恒溫擴增技術的原理與用途探究

導語：恒溫擴增技術的原理與用途探究一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

即通過對靶序列的特異性擴增，使其產(chǎn)生大量拷貝，以達到檢測水平。主要包括以下技術。環(huán)介導等溫擴增技術，又稱為環(huán)媒恒溫擴增技術或連環(huán)恒溫擴增技術，是由Notomi等于2000年所開發(fā)的一種核酸擴增技術[7]。LAMP的核心是具有鏈置換活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的應用以及基于靶核酸6個特異性片段（即5’端的F1、F2和F3區(qū)和3’端的B3c、B2c和B1c區(qū)，其中F2區(qū)和B2區(qū)為目的擴增片段）的4條特殊引物的設計，分別為上游內(nèi)部引物（FIP，由F1c區(qū)和F2區(qū)組成）、下游內(nèi)部引物（BIP，由B1c區(qū)和B2區(qū)組成）、上游外部引物（F3，由F3區(qū)組成）及下游外部引物（B3，由B3組成）。整個擴增過程分為起始階段和循環(huán)擴增階段。⑴起始階段：FIP的F2序列首先和模板F2c結合，引導合成互補鏈；隨后，F(xiàn)3與模板F3c結合，在BstDNA聚合酶的作用下啟動鏈置換合成并釋放出結合有FIP的完整互補鏈。此單鏈5’端F1c和F1自我堿基配對形成環(huán)狀結構。以此鏈為模版，引物BIP和B3以相同的方式引導另一端鏈合成、鏈替換，從而形成啞鈴狀結構的單鏈。F1c末端可自發(fā)引導補齊中間單鏈缺口,使啞鈴狀單鏈轉化為雙鏈莖環(huán)結構。此產(chǎn)物可作為下一階段的起始物為LAMP基因的擴增循環(huán)提供模板。⑵循環(huán)擴增階段：引物FIP與莖環(huán)結構結合,以雙鏈中一條鏈為模板延伸,并釋放出另一條鏈,；釋出鏈游離3c端自身成環(huán),引發(fā)鏈延伸取代并釋放FIP引導合成的鏈,兩產(chǎn)物均可作為下一循環(huán)的起始物。引物BIP和FIP與上述產(chǎn)物的莖環(huán)結合重復以上延伸過程,使產(chǎn)物延長同時釋放新的鏈成環(huán)并作為新的起始物。其最終產(chǎn)物為一系列長度不同的莖環(huán)狀雙鏈DN段。LAMP靈敏度高、特異性好，且操作簡便、快速，結果易于判定，這些優(yōu)點使得該技術自成立十余年以來在病毒、細菌、寄生蟲等各類病原體的基因檢測上得到了廣泛應用。如：Suzuki、Iwata、Ihira等分別建立了巨細胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人類皰疹病毒6型（HSV6）的LAMP檢測方法[8-10]；Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分別針對肺結核分支桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌建立了LAMP檢測體系，并對其靈敏度和特異性進行了評價[11-13]；而Lin、Han等分別以弓形蟲病、四種瘧原蟲疾病為研究對象，比較了LAMP與real-timePCR、nestedPCR的檢測效能，證明LAMP技術可以作為流行區(qū)現(xiàn)場快速而簡便的疾病篩選工具[14,15]。但因建立時間較短，LAMP仍存在一些不足，其中最大的缺點就是容易出現(xiàn)假陽性。由于LAMP采用了多條引物，而且是在同一溫度條件下擴增，引物之間有可能互補而擴增出現(xiàn)非特異性條帶。此外，產(chǎn)物鑒定只針對有或無，缺乏一定的特異性。

