高溫聯合輻射影響胚胎神經發育探討論文

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【關鍵詞】高溫；輻射；孕鼠胚胎；神經發育；腦熱應激蛋白質【摘要】目的探討高溫聯合輻射致胚胎神經發育與早期胚胎腦蛋白質和HSPs表達的關系。方法將130只孕鼠按隨機抽簽分為13組，每組10只。在鼠妊娠第8d，第9d分別接受60Co及γ-射線全身照射各1次,照射劑量1.0Gy；第10d各置溫箱中,分別使其肛溫保持在37±0.5℃，41±0.5℃，42±0.5℃,并持續3，4，5min。移出溫箱2h后，每組每時段隨機取5只脫頸法處死，采用Westerndotblot和lowry方法定量分析胚胎腦HSP70和蛋白質含量與胚胎神經系統畸形。結果高溫聯合輻射對胚胎神經毒性明顯增加，并與高溫強度及作用時間呈正相關；高溫聯合輻射作用于胚胎早期對胚胎腦蛋白質降低有復合作用（P＜0.01），并可誘導腦HSP70合成。結論高溫與輻射聯合致神經發育與胚胎腦蛋白質合成及熱應激蛋白的誘導有一定的相關性。【關鍵詞】高溫；輻射；孕鼠胚胎；神經發育；腦熱應激蛋白質Effectsofhyperthermiacombinedwithradiationonembryonicnervousdevelopmentandheatshockproteinofbrain【Abstract】ObjectiveToexploretherelationbetweentheembryonicnervousdevelopmentinducedbyhyperthermiacombinedwithradiationandearlyembryonicbrainproteinsorHSPs''''expression.Methods130pregnantmicewererandomlydividedinto13groups(eachn=13).Onthe8thand9thdayofpregnance,themicereceivedonetimeofgeneralirradiationof60Coandγrayrespectively,thedosageofirradiationwas1.0Gy;onthe10thday,themicewereputinhotboxeskeepingtheirrectaltemperatureat37±0.5℃,41±0.5℃and42±℃0.5℃persistingfor3,4and5mins,respectively.Aftertwohoursofthemiceleaveingwarmingboxes,5micerandomlyselectedfromeachgrouppertimesectionwereexecutedbycervicalvertebraluxation.TheHSP70ofembryonicbrain,proteincontentanddeformationsofembryonicnervoussystemswerequantitativelyanalyzedwiththeWesterndotblotandLowrymethod.ResultsThetoxicityofhyperthermiacombinedwithirradiationtoembryosmarkedlyincreasedandwaspositivelyrelatedtohyperthermiaintensityandduration;hyperthermiawithirradiationhadcompoundactiononreducementofembryonicbrainproteinsinearlyembryo(P<0.01)andinducedthesynthesisofbrainHSP70.ConclusionTherewascertainrelativityofnervousdevelopmentinducedbyhyperthermiacombinedwithirradiationandsynthesisofembryonicbrainproteinsorinductionofHSP70.【Keywords】Hyperthermia;radiation;embryoofpregnantmice;nervousdevelopment;theHSPs胚胎、組織器官和細胞對各種異常生理環境做出應答反應的主要產物之一是熱休克蛋白基因編碼的熱應激蛋白(heatshockprotein,HSPs)合成增多,HSPs和腦蛋白質含量變化能準確反映腦分化和腦損傷程度，文獻報道多為單一的高熱或電離輻射可能對胚胎和神經系統發育產生效應。本研究試圖探討高溫與輻射聯合對胚胎神經系統畸形的影響，為人類的優生優育提供科學依據。1材料與方法1.1實驗對象選取由河南省實驗動物中心繁育提供的健康未生育的SD雌性大鼠(體重190～210g)和雄性大鼠(225～275g)為實驗對象。1.2妊娠確定動情期雌雄鼠按2:1合籠過夜，次日晨檢查雌鼠，以發現陰栓為妊娠依據，并定為懷孕第0d。確定入組孕鼠130只。1.3分組與處理將130只孕鼠按隨機抽簽分成13組，每組10只。于妊娠第8，9d分別接受60Co及γ-射線全身照射各1次，劑量1.0Gy；第10d每組各置溫箱中,分別使其肛溫保持37±0.5℃，41±0.5℃，42±0.5℃,并持續3，4，5min。孕鼠移出溫箱2h后，每組隨機取5只，脫頸法處死，取出胎鼠，取全腦組織制備勻漿［1］，測量HSP70和蛋白質；18d后每組隨機取5只，脫頸法處死，消毒后剖腹，解剖鏡下依次剝離蛻膜、Reicherts膜、卵黃膜和羊膜，然后將分離的胚胎置于光鏡下觀察胚胎神經系統畸形狀況。1.4腦蛋白質與HSP70檢測1.4.1腦蛋白質檢測取勻漿上清液5μL按Lowry氏法［2］測定總蛋白含量。