IVM對鯽魚影響研究

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本文作者：彭章曉1,2江敏1吳昊1何琳1楊李1作者單位：1.上海海洋大學水產與生命學院2.上海交通大學藥學院

伊維菌素(Ivermectin，ivm)為阿維菌素的衍生物，是由鏈霉菌產生的一種大環內酯類物質，具有用量小、效果好、安全性高等特點，在農牧業中常作為抗寄生蟲劑和殺蜻劑使用。隨著水產養殖規模和密度的不斷擴大，一些寄生蟲病如鲺病、車輪蟲病、指環蟲病和異尖線蟲病等給水產養殖業造成的損失與日劇增，甚至可能危害人類健康［1］。作為一種新型、高效的魚類抗寄生蟲藥劑伊維菌素在國外水產養殖中已有一定范圍的使用。歐洲許多國家如蘇格蘭、愛爾蘭等將其添加到飼料中，用于鮭魚和海鯛養殖中的海虱防治［2－3］。我國主要將其應用于淡水魚養殖中的斜管蟲、車輪蟲病防治［4－5］。目前，有幾篇文獻報道了IVM對哺乳動物的毒性作用，如Lankas等［6］實驗表明IVM不具遺傳毒性和潛在致癌性;Abeer等［7］實驗結果顯示，當與P－糖蛋白抑制劑聯合使用時，IVM會影響雄鼠的生殖系統;Muhamad等［8］研究發現，IVM還會一定程度上影響動物的免疫力。IVM現在作為漁藥使用范圍越來越廣泛，因此除了要關注它的環境毒性外，研究它對養殖魚自身的毒性作用也是很有必要的，硬骨魚類的血腦屏障發育不完善，因此IVM較易到達魚的頭部，但目前關于IVM在魚體內的毒理學方面研究甚少。魚類的血液指標與許多因素有關，如機體的年齡、營養代謝狀況、健康狀況等。當魚體受到外界因子的影響而發生生理或病理變化時，必定會在血液指標中反映出來，因此血液指標常被用來評價魚類的營養、健康狀況及對環境的適應性，是重要的生理、病理和毒理學指標［9］。本實驗以不同給藥劑量研究了IVM對鯽(Carassiusauratus)血液成分的影響，以期評價IVM對鯽的毒性效應，為IVM的科學使用和管理提供一定的依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

鯽購自上海果園集貿市場，健康無傷病，平均體重(250±20)g。實驗前在循環水養殖箱(250cm×150cm×70cm)中暫養30d，水溫控制在(25±1)℃，增氧機充氧，投喂全價魚飼料(浙江恒興飼料有限公司)，暫養期間死亡率低于5%。

1.2儀器與試劑

實驗所用儀器:純水機(Milli－Q)、電子天平(FA2004)、超低溫冰箱(ThermoForma－700)、全血分析儀(BC－2800Vet)和生化分析儀(BS－200)等。所用藥品:IVM標準品(Sigma公司)、無水乙醇和肝素鈉均為分析純(國藥公司)、Milli－Q超純水、總蛋白(TP)測定試劑盒(雙縮脲法)、白蛋白(ALB)測定試劑盒(溴甲酚綠法)、總膽紅素(Tbil)測定試劑盒(Tb－D:重氮法)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒(紫外－乳酸脫氫酶法)、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(AMP緩沖液法)和鈣測定試劑盒(Ca－O鄰甲酚酞絡合酮終點法)，上述試劑盒均購自邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.3給藥與采樣

將實驗用鯽隨機分成A、B、C、D、E五組，每組27尾。A、B、C三組口灌給藥，給藥劑量分別為3.0、1.0、0.4mg/kg，以無水乙醇為溶劑;D組口灌與前三組等體積的無水乙醇作對照，每條鯽魚灌入的無水乙醇的量小于0.3mL;E組不做任何處理。給藥前6h禁食，給藥后6h投餌。分別在給藥后1、2、4、8、16、24、48、96、192h取樣，每個時間點每組均取3尾魚，抽取鯽血液后分成兩份，置于含少量1%肝素鈉(已風干)離心管中。一份立即進行全血分析，另一份經離心5min后分離血漿(離心力2000g)，于－80℃保存用于血液的生化分析。

1.4血樣分析

鯽經靜脈采血后立即進全血分析儀進行分析。用于生化組分分析的血漿從－80℃冰箱中取出后，在0℃的條件下解凍，將解凍后的血漿搖勻后進生化分析儀分析。

2結果

2.1IVM對鯽血細胞的影響

口灌IVM對鯽血液中紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)、紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白(HGB)等指標的影響結果見表1。組間單因素方差分析可知，實驗組鯽RBC、WBC、HGB、HCT與對照組間均無顯著性差異，而PLT則與對照組存在組間顯著性差異(P=0.043＜0.05)。雙樣本等方差t－檢驗顯示:D組和E組間無顯著性差異，D組和A、B、C組間均存在顯著性差異(P值分別為0.02、0.016和0.007，均小于0.05)，表明口灌IVM對鯽PLT數量有顯著影響。圖1顯示，不同采樣時間，給藥組鯽的PLT數量波動較大:給藥后8～16hPLT數量快速增加，16～24h數量相對穩定，24h后PLT的數量開始下降，至192hPLT值逐漸恢復到對照組水平。A(3mg/kg)組給藥16h后開始出現死魚，解剖后可見腎臟有出血跡象，這與Mladineo等［10］觀察到的IVM使海鯛腎臟點狀出血現象一致。本實驗還發現A(3mg/kg)、B(1mg/kg)組鯽食欲明顯減退，而且體色明顯深于其它組鯽。

