青枯菌病害的研究論文

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摘要：細菌性青枯病危害多種作物,抗病育種是病害防治最為可行的途徑,DNA分子標記研究是深化作物青枯病抗性遺傳改良的重要方面。生防研究近幾年也取得了較大的進展，本文著重從這兩個方面對青枯病的研究做一綜述。

關鍵詞：青枯菌生化變種致病機理分子標記

青枯病是一種由青枯菌(Ralstoniadolaanacearum)引起的毀滅性土傳病害，發(fā)病植物莖葉萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴重的植物病害之一，至今尚沒有有效的化學農藥和其他防治辦法。因此青枯病被稱為植物的“癌癥”。植物青枯菌R..dolaanacearum可侵染40多個科200多種植物,僅次于農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。是番茄、馬鈴薯、花生、甘薯、煙草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些貴重藥材和花卉植物許多植物生產的重要限制因素,世界各地均有分布。青枯病菌是一個復雜的群體，有明顯的生理分化，不同地區(qū)和不同寄主來源的菌株，在寄主范圍、致病力、生化型、血清型等細菌學特性上差異很大，因此增加了對此病害防治研究的難度。近幾年來許多科研工作者從不同的角度不同方法對青枯菌進行了多方面的研究。

1青枯菌菌系的組成

青枯菌生理生化復雜，各國的科學家都對其進行了種以下的分類或分型的各種嘗試。有兩個亞分類系統(tǒng)已被國際所公認。一是按不同來源菌株對不同植物種類的致病性差異，將青枯菌劃分為不同的生理小種（Race）。60年代已命名4個小種：小種1號（可侵染茄科植物和其他科植物），小種2號（只侵染香蕉、大蕉和Heliconia），小種3號（只侵染馬鈴薯，偶爾侵染番茄和茄子），小種4號（只對姜致病力很強）。另一個亞分類系統(tǒng)是根據不同菌株對三種雙糖（麥芽糖、乳糖、和纖維二糖）和三種乙醇（甘露醇、山梨醇和衛(wèi)矛醇）氧化產酸能力的差異將青枯菌化分為4個生化變種：生化變種1（不能氧化3種雙糖和3種乙醇），生化變種2（只能氧化3種雙糖，不能氧化3種乙醇），生化變種3（能氧化3種雙糖和3三種乙醇），生化變種4（只能氧化3種乙醇，不能氧化3種雙糖）。生理小種和生化變種的關系是這樣的：生理小種1號中包含生化變種1、3和4。生理小種2號中包含生化變種1和3。生理小種3號中包含生化變種2。生理小種4號中包含生化變種4。但是，從桑樹分離的一些菌株與以往確定菌系種力不同，其對幾種代表行茄科植物的致病力很弱或不致病，而且它們具有氧化3種雙糖和甘露醇的能力，因而鑒定為一種新菌系，命名為小種5號和生化變種5號。[1]國內現在只發(fā)現小種1號和小種3號。小種1號是我國長江流域及其以南地區(qū)的優(yōu)勢菌系，小種3號是危害我國馬鈴薯的優(yōu)勢菌系，對我國的馬鈴薯生產產生重大的威脅。對大量青枯菌的檢測結果表明，青枯菌存在菌細單抗特異性，但目前還不能根據這種單抗特異性對青枯菌菌系間進行實質性的親緣關系的亞分類和分群模式。[2]

2青枯菌的致病機理

研究證明，青枯菌通常可從植物根部或莖部的傷口侵入，引起發(fā)病。但在天然條件下，也能從沒有受傷的次生根的根冠部位侵入。植物生長時在次生根的根冠和主根的表皮間形成鞘，青枯菌能穿過這層鞘，侵入皮層細胞間隙生長，破壞細胞間中膠層，使細胞壁分離，變形，形成空腔，繼而侵染，木質部薄壁組織使導管附近的小細胞受刺激形成侵填體，并移入侵填體，侵填體破裂后繼被釋放進入導管，并在導管內大量繁殖和快速傳播擴張，從而引起植株萎蔫死亡。植物病害生理研究證明：青枯菌在導管中生長時可產生大量的胞外多糖，其影響和阻礙植物體內的水分運輸特別是容易對葉柄結和小葉處較小孔徑導管穿孔板造成堵塞。因而引起植株枯萎;同時，青枯菌還可以分泌于細胞外多種細胞壁降解酶（如果膠酶類和纖維素酶類）其可能也在破壞導管組織。青枯菌在人工培養(yǎng)時還能分泌一些生長調節(jié)物質如IAA，CTK和Eth等但現有資料表明它們在植物體內的產量有限。對植物死亡方面的作用尚不清楚，而且研究也少。國外的研究大量集中在胞外多糖，果糖酶和纖維素酶在致病過程中的作用。美國威斯康星大學Sequeira實驗室（1991）報道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇epsA-D或ops-A-D。佐治亞大學Denny實驗室克隆出了控制胞外多糖等表型轉變的基因phcA。后證明是復合調節(jié)網絡（Complexregulatorynetworks,CRN）控制胞外多糖的產量，控制對某些環(huán)境或信號的反應還可控制其他致病因素。黃勇和Sequeira報道了從青枯菌株K60(小種1號,生化變種1)分離到hrp基因簇，目前，還未能從寄主植物上找到跟hrp相對應的抗病基因。[3]馬慶生等克隆出了青枯菌對花生的專化性基因。[4]最近又有報道已經克隆出了青枯菌的抗病基因。3青枯病抗性的分子標記

