GTP環化水解酶研究論文

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GCH1基因即指導合成gtp環化水解酶1的基因，GTP環化水解酶1不僅是GTP合成四氫生物蝶呤（BH4）途徑中的起始酶，還是它的限速酶。BH4是芳香族氨基酸羥化酶的必須輔助因子，參與他們的活性調節論文。因此，GCH1基因的缺陷以及突變將影響BH4的生物合成從而影響生物體內一系列的生理病理現象，本文僅就GTP環化水解酶1（GCH1）基因與四氫生物蝶呤BH4代謝異常性疾病研究進展進行簡單介紹。

1.四氫生物蝶呤(BH4)的生物合成與調節

1.1四氫生物蝶呤(BH4)的生物合成

BH4的分子式為C9H15N5O3,其在體內的合成有從頭合成和補救合成兩種途徑。生理情況下，BH4系從頭合成（denovosynthesis）,I型三磷酸鳥苷環化水解酶（GTPcyclohydrolaseI,GTPCHI）是合成BH4的限速酶；病理情況下，BH4可通過Salvage通路合成，即在墨蝶呤還原酶的作用下由細胞內的墨蝶呤轉化而來(圖1)。

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1.2四氫生物蝶呤(BH4)合成調節

GTPCHI抑制劑2,4-二氨基-6-羥基嘧啶(DAHP)或墨蝶呤還原酶抑制劑N-乙酰-5-羥色氨酸(NAS)均能阻斷BH4合成,而胰島素等因子可刺激血管內皮細胞GTPCHImRNA表達從而促進BH4合成。GTPCHI是BH4從頭合成途徑的限速酶，控制著細胞內BH4的濃度，其活性受GTPCH反饋調節蛋白（GTPCHfeedbackregulatoryprotein,GFRP）調節。GFRP由Harada等在1993年發現，在功能尚未明確前被稱為P93蛋白，目前，GFRP已經成功地從大鼠肝臟組織中得到純化以及克隆[2],人類GFRP系由84個氨基酸構成的五聚物，分子量為9.5kD。兩分子GFRP可與一分子GTPCHI形成GFRP/GTPCHI復合物，其中GTPCHI的活性即被抑制[3]。用脂多糖處理培養的人骨髓單核細胞瘤細胞,細胞內GFRPmRNA表達下降，GFRP／GTPCHI復合物形成減少,可使GTPCHI活性以及BH4水平明顯增高;與此類似,給大鼠腹腔注射脂多糖,其多種組織包括肝臟、腦、肺和脾臟中GFRPmRNA表達均下調，而GTPCHI活性和BH4水平則明顯增高;用NO供體處理大鼠肝細胞，亦可使GFRPmRNA表達下降,同時,細胞內GTPCHI活性和BH4水平明顯提高。上述研究均表明，GFRP對GTPCHI活性和BH4水平有調節作用。但是，關于血管內皮功能異常時GFPR的表達如何以及與GTPCHI活性和BH4水平變化的關系如何尚未見報道。此外，BH4水平高低也負反饋調節GFPCHI活性，其作用機制在于，BH4可促進GTPCHI與GFRP形成復合物，從而反饋性抑制GTPCHI的活性[2-5]。

1.3四氫生物蝶呤(BH4)的生物學功能

1.3.1作為芳香族氨基酸羥化酶如苯丙氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的必須輔助因子的輔因子:BH4是芳香族氨基酸羥化酶的天然輔因子,BH4在這

GTP環化水解酶1（GCH1）基因與四氫生物蝶呤BH4代謝異常性疾病研究進展

些酶催化反應中起氧化還原作用。芳香族氨基酸羥化酶是幾種神經遞質合成的關鍵酶,因此,BH4的缺乏可引起神經遞質合成障礙。

1.3.2作為NOS的輔因子:BH4還是NOS的輔因子,對NO的合成起調節作用。NOS的催化活性依賴尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、BH4、血紅素鐵原卟啉復合物IX4個輔因子。NOS以同源二聚體形式發揮作用,其中每個亞基包含1個提供電子的碳端還原酶區域(NOSred)和含有催化中心的氮端氧化酶區域(NOSox)。NOSred上結合FAD、FMN和NADPH,主要為血紅素提供電子。NOSox則結合血紅素、BH4和底物L-精氨酸,主要催化L-精氨酸生成NO和L-胍氨酸。這兩個區域通過一個能結合鈣調蛋白(CaM)的片段相連,與CaM結合是結構型NOS(cNOS)發揮活性所必需的,它能控制電子從黃素轉移到血紅素上。BH4在NOS催化反應中的確切作用還不清楚,目前僅確定BH4有穩定NOS活性二聚體結構、增加底物L-精氨酸與酶親和力的作用[6]。有人提出BH4的作用類似于在芳香族氨基酸羥化酶反應中的氧化還原作用,但至今沒有直接證據證明。