1989年首先報道的以轉錄為基礎的和核酸擴增技術[16]。該技術從互補的靶核酸（一般為RNA）合成DNA分子開始，以新合成的cDNA為模版進行轉錄。反應體系主要涉及三種酶活性（T7RNA聚合酶、核糖核酸酶和逆轉錄酶）和兩條特異引物。整個反應過程可分為非循環(huán)相和循環(huán)相。在非循環(huán)相中，以單鏈RNA為模板，先后在逆轉錄酶、核糖核酸酶和DNA聚合酶的催化作用下，生成帶有T7RNA啟動子的雙鏈DNA（cDNA）；此雙鏈DNA在T7RNA聚合酶的催化下合成大量互補于靶序列的反義RNA，由此進入循環(huán)相。循環(huán)相中，以反義RNA為模板，經(jīng)重復循環(huán)的進行cDNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶催化轉錄，使目的RNA不斷得以擴增。TAS主要包括兩種反應體系，即依賴核酸序列的擴增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）和轉錄介導的擴增（transcriptionmediatedamplification,TMA）。前者又稱為自主序列復制系統(tǒng)（self-sustainedsequencereplication,3SR），于1990年由Guatelli等首先報道[17]；1991年，Compton對此進行了詳細描述[18]。該反應體系所涉及的三種酶為：AMVRT（鳥類成髓細胞白血病病毒逆轉錄酶）、RNaseH和T7RNA聚合酶。反映在42℃條件下，1.5h內(nèi)即可將RNA模版擴增至109~1012倍。相對于NASBA的三酶體系，TMA使用的是二酶體系，即MMRT（money鼠白血病病毒逆轉錄酶）和R7RNA聚合酶。MMRT兼具有逆轉錄酶和RNaseH的活性，因此可省略RNaseH，從而降低反映成本，且使體系更穩(wěn)定。近年來，TMA與實時熒光檢測技術相結合，出現(xiàn)了實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT），以直觀反映擴增循環(huán)情況。TAS非常適用于單鏈靶RNA的擴增，且不需RT-PCR中的RNA分離過程，從而使RNA病毒的檢測變得更加方便。Lau等人利用以NASBA為基礎的方法對包括禽流感病毒（AIV）、手足口疾病病毒（FMDV）在內(nèi)的多種動物病毒進行了檢測，證明了NASBA在動物疾病監(jiān)測中的適用性[19]；Mohammadi-Yeganeh等針對HIV-1/HCV建立了實時多重NASBA，并對該方法的分析性靈敏度和特異性以及臨床靈敏度和特異性進行了評估，得出結論：該方法可以作為HIV-1/HCV雙重感染病人篩查的廉價工具。此外，TAS在支原體、衣原體、細菌、寄生蟲等病原體的檢測中也得到了應用[20,21]。然而，TAS循環(huán)過程較為復雜，須重復加入轉錄酶和T7RNA聚合酶，因此還有待進一步改善。

SDA是1992年美國學者Walker等首次提出的基于酶促反應的DNA體外擴增技術[22]。反應體系涉及一種限制性內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對引物、dNTP及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。反應過程可分為DNA模版的制備、兩端帶有酶切位點的目的DN段的生成和SDA循環(huán)三個階段。基本原理是：引物與靶DNA序列在3’端雜交，形成兩端均為5’懸端的雙鏈。引物鏈的5’懸端含有限制酶（HincⅡ）的識別位點，外切酶缺陷的DNA聚合酶以dNTP（其中一種為-磷酸硫酸化三磷酸腺苷）為底物延伸3’端。HincⅡ限制性核酸內(nèi)切酶在半磷酸硫酸化識別位點的未保護鏈上打開缺口，而修飾的互補鏈保持完整。切口處DNA聚合酶通過延伸其3’端而替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又可作為另一反義擴增的靶源，從而實現(xiàn)目標序列的指數(shù)增長。SDA的擴增效率高，反應時間短，特異性強，不需要特殊的儀器設備。Walker等采用SDA擴增結核分枝桿菌總DNA中的一段序列，37℃2h后即可將靶序列擴增108倍[23]。然而，SDA所存在的一些缺陷，如需四條特異性引物及經(jīng)修飾的dNTP作為底物、靶序列準備復雜、產(chǎn)物不均一等，限制了該技術的應用范圍。為此，很多研究者在普通SDA的基礎上做了近一步改善。如DeanF.B和DetterJ.C等分別利用兩組特異引物和一組隨機引物建立了兩種新的鏈置換擴增技術，即等溫多重鏈替換擴增（isothermalmulti

