油茶籽殼研究

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摘要：研究油茶籽殼中總黃酮類物質的提取工藝，探討影響提取率的主要因素，通過正交試驗確定最佳提取工藝。通過DPPH法﹑FRAP法﹑·OH清除能力3個體系對不同溶劑提取物的體外抗氧化能力進行研究。試驗結果表明：在30倍樣重的60%乙醇中浸泡后，40℃下超聲波輔助萃取45min，油茶籽殼中的總黃酮提取率為1.71%。此外，不同溶劑提取物中黃酮提取率差異很大。在DPPH體系中，油茶籽殼60%乙醇提取物的IC50為781μg/mL，清除能力強于其它溶劑提取物與對照品竹葉提取物（IC50為1025μg/mL，主要成分為竹葉黃酮）（P<0.05）；60%乙醇提取物的FRAP值為1.79mmol/L，顯示出與竹葉提取物相當的還原能力；在清除羥自由基（·OH）體系中，樣品質量濃度為500μg/mL時，乙醇提取物的清除效果與竹葉提取物相當；當樣品質量濃度為1000μg/mL時，乙醇提取物的清除效果稍弱于竹葉提取物。

關鍵詞:油茶籽殼；總黃酮；提取溶劑；抗氧化

油茶（camelliaoleifera）是我國特有的木本食用油料樹種[1]，其果實油茶籽生長周期長，從開花到采摘，歷經冬﹑春﹑夏﹑秋四季，民間素有“抱子懷胎”之稱。茶果中，茶蒲占60.0%~61.3%，茶籽占38.7%~40%，茶籽中殼占30.6%~34%，茶仁占66.0%~69.4%。我國油茶資源十分豐富，據統計，全國有油茶36.67萬hm2（5500萬畝）[2]，每年產油150萬t，這將帶來1000多萬t的油茶籽殼。如此龐大的數量的副產物，若能加以有效利用，將能產生巨大的經濟效益。國外曾有從油茶籽油不皂化物中分離三萜醇以及從茶籽餅中分離黃酮和黃酮醇苷[3]的報道。國內有油茶總皂苷具有抗氧化及清除自由基的能力[4]以及茶籽毛油中存在極性抗氧化物質[5]的報道，但從油茶籽殼中提取黃酮并對其進行抗氧化研究截至發稿前未見報道。黃酮類化合物是一類在植物界廣泛分布的多酚類天然產物。有研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抗心腦血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫調節等多種生理功能及藥理作用，其提取物已用于食品、藥品、化妝品等中[6]。因此開發利用油茶殼中的黃酮類化合物具有重要的現實意義。為了利用油茶殼中的黃酮類物質，本文借助超聲波輔助萃取油茶籽殼總黃酮，通過1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH·）法﹑鐵離子還原法（FRAP）與羥自由基（·OH）清除能力3個反應體系來評價其抗氧化能力，為油茶籽殼中有效成分的開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料油茶籽，2006年11月份采購。將油茶籽敲碎，分離的油茶殼曬干，用粉碎機粉碎，過40目篩。

蘆丁標準品，中國醫藥上海化學試劑公司；竹葉提取物（黃酮含量：32%），浙江安吉圣氏生物制品有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）（DPPH）；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純試劑。

1.2儀器

7530G分光光度計，惠普上海分析儀器公司出品；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司出品；電動粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司出品。

1.3試驗方法1.3.1油茶籽殼總黃酮的工藝流程及乙醇提取優化油茶籽殼總黃酮工藝流程：油茶籽殼→曬干→粉碎→溶劑浸泡→超聲波輔助萃取→抽濾→定容→定量分析。

準確稱取1.0g油茶籽殼粉于50mL三角燒瓶中，加入一定量的乙醇，在一定溫度下超聲波提取一定時間，趁熱減壓抽濾，用相應濃度的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，即為待測液。

1.3.2油茶籽殼總黃酮的分級提取選用極性由弱到強的4種溶劑———石油醚、純乙醇、60%乙醇、水，分別提取油茶籽殼中的總黃酮。具體操作：準確稱取8.0g油茶殼粉于500mL三角瓶中，按物料比1：30加入提取溶劑，50℃下超聲波提取45min，趁熱減壓抽濾，用相應濃度的溶液定容于300mL容量瓶中，即為待測液。