2.四氫生物蝶呤(BH4)代謝異常及其相關疾病

2.1BH4減少

2.1.1多巴反應性肌張力障礙

多巴反應性肌張力障礙(dopa-responsivedystonia,DRD)是原發性肌張力障礙的一種特殊類型,又稱為伴顯著晝間波動的遺傳性進行性肌張力障礙(hereditaryprogressivedystoniawithmarkeddiurnalfluctuation,HPD)或Segawa病，是一種常染色體顯性遺傳的姿勢性肌張力障礙，其臨床特征是癥狀在晝間明顯波動，且對左旋多巴有明顯而持久的療效。其發病與黑質多巴胺神經元軸突末端酪氨酸羥化酶活性下降有關；通過基因組搜索法，HPD的致病基因定位于14號染色體，候選基因法證實本病由位于14號染色體14q22.1-22.2的GCH1基因的異常，導致四氫生物喋呤（BH4）合成不足，而后者是酪氨酸羥化酶必需的輔助因子，BH4的不足必然影響酪氨酸羥化酶活性，導致多巴胺合成障礙，從而出現肌張力的異常。[7]

2.1.2高苯丙氨酸血癥

高苯丙氨酸血癥(hyperphenylalaninemia,HPA)中最常見的是由苯丙氨酸羥化酶缺乏引起的苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU),由于PKU可以治療,新生兒HPA的篩查在我國已逐步普及,許多PKU患者得到及早的診治,智力發育接近正常。值得注意的是少數HPA是由四氫生物蝶呤(BH4)缺乏引起的,由于BH4缺乏型HPA的治療不同于PKU,預后比較差。BH4缺乏型HPA是一種極少見的常染色體隱性遺傳代謝病。其特點是血苯丙氨酸(Phe)增高及進行性神經系統癥狀,即使用低Phe飲食將血Phe控制在正常范圍仍無法改善癥狀。這是因為BH4不僅是苯丙氨酸羥化酶的輔因子,BH4缺乏損害3種芳香族氨基酸羥化反應而導致腦內神經遞質左旋多巴和5-羥色胺的生成減少。除造成HPA外,還影響到腦細胞中髓鞘蛋白的合成,造成神經介質的減少。[8]

2.1.3高血壓

在高血壓病人中發現其前臂血管對內皮依賴性血管舒張劑(如Ach)的反應性降低,相同實驗條件下,不依賴內皮的擴血管藥物(如硝普鈉)卻能獲得降壓效果,說明高血壓患者血管內皮功能受損。[9]有證據表明在自發性高血壓大鼠(SHR)及高血壓病人中,其血管內皮產生NO的酶途徑受損。Kerr等發現SHR動脈中盡管eNOS表達增加,但由于其功能的改變,內皮中OH2生成增多,NO的生物利用度仍降低。造成eNOS功能改變的原因是由于BH4的氧化,對P47phox(NADPH氧化酶的一種重要組分)缺陷型小鼠的研究發現,BH4氧化減少,OH2的生成減少,說明高血壓中NADPH氧化酶是氧化BH4的主要酶。應用BH4缺乏小鼠模型(高苯丙氨酸突變鼠,hph21)作的研究顯示,eNOS活性降低,收縮壓升高,提示BH4不足所致的eNOS功能異常在血壓調節中的重要性。[10]

2.1.4高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化

研究發現高膽固醇血癥病人冠狀動脈內皮舒血管功能受損,以NO生物活性降低為特征。高膽固醇血癥中所存在的內皮功能損傷是動脈粥樣硬化發展的起始事件,形成動脈硬化后,內皮損傷進一步加劇。在家兔實驗中,藥物抑制eNOS,減少內源性NO的形成可加速動脈硬化的進程,因此保持血管內NO生物活性是抑制動脈硬化發展的一種治療策略,如上調eNOS表達或提高NO活性。但在動脈硬化模型中,eNOS過表達卻非但不能抑制動脈硬化的發展反而促進其損害。在脂蛋白E(apoE)缺陷小鼠中,用轉基因技術使eNOS過表達,與單純apoE缺陷小鼠作比較,發現雖然前者eNOS表達和NO生成均高于后者,但其產生的NO相對于eNOS表達量來說要低的多,而內皮中OH2生成卻大量增加,說明在apoE缺陷模型中eNOS功能發生了改變,給予BH4后,OH2生成減少,NO產量明顯增加,動脈損傷面積大大縮小。另外,新近研究在apoE模型中使用轉基因技術使(GTPCHⅠ)過表達,以增加BH4的生物合成,也可以提高內皮源性血管舒張功能,并能減少動脈硬化斑的形成。所以BH4對于改善eNOS功能,提高NO活性有著積極作用,不失為一種防治動脈硬化的新方法。另外BH4還可調節血小板內NO含量,在狗的冠狀動脈綜合征實驗模型中發現血小板內BH4明顯降低,P2選擇素表達增加,外源性給予BH4后,可增加血小板內BH4水平,降低P2選擇素表達,由此說明BH4還具有抑制冠狀動脈血栓形成的作用。

