自生固氮菌的隔離鑒別

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摘要：從非豆科作物根際土壤中分離篩選得到213個在無氮培養基上能良好生長的菌株，通過酶活測定，從中篩選得到18株固氮能力較強的菌株，并對其中酶活最高的4株菌株進行了鑒定，結果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。利用它們可望制成適合于不同農作物生長的生物復合肥。

關鍵詞：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料

0引言

微生物肥料的一些作用和生態效益是化學肥料所不具備的[1]，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生長和抑制有害微生物的活動，從而達到增產的目的[2]。此外，生產微生物肥料投資少，可利用農副產品就地取材。因而，微生物肥料的生產吸引了許多研究者的興趣。本文報道從水稻、小麥、玉米和蔬菜等非豆科作物根際土壤中分離得到18株固氮能力較高的自生固氮菌，并對其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株進行了分類鑒定，結果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。

1材料和方法

1.1菌種

采集水稻、小麥、玉米和蔬菜等農作物的根際土壤土樣56個，從中分離獲得213株在無氮培養基上能良好生長的菌株。

1.2分離培養基及分離方法

1.2.1富集培養基

蔗糖15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，碳酸鈣1g，質量分數為10%的鉬酸鈉、硼酸、硫酸錳、硫酸亞鐵(現配)水溶液各1mL，水1000mL，pH為6.5～7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分裝30mL，滅菌備用。

1.2.2富集培養方法

取3～5g土樣用50mL水制成混濁液，吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL富集培養液的250mL三角瓶中，100rpm，28℃，培養3～5天后，換新鮮培養基繼續培養，重復4～5次后，稀釋分離。

1.2.3平板分離培養基

在富集培養基中加入2%瓊脂制成平板分離培養基，滅菌后，倒入無菌培養皿中備用。

1.2.4分離方法

取富集培養后的培養液，稀釋涂布平板分離培養基。28℃培養2天后，將在稀釋度較大的平板上，生長較大的菌落移入斜面。培養后，保藏備用。

1.3固氮酶活性測定

1.3.1氣相色譜法

參考文獻[3]的方法，略加改變，將2mL乙炔氣體沖入試管斜面內，塞上無菌橡皮塞，28℃，培養24h后，用氣相色譜儀測量固氮酶的活性，每種取4～5個重復，進樣量100μL，按以下公式進行計算酶活。

EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

(μmol/h(斜面))

Se：乙烯峰面積;T：開氏絕對溫度(T=273.13K)

Pe：實驗條件下的大氣壓強(Pa);

Sb：乙炔峰面積;Te：實驗條件下的溫度(K);

P：絕對大氣壓強(P=101324.72Pa);

t=培養時間(t=24h)

1.3.2微量凱氏定氮法[4]用以下公式計算含氮量：

EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)

V1：樣品滴定時用去的0.01N標準硫酸溶液毫升數;

V2：空白滴定時用去的0.01N標準硫酸溶液毫升數;

14：是1個毫克當量氮的毫克數;

V：發酵液樣品毫升數。

2結果和討論

2.1分離結果

從非豆科作物根際土壤中分離得到213個菌株，用氣相色譜法和微量凱氏定氮法測定它們的固氮酶活性。結果發現，34株沒有固氮能力(含氮量<1mg/L)，161株有固氮能力(含氮量1～10mg/mL)，18株固氮能力較強(含氮量>10mg/mL)，其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌產酶能力最高。表1對固氮能力較強的18株菌株的酶活測定結果進行了統計。

表1：固氮酶活力測定結果(18株菌株)

表1中，EA1(μmol/h斜面)是用氣相色譜法測定各菌株的試管斜面的固氮酶活性值。按以下公式計算：EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

雖然理論上，在固定條件下，乙炔還原活性與固氮酶對氮氣的固定活性呈正相關，但在實際實驗過程中，會由于斜面的新鮮程度，斜面培養基中的某些組成等原因，而影響實驗結果的準確性，所以，每種菌都取5支對數生長期的斜面做重復試驗，以盡量減少誤差。EA2(mg/L)是將菌株接種到無氮培養液中，28℃，100rpm培養7天后，用微量凱氏定氮法測定最終發酵液的含氮量。按以下公式計算：EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)經回歸分析[6]，EA1與EA2呈強正直線相關(相關系數r=0.9527)，回歸方程為EA2=7.9560+0.5016×EA1，其結果與文獻[3]的有關報道相似。

2.2鑒定結果

2.2.1形態特征見表2所示。

表2形態特征

2.2.2生理生化特征見表3所示。

表3生理生化特征

表4褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷單孢菌模式種的特征[5]

2.2.3命名

根據以上形態和生理生化特征，參照[伯杰細菌鑒定手冊](表4、表5列出了其中有關模式種的鑒別特征)，將以上四株菌命名如下：

am65：與固氮菌科，氮單胞菌屬的敏捷單胞菌相近，但甘露醇發酵及淀粉分解試驗與模式種不同，暫定名為氮單胞菌am65(Azomonassp.am65)。

bn72：與固氮菌科，固氮菌屬的褐球固氮菌相同，定名為褐球固氮菌bn72(Azotobacterchroococ-cumbn72)。

cx58：為固氮菌科，拜葉林氏菌屬。兼有弗來明拜葉林氏菌和運動拜葉林氏菌的部分特征，其種的特征還有待于進一步鑒定，暫定名為拜葉林氏菌cx58(Beijerinckiasp.cx58)。

dy82：與固氮菌科，固氮菌屬，拜氏固氮菌相同，定名為拜氏固氮菌dy82(Azotobacterbeijerinckiidy82)。

表5拜葉林氏菌屬內運動拜葉林氏菌和弗來明拜葉林氏菌的特征[5]

注：+：少數細胞，絕大多數在幼齡時期;*：數字是代表在培養基上生長的菌株的百分數;

+(-)：大約所測定菌株的40%～50%為陽性;++：生長好;-/W：反應陰性或弱。

參考文獻：

[1]陳廷偉,葛誠.我國微生物肥料發展趨向[J].土壤肥料,1995,(6):16～20.

[2]李元芳.有效活菌數的測定方法允許差與判定[J].土壤肥料,1997,(4):43～44.

[3]程萍.固氮菌肥料生產菌株的酶活性測定[J].土壤肥料,1995,(1):44～46.

[4]無錫輕工業學院等合編.食品分析[M].北京:輕工業出版社,1991.216～219.

[5]布坎南RE,吉本斯NE等.伯杰細菌鑒定手冊[M].第八版.北京:科學出版社,1984.12.

[6]潘維棟.數據統計方法[M].上海:教育出版社,1984.8.