2.2IVM對鯽血漿生化成分的影響

表2為口灌IVM后鯽血漿中鈣離子(Ca2+)、總膽紅素(Tbil)、總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和白蛋白(ALB)6種生化成分的變化。單因素方差分析顯示，Tbil、Ca2+、ALP、ALT和ALB5個指標無組間顯著性差異，而TP指標則存在組間顯著性差異(P＜0.05)。A組鯽TP濃度顯著低于對照組D和空白組E;B組鯽TP與D、E組相比雖有所下降，但并不顯著;而C組鯽的TP濃度為41.8mg/kg，與D、E組接近。表明高劑量IVM會降低鯽魚血漿TP濃度，濃度越高，這種作用越明顯;而低劑量組(0.4mg/kg)的IVM不會影響血漿TP濃度。各組鯽血漿TP含量在不同取樣時間點間則無明顯變化。

3討論

魚類血液與機體的營養、代謝及疾病有著十分密切的關系，血液指標能直接反映出魚體的生理或病理變化，因此血液指標常被用來評價魚類的健康、營養狀況及環境適應性，是非常重要的生理、病理和毒理學指標［11］。HCT、HGB和RBC是與紅細胞相關的重要參數，本試驗結果顯示IVM對鯽血液中這3項指標均無明顯影響。Katharios等［12］以0.8mg/kg的劑量，給海鯛單次腹腔注射給藥后發現:IVM會使海鯛HCT下降，對HGB和RBC無明顯影響，他們認為給藥后海鯛HCT的下降可能與溶血有關。本實驗A、B、C、D、E5組的HCT隨取樣時間都有波動，但這種波動并未呈現明顯的規律性，而且給藥組A、B、C和溶劑對照組D、空白對照組E之間的HCT也沒有顯著差異。魚血液中RBC和HGB含量與肌細胞供氧有一定關系，若血液中RBC和HGB含量下降，可能會影響肌細胞氧氣的供應，從而影響魚的運動能力。實驗組A和B中的鯽游動緩慢，身體失衡，但檢測并未發現這兩組鯽RBC和HGB含量有明顯變化。有文獻表明，IVM具有神經毒性，可引起運動失調［13］。因此我們推測高劑量組鯽游動失常很可能是由于IVM的神經毒性引起的。

PLT是血液中一種與凝血有關的有形成分，鯽血液中PLT值的正常范圍尚沒有統一標準，給藥后鯽PLT數量出現了較大波動，這一波動是否在正常范圍內目前還不清楚。但本實驗中高濃度組(3mg/kg)出現了死魚，且有腎臟出血跡象，這與PLT數量的波動之間是否存有直接關系有待深究。白細胞(WBC)的主要生理功能是參與免疫應答，在魚類疾病防治過程中發揮著重要作用。Katharios等［12］研究發現IVM能使海鯛的淋巴細胞和單核細胞數量上升，他們認為這是海鯛對IVM的一種免疫應激反應。但本實驗條件下未發現IVM對鯽總白細胞數有明顯影響。

Tbil、ALB、ALP和ALT主要是反映機體肝胰臟功能的血清指標。研究表明，本實驗條件下給藥組的Tbil、ALB、ALP和ALT濃度和對照組并無顯著差異，說明這種藥物對鯽肝胰臟并未產生明顯的生理毒性。血漿中總蛋白(TP)濃度反應了機體的營養健康狀況，魚體生病、受傷和饑餓都會導致TP濃度下降，章龍珍等［14］研究發現，全光照和全避光條件下中華鱘幼魚血漿TP含量均顯著低于自然光照組。血漿TP濃度的下降可能是TP合成減少或消耗增加。肝胰臟是血漿蛋白質合成的主要場所，肝胰臟損傷或營養不良都會導致蛋白質合成受阻，但從ALB、ALT、ALP、Tbil指標來看，IVM對鯽肝胰臟并無明顯損傷。實驗中發現A、B組鯽會出現食欲不振、身體失衡、游動緩慢等現象。食欲不振會導致鯽營養不良，同時病理狀態下鯽魚蛋白質消耗會增加，因此鯽血漿中TP濃度的下降可能是由這兩方面因素共同作用的結果。

因此，建議在實際養殖生產中，IVM施藥劑量盡量小于0.4mg/kg，盡管此劑量仍在一定時間段內影響鯽血液中血小板的數量，但4d后可恢復至正常水平，且對鯽其他血液指標并無明顯影響，相對安全。