4展望

線粒體分子標記技術主要用于物種的遺傳多樣性分析、親緣、親權分析和物種進化程度分析。該基因組功能重要且能穩定遺傳，是物種個體基因組中變化速度較快且保留較好的部分。對D-loop區的序列進行測序、比對、計算和分析后能得到物種的種屬分類、遺傳結構、歷史發育情況和遺傳多樣性狀態。而且，D-loop區穩定的母系遺傳，使得分析起源有較好可靠性，聚類分析結果準確。同時，細胞色素b和16SrRNA等序列雖然進化速度較慢，但其穩定性的特征可以得到較好保留，獲得的插入、替換和缺失等突變可以持續遺傳，以作為數據分析的可靠依據。在進行不同情況的分析時，可以結合一到兩種分子標記技術，作為重要的輔助參考標記。

綜上，在水產行業的遺傳分析中，野生群體的遺傳多樣性是將來進行育種和引進的關鍵，通過線粒體分子標記技術對野生經濟水產動物的遺傳結構和遺傳多樣性分析是高效、準確和可靠的。其中單倍型多樣性和核苷酸多樣性表現了分子結構的變異程度，體現了野生群體種質資源的現狀；遺傳分化特征能表現群體的基因交流狀況，表明了群體間自由交配的自由度；分子變異等級分析可以讓我們了解不同地域群體突變的來源，表現了群體遺傳結構的差異；中性檢測等分析從分子層面揭示了魚類的系統發育狀況。

不同的分析方式闡述了水產動物的生長和生存狀況。而養殖群體的種質資源是育種和繁殖的關鍵，通過線粒體標記技術的分析，可以更加準確地了解群體結構和親緣關系，避免近親雜交導致苗種退化，給養殖帶來較大的便利。水產行業中，養殖群體規模較大，可以利用不同的分子標記技術的特點，結合地理分布、分化程度和表觀特征，來幫助水產行業進行選育和養殖工作，獲得對實際生產有最大利用價值的結果。

作者：楊子拓劉麗單位：華南農業大學動物科學學院