2.1.5糖尿病

糖尿病伴發血管疾病者甚多,近來研究發現這與糖尿病患者機體中內皮功能異常有密切關系,糖尿病實驗動物模型及病人中均證明存在著內皮依賴性血管舒張功能減弱現象,其顯著特點是內皮源性NO活性降低,NO生物活性降低的機制包括氧化應激和BH4代謝異常。實驗證明糖尿病病人血管內皮中OH2產生增多,可大量滅活NO,增多的OH2除NADPH氧化酶這一主要來源外,還來源于功能異常的eNOS。給予墨蝶呤及用L2NMMA均可減少OH2的產生。另外,胰島素可影響BH4的代謝，胰島素抵抗狀態時,機體內皮細胞中GTPCHI活性降低,該酶活性的降低勢必要影響BH4的合成。在鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠中,血管氧化應激增加,致使BH4大量被氧化,形成BH2和蝶呤,內皮細胞內氧自由基產生增加,NO介導的內皮依賴性血管舒張功能下降。利用轉基因技術使糖尿病大鼠模型中GTPCHI過表達,可明顯減少內皮細胞產生的自由基,并使BH4的量維持正常。[11]有研究證明,生物喂飼的糖尿病大鼠模型中,內皮細胞產生NO能力降低,糖尿病大鼠內皮中BH4的量僅是正常大鼠內皮的12%,用墨蝶呤增加細胞內BH4水平,可增加NO的合成。因此,BH4對防GTP環化水解酶1（GCH1）基因與四氫生物蝶呤BH4代謝異常性疾病研究進展

止糖尿病血管并發癥具有有益作用。

2.2BH4增多

2.2.1GCH1基因和BH4與疼痛的敏感性和持續性有關[12]：哈佛醫學院教授CliffordWoolf研究小組發現了調控神經遞質合成水平來控制動物對疼痛感受的途徑。研究者還發現人體基因的差別與疼痛低敏感性和手術后快速恢復密切相關。這種影響疼痛感的基因即GCH1基因，編碼GTP環化水解酶，GTP是生成BH-4(四氫生物蝶呤)的一種必需的輔助酶。研究人員首先對坐骨神經損傷中基因表達中發生重大變化的基因進行分析，并確定出GCH1，GCH1編碼的GTP環化水解酶是合成BH4所需要的第一個酶同時也是關鍵酶，這個研究首次證實GCH1基因和BH4在感覺疼痛中也具有重要的作用。[13]研究人員在幾種疼痛動物模型中測定了GCH1和BH4的活動，他們發現出現神經痛的大鼠中，其GCH1基因和BH4的活性明顯升高。研究者在神經疼痛和炎癥疼痛的動物模型中注射GCH1活性抑制劑DAHP，證實能夠減輕動物對疼痛的敏感性，相反，給模型注射BH4能明顯增加對疼痛的敏感性。而另一組研究人員在人類中觀察GCH1基因的變化，并且發現GCH1基因的一個特殊突變可預防手術后的慢性疼痛。在被分析的志愿者中，大約有28%的人群基因中有一個突變基因的拷貝，而GCH1基因兩個拷貝都發生突變的患者出現手術后疼痛的可能性最小。[14]但是，最新的研究發現，由于人群的分層現象，在歐洲人群中做GCH1基因、BH4和疼痛關聯性的分析并不具有統計學意義[15],這個結論有待進一步研究。

3.展望

近年來,越來越多的研究表明,GCH1基因(即指導合成GTPCHI的基因)在BH4的合成及代謝作用中起重要作用，GCH1基因的缺陷以及突變將影響BH4的生物合成從而引起生物體內一系列的生理病理現象。因此,可以利用基因來預防以及治療某些與BH4代謝異常有關的疾病