1.3.3總黃酮標準溶液的制備和標準曲線繪制以五氧化二磷為干燥劑，減壓干燥（60℃，0.09MPa）至恒重的蘆丁標準品0.077g，用60%乙醇溶解，定容至250mL，搖勻，得0.2926mg/mL的標準液，放入低溫暗箱內，及時檢測。分別吸取標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中，用60%乙醇添至10mL，加入5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液1.0mL，6min后加入4%NaOH溶液10mL，混勻，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min后，在波長510nm處測定吸光度A，得蘆丁含量y（mg/mL）與吸光度A之間的回歸方程為：y=0.113A+0.0016（R2=0.9993）。

1.3.4提取物總黃酮的測定取本文1.3.2節中待測液1mL于25mL容量瓶中，其它操作同1.3.3節，測定其在510nm處的吸光度A。由回歸方程計算黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）=[黃酮類化合物質量（g）/原料質量（g）]×100%得率（%）=[提取物質量（g）/原料質量（g）]×100%提取物干基黃酮含量（%）=[黃酮類化合物質量（g）/提取物質量（g）]×100%1.3.5抗氧化能力的測定方法1.3.5.1清除DPPH·活性的研究[7－8]準確稱取DPPH·2.5mg，用甲醇定容到100mL，使用時稀釋為不同濃度，測定515nm波長處的吸光度，制作標準曲線。DPPH·殘留率的計算公式：[DPPH·]REM=[DPPH·]T／[DPPH·]T=0×100%式中，[DPPH·]REM———DPPH·殘留率（%）；[DPPH·]T———為自由基清除過程中某一時刻DPPH·的質量濃度（μg/mL）；[DPPH·]T=0———DPPH·的原始質量濃度（μg/mL）。

1.3.5.2FRAP法測定提取物的抗氧化活性參照Benzie與Strain的方法[8]。操作步驟：取適量提取物溶液，加入1.8mLTPTZ工作液（由0.3mol／L醋酸鹽緩沖液25mL、10mmol／LTPTZ溶液2.5mL、20mmol／LFeCl3溶液2.5mL組成），混勻后37℃反應10min，測定波長593nm處溶液的吸光度。由吸光度的大小判斷溶液的還原能力。試樣還原活性（FRAP值）以達到同樣吸光度所需FeSO4的毫摩爾數表示。FRAP值越大，表明樣品的還原能力越強，即抗氧化活性越強。

1.3.5.3清除羥基自由基（·OH）試驗[9]反應體系：1mL8.8mmol／LH2O2、1mL9mmol／LFeS-O4、1mL9mmol／L水楊酸-乙醇、各種濃度的油茶籽殼提取物溶液1mL。在反應體系中加入H2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水為參比，在波長510nm處測定各濃度的吸光度。考慮到油茶籽殼提取物溶液本身的吸光值，以1mL9mmol／LFeSO4、1mL9mmol／L水楊酸-乙醇、1mL不同濃度的油茶籽殼提取物溶液和1mL蒸餾水作為油茶籽殼提取物溶液的本底吸收值。清除率計算公式：清除率（%）=[AO-（AX-A′O）]／AO×100式中：AO———空白對照液的吸光度；Ax———加入油茶籽殼提取物溶液后的吸光度；A′O———不加顯色劑H2O2油茶籽殼提取物溶液本底的吸光度。

2結果與分析

2.1油茶籽殼總黃酮最佳提取工藝參數的優化在單因素試驗基礎上，對影響油茶殼總黃酮提取率的因素：乙醇濃度、料液比、超聲波提取溫度、提取時間做L9（34）正交試驗，研究油茶籽殼總黃酮提取工藝。

表2中的數據表明，各因素對總黃酮提取效果影響順序依次為乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。通過正交試驗、方差分析及各個處理間差異顯著性檢驗，4種因素的最佳組合為A2B3C1D3，即60%乙醇，溫度40℃，料液比1：30，超聲波提取45min。在此條件下測得油茶殼中總黃酮的提取率為1.71%。

2.2油茶籽殼不同溶劑提取物中的總黃酮提取率從表3可以看出，不同溶劑提取的總黃酮含量差異很大。對于油茶殼，采用60%乙醇提取的黃酮提取率為1.60%，其次是水提取液、乙醇提取液和石油醚提取液。采用石油醚提取的黃酮提取率僅為0.23%，約為60%乙醇提取液的1/7。此外，60%乙醇提取物干基黃酮含量為42%，顯著高于其它溶劑的提取物（P<0.05）。

2.3清除DPPH·活性的研究2.3.1標準曲線及回歸方程按照本文1.3.5.1節中測定方法配制不同梯度濃度的DPPH·溶液，于波長515nm處測定吸光值。以吸光度（A）對質量濃度（c）制作DPPH·標準曲線，計算出回歸方程A=0.025c+0.0009，相關系數R2=0.9998。