3．1茄科蔬菜的青枯病抗性

茄科植物受青枯病危害最重,涉及的作物種類最多,從世界范圍內的寄主植物看,有關青枯病研究工作開展最多的也是茄科植物,尤其以番茄和馬鈴薯青枯病的研究最為普遍,其次為煙草。但是茄科蔬菜類及馬鈴薯作物等目前發(fā)現的青枯病抗性種質較少而且抗性水平不高,抗性表現受環(huán)境影響較大,抗病品種選育受到限制,是國內外面對的一大難題。在番茄中至今沒有發(fā)現顯性寡基因控制的青枯病抗性,已有抗性種質的抗性多表現為數量遺傳特性,抗性位點多造成了抗性遺傳的復雜性。[5]

3.1.1番茄的青枯病抗性分子標記

目前關于植物青枯病抗性分子標記的報道主要是對番茄的研究。盡管番茄栽培品種之間的DNA多態(tài)性不高,但番茄具備良好的遺傳系統(tǒng),易于操作[6]。在番茄的青枯病抗性研究中,既發(fā)現了廣譜性位點,也發(fā)現了對某些菌系具有專化性的抗性位點。Danesh等研究認為在番茄第6、7、10染色體上存在與青枯病抗性相關的數量性狀位點[7]。亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心(AVRDC)Wang等研究證實了Hawaii7996(番茄中廣泛應用的抗源)在第6條染色體上的抗性標記,并發(fā)現在第3和第8條染色體上存在抗性位點,還發(fā)現了一個未定位的RAPD標記K4a[8]。Yui等研究獲得了Hawaii7996青枯病抗性的4個RAPD標記,在99個F2植株中鑒定出32株具有全部4個RAPD標記,其中2個標記(RA12-12450和RA12-291600)被認為與抗性主效基因連鎖[9]。Mangin等研究認為在番茄第6條染色體上至少有2個獨立的位點與青枯病抗性有關[10]。

3.2花生青枯病抗性種質研究

花生在青枯菌寄主植物的抗性遺傳多樣性中有特殊地位。到2000年,世界范圍內鑒定出高抗青枯病的花生地方品種超過120個,二倍體野生花生中也發(fā)現了20多份抗青枯病材料,這是其它茄科植物不可比擬的,就數量而言,花生屬植物抗性種質的遺傳豐富性居青枯菌寄主植物首位。自20世紀初印度尼西亞首次發(fā)現抗青枯病花生種質以來,歷經近100年,這些最早發(fā)現的抗病材料仍然具有很高的抗性(群體存活率)。與茄科作物相比,花生的青枯病抗性水平不僅更高,而且穩(wěn)定性更強[11]。

3.2.1花生青枯病抗性遺傳及DNA標

3.2.2記研究

據現有研究結果,花生青枯病抗性在遺傳上受寡基因控制,如珍珠豆型花生的抗性受2對主效基因控制。育種實踐表明,花生青枯病抗性容易在品種間轉移,也易于從二倍體野生種轉移到四倍體栽培種中,如河南省農科院和中國農科院油料所均從二倍體野生花生轉移獲得了抗青枯病品系。廖伯壽等研究證明花生對青枯菌潛伏侵染反應特性存在遺傳分化[11,12]。從2000年起,中國與國際半干旱研究所合作開展了花生青枯病抗性的分子標記及輔助選擇技術研究,發(fā)現了不同花生抗病基因型間的AFLP和SSR多態(tài)性,建立了青枯病抗性的重組近交系(RI)群體,將用于繪制遺傳連鎖圖譜和基因定位。花生青枯病抗性遺傳基礎較為簡單,為分子標記的建立乃至基因的克隆提供了可行性。

3.2.3花生青枯病抗性的利用潛力

由于花生在對青枯病的抗性水平、穩(wěn)定性和抗性遺傳基礎上的特殊性,研究和分離抗性基因對于其它作物青枯病抗性改良具有重要的潛在作用,1997年在法國召開的第二屆國際植物青枯病大會(IBWS)對此提出了倡議。通過研究建立花生青枯病抗性的分子標記,可以明確抗性基因位點,估計抗性基因作用、遺傳特性及環(huán)境影響,最終克隆和分離抗性基因,對于深化花生乃至其它作物的青枯病抗性育種具有重要的理論和實用意義。國際花生青枯病工作網(GBWWG)正利用多邊合作關系開展工作,以期在花生和其它植物青枯病抗性改良上取得突破。