HAD是由美國NewEnglandBiolabs的MyriamVincent等模擬動物體內(nèi)的DNA復制機制所發(fā)明的一種新的體外基因擴增技術[26]。其基本原理是：利用解旋酶打開雙鏈DNA；再依靠單鏈DNA結合蛋白（SSB）與模板結合，使模板處于單鏈狀態(tài)并保護其完整性；隨后引物與模板雜交，并在DNA聚合酶的催化下擴增；新生成的雙鏈DNA可作為底物進入下一輪的反應。與其他恒溫擴增技術相比，HAD操作過程更加簡單，且整個過程可在同一溫度下進行，可謂是真正的等溫擴增。HAD的這一優(yōu)勢表明，該技術在研發(fā)現(xiàn)場和作為基層DNA診斷工具方面具有很大潛力。在HAD的基礎上，Xu,Y等開發(fā)了一種T7復制機器(包括T7解旋酶、外切酶缺陷的T7DNA聚合酶和T7Gp2.5SSB)，從而建立了一種新的擴增方式—依賴解旋酶的環(huán)形擴增（circularhelicase-dependentamplification,cHDA），利用cHDA可以在同一溫度下同時篩選和擴增環(huán)形DNA樣本，如質(zhì)粒[27]。Tong等采用新型的恒溫熒光定量核酸擴增分析技術(HDA-TaqMan)檢測炭疽桿菌與霍亂弧菌等病原菌，提出此技術比傳統(tǒng)的PCR擴增技術具有更好的穩(wěn)定性和特異性，明顯改善了PCR技術的假陽性與假陰性的問題[28]。作為一種嶄新的恒溫核酸擴增方法，HDA目前僅處于初期階段，從敏感性、準確性和可操作性幾方面看，該方法還具有很大的發(fā)展空間。受DNA解旋酶的限制，目前主要用于擴增小片段的DNA序列，還有待于尋找更有效的解旋酶以擴大該技術的應用空間。RCA技術是借鑒自然界中環(huán)狀病原微生物DNA分子的滾環(huán)式復制方式而建立的一種核酸擴增技術，包括線性擴增和指數(shù)擴增兩種方式[29]。線性擴增是指將一條引物結合到環(huán)狀DNA上后，在DNA聚合酶的作用下延伸，產(chǎn)生大量與靶核酸互補的、含重復序列的線狀單鏈DNA。DNA的延伸可不斷進行，產(chǎn)生的DNA鏈在長度上連續(xù)分布，因此經(jīng)凝膠電泳后可見一條寬彌散帶。線性RCA用于靶核酸的擴增時，僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體，而且限于200bp以下長度的環(huán)。由于其單鏈擴增性，擴增產(chǎn)物一般可始終連接在固相支持物的引物上，非常適宜于固相形式微陣列局部特異信號的檢測。指數(shù)RCA技術，又稱之為超分支滾環(huán)擴增（hyper-branchedrollingcircleamplification,HRCA）或分支擴增（ramificationamplification,RAm）。此技術是在線性RCA的基礎上增加一條與環(huán)狀DNA序列完全一致的引物，該引物與線性RCA產(chǎn)物雜交并酶促延伸，延伸產(chǎn)物可作為第一條引物的模版進行擴增。如此一來，擴增產(chǎn)量在短時間內(nèi)成指數(shù)遞增。曹娜娜等將RAM方法與電子芯片有機結合起來，在電子芯片上進行RAM擴增，以大腸埃希菌的O157志賀毒素基因2（shigatoxin2，stx2）作為檢測靶基因，確定了該方法的可行性[30]。DeanF.B.等利用φ29DNA聚合酶和一組隨機引物，在RCA的基礎上建立了一種新的擴增技術，即多重引物滾環(huán)復制（multiply-primedrollingcircleamplification），其擴增產(chǎn)物可用于DNA測序、體外克隆、文庫建立及其他分子生物學研究，目前該技術在DNA病毒基因組學的研究上已得到了廣泛應用[31,32]。