2.3.2不同提取物清除DPPH·能力比較從圖1～圖5可見，對于油茶籽殼的各提取物而言，隨著提取物濃度的增加，DPPH·殘留率明顯降低。其中石油醚提取物與水相提取物的清除能力相對弱一些，當其質量濃度從400μg/mL升至2000μg/mL時，才逐漸顯示出一定的清除效果。60%乙醇提取物、純乙醇提取物與竹葉提取物的清除效果較好，在提取物濃度同為1200μg/mL時，DPPH·殘留率分別為26.4%、28.5%和41.7%，比石油醚與水相提取物的清除能力強很多。60%乙醇提取物與純乙醇提取物的清除能力好于對照樣品--竹葉提取物。因此油茶籽殼提取物具有良好的清除自由基能力。此外，60%乙醇提取物與乙醇提取物清除DPPH·的速度較快。在DPPH·溶液中加入乙醇提取物或60%乙醇提取物后，DPPH·殘留率在1min內迅速下降，5min左右達到穩定。此后隨著時間的延長，DPPH·殘留率變化很小。其它溶劑提取物屬于慢速抗氧化劑，添加后30min左右DPPH·殘留率才達到穩定。

2.3.3不同溶劑提取物與竹葉提取物的IC50值比較根據圖1～圖5各種抗氧化劑的自由基清除曲線（又稱抗氧化曲線），經計算得到抗氧化劑濃度與自由基殘留率關系的線性回歸方程，并由此求出半抑制濃度IC50。在200～2000μg/mL范圍，油茶籽殼的各提取物和竹葉提取物清除DPPH·自由基的能力隨其質量濃度的增加而提高。由表4可以看出，清除DPPH·能力的次序為60%乙醇提取物﹥純乙醇提取物﹥竹葉提取物﹥水提取物﹥石油醚提取物，其中60%乙醇提取物在清除DPPH·的試驗中表現出良好的效果，其IC50值為781μg/mL，低于對照竹葉提取物（1025μg/mL），且明顯低于其它各提取物（P<0.05）。此外，由于石油醚提取物溶解性的原因，其清除DPPH·的效果有待于進一步研究。

2.4鐵離子還原（FRAP法）的試驗結果2.4.1標準曲線及回歸方程配制不同濃度梯度的FeSO4待測液，于波長593nm處測定吸光值，以吸光度（A）對FeSO4濃度（c）制作DPPH·標準曲線，計算出回歸方程為A=0.0006c+0.0357，相關系數R2=0.991。

2.4.2不同溶劑提取物與竹葉提取物的抗氧化活性比較由表5可以看出，在FRAP的測試體系中，各樣品的還原活性次序為竹葉提取物﹥60%乙醇提取物﹥水提取物﹥純乙醇提取物﹥石油醚提取物。其中竹葉提取物與油茶籽殼60%乙醇提取物的還原性相當，與DPPH體系的試驗結果相同。說明極性偏大的溶劑提取物也具有一定的抗氧化效果。

2.5清除羥自由基（·OH）的試驗結果由圖6可知，油茶籽殼的各溶劑提取物與竹葉提取物對羥自由基均有一定的清除作用。樣品濃度對油茶籽殼純乙醇提取物和竹葉提取物清除羥基自由基的能力影響很大。隨濃度的升高，它們清除羥基自由基的作用增強。油茶籽殼純乙醇提取物與竹葉提取物在樣品質量濃度為500μg/mL時清除率相當，分別為39.1%和40.9%，高于油茶籽殼水提物（22.9%）（P<0.05）。這與DPPH、FRAP體系試驗結果一致。

3結論

通過單因素及正交試驗得出油茶籽殼總黃酮的最佳提取工藝條件：在30倍于樣重的60%的乙醇溶液中浸泡30min，40℃下超聲波提取45min，油茶籽殼中總黃酮類化合物提取率最高達1.71%。通過DPPH法、FRAP法與清除羥自由基3個試驗體系研究油茶籽各提取物的抗氧化性，結果表明：油茶籽殼各提取物的抗氧化能力與其濃

度相關。在3個試驗體系中油茶籽殼60%乙醇提取物、純乙醇提取物顯示出良好的抗氧化與清除自由基能力，與對照品竹葉提取物相當。因此，油茶籽殼提取物作為一種有效的自由基清除劑，具有很好的應用前景。