4青枯菌生防菌的研究

4．1青枯生防菌Bacillussp

青枯生防菌Bacillussp。B130菌株是姜瘟靈的主要有效成分，它對包括青枯菌在內的多種植物病原真菌和細菌有明顯的拮抗作用．B130能在PH5～8之間較快地生長，以PH6時菌體生長狀況為最佳，抑菌活性亦最強．培養(yǎng)初期抑菌活性隨培養(yǎng)時間而增長，但36h后呈下降趨勢。對蛋白粗提液等的研究表明，B130的抑菌物質成分復雜，但主要活性部分是蛋白和多肽類物質．[13]．2青枯病生防菌ANTI－8098A

福建農科院研究員劉波博士主持的《農作物青枯病生防菌ANTI－8098A的研究與應用》項目經過8年努力，篩選獲得了具有自主知識產權的植物青枯病生防菌株ANTI－8098A，經德國菌種保存中心鑒定為蠟狀芽孢桿菌。在完成菌株的生物學特性研究的基礎上，項目組自行設計并完成了生防菌劑中試規(guī)模的網絡監(jiān)控生物反應系統(tǒng)，建立了菌劑生物測定的標準化方法，成功研制出生防菌的存活基質、菌劑生產工藝和保質技術，解決了菌劑田間定殖難題。經科學測定，ANTI－8098A青枯病生防菌劑幾年來在福建不同地區(qū)的茄科作物上推廣面積達5.6萬畝次，對番茄、茄子、辣椒、花生、煙草、生姜等作物青枯病田間防效高達75％－85％，與普通化學農藥相比，價格低，效果好，不造成藥害，不污染環(huán)境，農藥殘留不超標，經濟、生態(tài)和社會效益良好。專家認為，這項研究首次發(fā)現了ANTI－8098A對青枯菌的致弱現象，即將青枯雷爾氏菌強致病力菌株轉化為無致病力菌株，從而抑制病害。項目組對致弱機理進行了探索性研究，建立了PCR電泳、紫外分光、液相色譜、異源吸附蛋白、TTC培養(yǎng)基測定、寄主植物回接等致弱作用的檢測方法，為植物青枯病生物防治機理研究提供了新思路。[14]

4．3eep(exportofextracellularproteins)突變體

4．3.1eep缺失突變體的致病力

通過Tn5誘變技術，分離了植物青枯病菌生理小種1號、3號的胞外蛋白輸出功能喪失突變體。由于Tn5在其基因組單一的eep位點的插入，突變體失去了向培養(yǎng)液分泌產生胞外酶和胞外蛋白質的能力。用堿性磷酸酯酶基因PhoA作為報導基因，研究這些胞外蛋白穿越突變體細胞內膜，結果表明，[16]這些胞外蛋白質可以穿過其內膜，但失去了穿越其外膜的能力。胞外多糖在植物體內和體外的產生沒有受到eep基因位點突變的影響。該突變體失去了對番茄植株的致萎能力。

4．3.2eep突變體防治番茄青枯病的研究

室溫內，采用土壤接種的方法將野生型青枯菌AW和PO41接種于競爭其滅菌的土壤內（AW、PO41菌懸液3×108細菌/ml）。同時采用浸苗法，分別把突變株AD4、AP7和熒光假單胞菌菌株JF1接種番茄幼苗。結果表明在接種初期，菌株AD4、AP7和JF1都有防治番茄青枯病的能力，但在接種20天后，只有eep突變體AD4具有生防效果。[15]

不同菌株室溫內防治番茄青枯病結果（病株率%）

菌株移栽后天數

510152030

AD4AP7JF1CK000301530207520658010020357080100100100100

在田間，AD4對番茄青枯病的防治效果不如室溫明顯，但在接種后的1個月內仍有一定的防治效果，隨著時間的延長，效果下降。AD4同以往各類青枯菌的不同點，在于它在失去對寄主的致病力后仍具有較好的寄主親和力。這為生物防治提供了很好的微生物資源。

5展望

相對于其它許多植物病害而言,植物青枯病抗性的DNA分子標記研究較少,除番茄之外,其它作物處于起步階段。由于眾多茄科作物中發(fā)現的高抗種質很少,發(fā)掘新的基因和實現不同抗性位點的聚合是提高抗性水平的重要方面。花生抗青枯病資源豐富,抗性的遺傳行為較為簡單,抗性DNA分子標記的建立必將推動花生及其它作物抗性育種的進步。我國具有微生物的資源優(yōu)勢，利用細菌病毒防治植物青枯病害有著美好的前景，隨著生物技術的進一步應用，一批利用遺傳工程改造的高效生防菌逐一問世，這將大大推動對植物青枯病害的研究轉

不久的將來，植物青枯病將不再是植物生長的“克星”。

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