核酸信號放大技術主要用于核酸分子不能直接擴增或核酸分子濃度過低而無法檢測的情況。目前主要包括以下技術。2.1分支DNA放大系統(tǒng)（branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA）bDNA,即分支DNA，是人工合成的帶有多個分支的DN段，其每個分支均可作為酶標位點，從而實現(xiàn)信號的放大。bDNA技術由Chrion公司的Hom、Urdea等所構建，其基本原理是：用親和素包被微孔；加入5’端標記有生物素的第一組探針（捕獲探針），該探針不僅可與微孔中的親和素結合，且與待檢靶序列上的某區(qū)域互補；然后在微孔中加入待檢靶片段，與固定于微孔中的捕獲探針結合；再加入第2組探針，該探針一段與靶片段的某一區(qū)域互補結合，另一段與bDNA的主鏈部分序列互補結合；bDNA的每一分枝上都標記堿性磷酸酶；以金剛烷（Dioxetane）作為底物，經(jīng)堿性磷酸酶作用可發(fā)射光子，由熒光分析儀檢測化學發(fā)光信號報告結果。Flagella等將bDNA技術與以液相芯片熒光微珠為基礎的平臺相結合，建立了一種高特異性的檢測方法—多重分支DNA。該方法不需經(jīng)過RNA的純化或目的片段的擴增，直接以細胞裂解物和組織勻漿為標本即可測定多重基因mRNA的表達水平。多重bDNA技術為大規(guī)模樣本特定基因表達圖譜的測定提供了強有力的工具[33]。2.2侵染探針（invader）Invader技術是美國三波技術公司所開發(fā)的一種等溫DNA和RNA定性和定量檢測方法。該技術使用一個耐熱的內(nèi)切核酸酶，根據(jù)結構特征在特異位點切割核酸分子。Invader體系包括兩個特異性寡核苷酸引物：上游引物和下游引物，又分別稱之為侵染探針和信號探針。反應過程中，上游引物全部序列和下游引物3’端均能與靶核酸雜交結合，下游引物帶有熒光標記的5’端因不能與靶核酸結合，就如同在上游引物的侵入下而形成的翼狀突出。內(nèi)切核酸酶可識別這種特定結構并將其突出的5’端剪切下來，被剪切的信號探針則與靶核酸分離。隨后新的信號探針再次與靶核酸雜交結合，而后被剪切。每個靶核酸每小時能促使釋放上千個“翼”，所釋放的5’翼在含有熒光共振能量傳遞的通用報告系統(tǒng)（FRET）中，又可作為第二次入侵的侵染探針，再次形成侵入結構從而被內(nèi)切酶識別切割，從而進一步達到信號放大的效果。切割下來的5’翼可用熒光板讀取器檢測，其熒光強度與靶分子量成正比。Invader體系無需核酸擴增即可直接從基因組DNA中檢測目的基因。該方法方便、快捷，同時具有較高靈敏度，因此可用于實時監(jiān)測。此外，因堿基錯配可抑制內(nèi)切酶的識別與剪切，所以該體系也適用于大范圍檢測基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[34]。

恒溫擴增各技術原理不同，這使得每一項技術在其發(fā)展應用過程形成了自己的特色，總結如下。盡管恒溫擴增技術各有優(yōu)缺點，且擴增方式各不行同，所需要本量、樣本處理方式等也存在很大差異，但這些特點注定恒溫技術將優(yōu)于非恒溫技術（PCR），在分子生物學發(fā)展中占有一席之地。而操作簡便、過程恒溫的本質(zhì)，使得這些技術在開發(fā)便攜式基因診斷工具方面具有很大潛力，這將極大促進和改善很多疾病的快速診斷技術和現(xiàn)場篩查現(xiàn)狀，從而為人類的健康做出巨大貢獻。

本文作者：賈利芳韓建平胡薇工作單位：中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所