1.4.2HSP70檢測以Westerndotbot方法［3］，用已知HSP70300mg・L-1配成100mg・L-1、50mg・L-1、25mg・L-1、12.5mg・L-1、6.25mg・L-1參照系列，與樣品同步點樣于同一個定量型硝酸纖維素濾膜（浙江省黃巖市四清生化材料廠產）上，制成免疫印漬膜。用兔抗人HSP70單克隆抗體及辣根過氧化物酶二氨基聯苯胺法顯色，終止反應后迅速照相和掃描（CS930掃描儀，460nm波長），根據參照系列HSP70濃度的光密度計算每毫克腦組織蛋白HSP70含量(μg・mg.prot)。1.5統計方法所有數據運用SPSS11.0統計軟件包處理,以均數±標準差(±s)表示,組間各時斷數據采用t檢驗。2結果2.1高溫聯合輻射對孕鼠胚胎神經系統發育的影響，見表1。表1高溫、輻射對孕鼠胚胎神經系統的影響（略）注：*與37℃溫度組比較P<0.01；**與單獨高溫組比較P<0.01表2高溫與輻射對鼠妊娠胚胎腦蛋白質及HSP70的影響（略）注：*與單獨高溫組比較P<0.01表1顯示，在鼠妊娠第8，9d，高溫聯合輻射對胚胎神經系統毒性明顯增加，并與高溫強度及作用時間呈正相關，神經管未閉、體位異常、腦形態異常因子差異有極顯著性（P<0.01）。2.2高溫與輻射對鼠妊娠胚胎腦蛋白質及HSP70含量的影響，見表2。表2顯示，鼠妊娠在高溫及高溫聯合輻射可導致胎腦蛋白質含量下降,誘導HSP70大量合成；42℃組與37℃組比較誘導HSP70合成差異有極顯著性（P＜0.01)；高溫聯合輻射組胎腦蛋白質含量下降有明顯變化,并與溫度呈正相關,差異有極顯著性（P＜0.01)。3討論高溫在自然環境與勞動環境中頻繁出現，某些疾病也常伴有發熱，而隨著放射性元素在醫學和工業生產中的應用以及核能事業的發展，懷孕早期的婦女在工作、生活以及疾病等情況下經常會暴露于高溫、輻射，或兩者復合作用之下，處于分化中的神經器官對致畸因子最敏感。流行病學調查推測，高溫可能是引起人類神經系統畸形的重要環境因素。發育中的大腦對輻射具有特殊的敏感性，正常的大腦發育中大量地存在程序化細胞死亡，其可被電離輻射加速或改變［4］。據文獻報道［5，6］熱處理孕8.5～10.5d的大鼠畸胎發生率明顯高于熱處理＜8.5d或＞10.5d的大鼠的畸胎發生率。本研究顯示，在鼠妊娠第8，9d，高溫聯合輻射對胚胎神經毒性明顯增加，并與高溫強度及作用時間呈正相關，神經管未閉、體位異常、腦形態異常因子差異有極顯著性（P<0.01）。提示胚胎神經系統發育對高溫與輻射聯合的敏感性提高。大腦是體內最復雜，對環境最敏感的器官，其神經元不能再生，腦蛋白質含量的變化能及時反映細胞數量及細胞分化和功能情況，同時HSP70的合成與早期胚胎大腦的生長發育和異常的發生存在著內在聯系［7］，測量胎腦蛋白質及HSP70的變化是了解環境因素對早期胚胎大腦損傷程度的有效手段。本研究表明，鼠妊娠在高溫及高溫聯合輻射可導致胎腦蛋白質含量下降,誘導HSP70大量合成；42℃高溫組與37℃組比較HSP70的合成有明顯差異，說明高溫對大腦有一定刺激，誘導合成HSP70對腦[1][2]細胞進行保護；42℃高溫(＞3min)聯合輻射與37℃組比較，二項指標均有顯著差異，與單獨42℃比較蛋白質含量明顯下降，誘導HSP70合成并無明顯增加，提示輻射聯合高溫42℃(＞3min)對胎腦蛋白質降低有復合作用，胎腦HSP70的合成水平沒有明顯變化。輻射可以誘導胎腦HSP70表達，但其誘導作用不如高溫明顯，高溫聯合輻射并不能增加單獨高溫或單獨輻射作用下誘導HSP70合成水平。表明應激達到一定強度后，增加刺激并不能提高胎腦HSP70的合成水平，與文獻報道［5，6］結果相一致。提示上述因素影響胎腦蛋白質合成而引起腦細胞損傷嚴重，一方面誘導HSP70合成，同時又因結構破壞使合成受抑制，HSP70對細胞保護程度不夠而導致中樞神經系統發育不良，機體表現為神經系統發育異常。胎腦蛋白質含量的下降和誘導HSP70的合成的變化規律與高溫變化，持續時間，輻射及二因素聯合所致神經發育結果基本一致，在胚胎發育過程外界環境因素引起的胎腦抗損傷與損傷受相關基因協調，如果協調出軌，HSP70對胚胎細胞保護強度不夠，導致胚胎中樞神經系統細胞發育異常，機體表現為神經系統發育異常。參考文獻［1］蘆春林，KimmeCAKmelGL,等.高溫致胚胎發育毒性機理的研究［J］.北京醫科大學學報，1993，25(6)：435［2］SunXQ,LIJS,WuXY.Theexpressofheatshockprotein70inratbrainafterGZexposure［J］.JGravitphysio，2002，9(1)：23［3］FisherBR,BrownNT,Heredia,DJ.etal.Occipotalencepaloceleandearlygestationalhyperthemia［J］.Teratology，1995，52：90［4］高衛民，周湘艷.出生前氚水照射對仔代大鼠生長發育及神經行為的影響［J］.中華放射醫學與防護雜志，1998，18（6）：381［5］NoveyL，ScharrfKD.Heatstressproteinsandtranscriptionfactorscell［J］.Mol.Lifesci，1997，53：80［6］ChenH,LiuZ,ZhouZ,JiangM,QianL,WuS.Theregulatoryeffectofmemantineonexpressionandsynthesisofheatshockprotein70geneinneonatalratmodelswithcerebralhypoxicischemia［J］.ChinMedJ.2003，116(1)：558［7］MirkesPE.Hypothermiaandtheinductionofneuraltubedefectsinmices［J］.Teratology，1994，4